نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک، تهران، ایران
2 موسسه سیستم های کشاورزی و جنگلداری مدیترانه
3 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک
4 پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران
چکیده
زیتون (Olea europaea L.) یکی از مهمترین گونه های باغی در حوزه مدیترانه است که روش تکثیر آن از طریق قلمه می-باشد. ریشهزایی قلمهها یکی از فرآیندهای اساسی در ازدیاد گیاه زیتون است. توانایی ریشهزایی در قلمه گیاهان و ارقام مختلف بطور معنیداری با یکدیگر متفاوت است. از طرفی ژنهای متعددی در این فرآیند نقش دارند. یکی از این ژنها OeAOX2 میباشد که در تعادل انواع اکسیژن واکنشی نقش اصلی را بر عهده دارد و به عنوان ژن کاندید در القای ریشهزایی در جمعیت زیتون ایتالیایی حاصل از تلاقی ژنوتیپهای لچینو و دلچه آگوجا معرفی شده است. در این مطالعه، توانایی ریشهزایی در قلمههای 99 ژنوتیپ زیتون ایران از استانهای مختلف بررسی شد و ژنوتیپها با توانایی ریشهزایی بالا و پایین تعیین شدند. سپس بررسی طول کامل ژن OeAOX2 در دو ژنوتیپ زیتون ایران، دالاهو (ریشهزایی بالا) و اوزینه (ریشهزایی پایین) به ترتیب از استانهای کرمانشاه و گلستان، انجام شد. همچنین، توالی این ژن در 20 ژنوتیپ زیتون ایران با ریشهزایی بالا و پایین در ناحیه 5’ UTR و اگزون شماره 1 نیز بررسی گردید. بررسیهای بیوانفورماتیکی طول کامل ژن OeAOX2 در دالاهو و اوزینه نشان داد که چندشکلیهای زیادی در نواحی اینترون وجود دارد ولی در سطح اگزونها تنها یک چندشکلی مشاهده شد. از سوی دیگر، بررسی چند شکلیهای این ژن در 20 ژنوتیپ دیگر زیتون ایران مشخص نمود که این چند شکلیها منجر به تغییر اسیدهای آمینهها نمیشود و احتمالا ژن OeAOX2 در سطح ترانسکریپتوم و تفاوت بیان، القای ریشهزایی را می تواند تحت تاثیر قرار دهد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Study on the structure of OeAOX2 gene related to rooting among native olive genotypes (Olea europea L.) of Iran
نویسندگان [English]
1 NIGEB, Tehran, Iran
2 CNR
3 NIGEB
4 NIGEB
چکیده [English]
Olive (Olea europaea L.) is one of the most important fruit crops throughout the Mediterranean Basin, mainly propagated by cuttings. One of the fundamental processes in woody plant propagation, especially olive is rooting ability of cuttings. Rooting ability in various plants and ecotypes is different significantly. Also, many genes are affecting rooting ability process in plants. One of these is OeAOX2 gene which plays a central role in the balance of reactive oxygen species in plants. OeAOX2 as a candidate gene has been introduced and it induces rooting in an Italian olive population (Cross progenies of Leccino and Dolce Agogia). In this project, rooting ability of 99 semi-hard cutting of Iranian olive genotypes was studied from different provinces of Iran, so genotypes with high- and low-rooting ability were determined. Then, the full length of OeAOX2 gene was evaluated in two Iranian olive genotypes such as Dalahoo (high rooting) and Uzineh (low rooting) from Kermanshah and Golestan provinces, respectively. Also, the sequence of this gene was studied in 20 Iranian olive genotypes with high and low rooting in 5’UTR and exon 1 region. Bioinformatics studies of the OeAOX2 gene indicated that there are many polymorphisms in the introns, but only one polymorphism was observed in the exon levels. On the other hand, polymorphism of the OeAOX2 gene in 20 Iranian olive genotypes did not lead to protein alteration and probably it influenced rooting induction in transcript level.
کلیدواژهها [English]
مطالعه ساختار ژن OeAOX2 مرتبط با ریشهزایی در بین ژنوتیپهای زیتون
(Olea europea L.) بومی ایران
وحیده هدایتی1، امیر موسوی1*، ثریا موسوی2، زهرا هاشمآبادی1 و سید مهدی حسینی مزینانی1
1تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیستفناوری (NIGEB)
2ایتالیا، پروجا، انستیتو علوم زیستی و منابع طبیعی (IBBR-CNR)
تاریخ دریافت: 30/10/96 تاریخ پذیرش: 15/8/97
چکیده
زیتون (Olea europaea L.) یکی از مهمترین گونههای باغی در حوزه مدیترانه است که روش تکثیر آن از طریق قلمه میباشد. ریشهزایی قلمهها یکی از فرایندهای اساسی در ازدیاد گیاه زیتون است. توانایی ریشهزایی در قلمه گیاهان و ارقام مختلف بطور معنیداری با یکدیگر متفاوت است. از طرفی ژنهای متعددی در این فرایند نقش دارند. یکی از این ژنها OeAOX2 میباشد که در تعادل انواع اکسیژن واکنشی نقش اصلی را بر عهده دارد و بهعنوان ژن کاندید در القای ریشهزایی در جمعیت زیتون ایتالیایی حاصل از تلاقی ژنوتیپهای لچینو و دلچه آگوجا معرفی شده است. دراین مطالعه، توانایی ریشهزایی در قلمههای 99 ژنوتیپ زیتون ایران از استانهای مختلف بررسی شد و ژنوتیپها با توانایی ریشهزایی بالا و پایین تعیین شدند. سپس بررسی طول کامل ژن OeAOX2 در دو ژنوتیپ زیتون ایران، دالاهو (ریشهزایی بالا) و اوزینه (ریشهزایی پایین) به ترتیب از استانهای کرمانشاه و گلستان، انجام شد. همچنین، توالی این ژن در 20 ژنوتیپ زیتون ایران با ریشهزایی بالا و پایین در ناحیه 5’ UTR و اگزون شماره 1 نیز بررسی گردید. بررسیهای بیوانفورماتیکی طول کامل ژن OeAOX2 در دالاهو و اوزینه نشان داد که چندشکلیهای زیادی در نواحی اینترون وجود دارد ولی در سطح اگزونها تنها یک چندشکلی مشاهده شد. از سوی دیگر، بررسی چند شکلیهای این ژن در 20 ژنوتیپ دیگر زیتون ایران مشخص نمود که این چند شکلیها منجر به تغییر اسیدهای آمینهها نمیشود و احتمالاً ژن OeAOX2 در سطح ترانسکریپتوم و تفاوت بیان، القای ریشهزایی را میتواند تحت تأثیر قرار دهد.
واژههای کلیدی: ژنوتیپهای زیتون ایران، توان ریشهزایی، چندشکلی، ژن OeAOX2
* نویسنده مسئول، تلفن: 44787305-021، پست الکترونیکی: m-amir@nigeb.ac.ir
مقدمه
زیتون (Olea europaea L.) درختی همیشه سبز از تیره Oleaceae و از قدیمیترین گیاهان منطقه مدیترانه و ایران است. این گیاه دیپلوئید (2n=46)، هتروزیگوت و تکپایه است. ازدیاد زیتون به دو روش جنسی و غیرجنسی میباشد که روش ازدیاد غیرجنسی از طریق قلمه ارزانتر و سریعتر از روشهای دیگر میباشد. شایان ذکر است که با روش ازدیاد غیرجنسی میتوان پایههای مطلوب و امیدبخش را با حفظ خصوصیات ژنتیکی گیاهپایه، در مدتزمان کوتاهتری تکثیر نمود. تولید ریشه از بخشهایی نظیر ساقه یا قلمه ازنظر مولکولی فرایندی بسیار پیچیده است که بصورت طبیعی در گیاه رخ میدهد. بنابراین، شناسایی عوامل کنترلکنندهی تولید ریشه اعم از عوامل فیزیولوژیکی، مورفولوژیکی و مولکولی گام مهمی در فرایند ازدیاد زیتون محسوب میشود. شناسایی ژنهای مؤثر در ریشهزایی قلمههای زیتون بهمنظور افزایش توان ریشهزایی ارقام و ژنوتیپ های بومی زیتون ایرانی از اهمیت ویژهای برخوردار است. هدایتی و همکاران در سال 2015 برای اولین بار ژن اکسیداز تناوبی 2 زیتون (OeAOX2) را کاندید مناسبی جهت غربالگری زیتونهای با توان ریشهزایی متفاوت در جمعیت زیتون ایتالیایی معرفی نمودند. این ژن از زنجیرهی تنفسی در UQ مشتق شده و بدون انتقال پروتون، اکسید شدن UQH2 را کاتالیز کرده و اکسیژن (O2) را به آب احیا میکند و بیان آن در قلمههای زیتون با ریشهزایی بالا در جمعیت زیتون ایتالیایی مورد مطالعه افزایش مییابد (9). در تحقیق حاضر برای اولین بار، صفات مرتبط با ریشهزایی در 99 ژنوتیپ زیتون ایرانی ثبت گردید و بر آن اساس ژنوتیپهای با ریشه زایی بالا (93 تا 100 درصد ریشهزایی) و ژنوتیپهای با ریشهزایی پایین (6 تا 31 درصد ریشهزایی) مشخص شدند. سپس توالی کامل ژن OeAOX2با طول حدود 4000 جفت بازدر ژنوتیپهای دالاهو با 94 درصد ریشهزایی از استان کرمانشاه و اوزینه با 31 درصد ریشهزایی از استان گلستان همسانه سازی و بررسی شد. از سوی دیگر، منطقه 5’UTR و اگزون 1 در 21 ژنوتیپ دیگر با ریشهزایی بالا و پایین نیز جهت یافتن چندشکلی مرتبط با القای ریشهزایی مورد مطالعه قرارگرفت.
مواد و روشها
مواد گیاهی: دراین تحقیق از 99 ژنوتیپ زیتون ایران از استانهای گلستان، کرمانشاه، گیلان، زنجان، خراسان جنوبی، لرستان، خوزستان، کهگیلویه، بوشهر، یزد، ایلام و فارس، موجود در کلکسیون زیتون ایران واقع در استان گلستان، استفاده شد (14و 15). قلمهگیری از بخش بالای کانوپی و شاخههای یکساله صورت گرفت. هر قلمه حاوی 4 گره (Node) و 4 برگ رأسی بود. حداقل 20 قلمه از هر ژنوتیپ، تهیه شد و از هورمون IBA (Indole-3- Butyric Acid) با غلظت ppm 2000 بهمنظور ریشهدار شدن استفاده گردید. قلمهها در گلخانه میست با رطوبت بالاتر از 90 درصد و دمای بستر 23 درجه سانتیگراد و دمای محیط 18 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. بعد از دو ماه، صفات ریشهزایی ازجمله تعداد قلمههای ریشهدار شده، درصد ریشهزایی، طول و تعداد ریشهها اندازهگیری شدند و ژنوتیپهای زیتون با ریشهزایی بالا و پایین از یکدیگر تفکیک گردیدند.
همسانهسازی ژن OeAOX2 در 22 ژنوتیپ زیتون بومی ایران: بهمنظور توالی یابی طول کامل ژن OeAOX2 در ژنوتیپهای منتخب ایرانی، از نواحی مختلف آن نظیر انتهای '3 و '5 ژن، نواحی داخل اگزون و گاها اینترون، آغازگرهای کاملاً اختصاصی طراحی گردید (جدول 1). از برگهای تازه، نمونهها DNA استخراج شد و کیفیت DNA با دستگاه اسپکتروفوتومتر نانودراپ C2000 (Thermo Scientific) تأیید گردید، سپس حدود 30-20 نانوگرم از DNAها جهت انجام واکنش PCR استفاده شد و با استفاده از آغازگرهای طراحیشده از ژن OeAOX2 بهینهسازی آزمون PCR صورت گرفت. واکنش PCR در حجم µl20 شامل 20 تا 30 نانوگرم از DNA، µl2 از بافر 10X، µl1 از MgCl2 (50mM)، آغازگرها 10 pmol به مقدار µl1 و آنزیم Taq به مقدار µl2/0 و با شرایط C◦94 به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه با C◦94، 25 ثانیه، C◦58، 25 ثانیه و C◦72، 2 دقیقه و تکثیر نهایی C◦72 به مدت 10 دقیقه انجام شد و محصولات PCR بر روی ژل آگارز 1 درصد مشاهده گردید.
سپس قطعات تکثیر شده وارد ناقل پلاسمیدی pTG19-T (Sinaclone) شدند. واکنش اتصال شامل، DNA ناقل (25 ng/µl) µl1، بافر اتصال (10X) µl1، محصول PCR µl5 و آنزیم T4 DNA Ligase µl1 در حجم µl10، بود و به مدت 1 ساعت در 22 درجه سانتیگراد و سپس به مدت یک شبانه روز در دمای 16 درجه سانتیگراد قرارگرفت. محصول آزمایش اتصال وارد سویهیDH5α E. coli شد و باکتریها بر روی محیط LB/Amp/IPTG/X-GAL کشت شدند. جهت تأیید مجدد کلونیهای رشد کرده در محیط کشت، واکنش Colony PCR انجام شد و محصول PCR بر روی ژل آگارز 1 درصد مشاهده گردید. از هر ژنوتیپ دو کلون حاوی قطعه ژن مورد نظر برای توالییابی ارسال گردید. بهمنظور توالییابی ژن OeAOX2 از آغازگرهای متفاوت و همپوشان، استفاده گردید (جدول 1). از سوی دیگر از آغازگرهای 5’UTR-For و Intron 1-Rev جهت تکثیر اگزون 1 و ناحیه 5’UTR در 21 ژنوتیپ استفاده و محصول PCR مستقیماً توالی یابی شد.
جدول 1- فهرست آغازگرهای مورد استفاده جهت همسانهسازی ژن OeAOX2
نام آغازگر |
توالی نوکلئوتیدی آغازگرها (5'->3') |
OeAOX2-5´ UTR-For2 |
GTTTTTCACCGGGCGTAGTA |
OeAOX2-exon 1-For |
GGCGAGATCTCTGATGAAGC |
OeAOX2-intron 1-Rev |
TGTGGATCGAGCTCACAGAG |
OeAOX2-exon 2-Rer |
CTGGAAAAATATATCTGTTGGAATT |
OeAOX2-intron 2-For |
TCAATTTATGTTGCATATCTTAACCAG |
OeAOX2-exon 3-Rev |
CTCGATGGTGGGCTTCAT |
OeAOX2-3´UTR-Rev |
TGTATAACAAAACCGGGACCA |
بررسی بیوانفورماتیکی ژن OeAOX2 در ژنوتیپهای زیتون ایرانی:نتایج توالییابیهای مرتبط با یک کلونی با استفاده از نرمافزار BioEdit مورد بررسی قرارگرفت و با ساختن قطعات Contig طول کامل ژن در هر کلونی بدست آمد. سپس توالیهای کامل ژن OeAOX2 از ژنوتیپهای دالاهو (از استان کرمانشاه) و اوزینه (از استان گلستان)با 4 آلل ثبت شده از این ژن در دو والد زیتون ایتالیایی در بانک اطلاعاتی NCBI، همردیف و مقایسه شد. از سوی دیگر توالی پروتئینی OeAOX2 در ژنوتیپهای دالاهو و اوزینه از طریق ExPASy translate tool (http://web.expasy.org/translate/) بدست آمد. سپس این توالی پروتئینی با توالی پروتئینی حاصل از این ژن در ژنوتیپهای زیتون ایتالیایی مقایسه گردید. از سوی دیگر، ناحیه 5’UTR و اگزون اول ژن OeAOX2در 21 ژنوتیپ زیتون ایرانی شامل 14 ژنوتیپ با ریشهزایی بالا و 6 ژنوتیپ با ریشهزایی پایین (جدول 2) تکثیر و توالییابی شد و با ژنوتیپهای دالاهو و اوزینه مقایسه شدند. چندشکلیهای مشاهدهشده در اگزون شماره 1 ژن با تبدیل به اسیدآمینه و پروتئین نیز بررسی شدند.
نتایج و بحث
نمودار میزان ریشهزایی برای 99 ژنوتیپ زیتون بومی ایران بر مبنای ثبت صفات ریشهزایی (9) ترسیم شد (شکل 1). سپس ژنوتیپهای دالاهو (استان کرمانشاه)، ماوی 2 (استان خوزستان)، مینودشت 2 و قاضانقایه 6 (استان گلستان)، ده سفید 8 (استان کرمانشاه)، ملکشاهی سیاب درویش و چونان 1- چوار (استان ایلام)، طبس (استان یزد) و دراک (استان فارس) بعنوان ژنوتیپهای با توان ریشهزایی بالا و ژنوتیپهای اوزینه، لیوان و آزادشهر 6 (استان گلستان)، سپید دشت (استان لرستان)، دلی بایار 1 (استان کهگیلویه) و وارک (استان فارس) بعنوان ژنوتیپهای با توان ریشهزایی پایین انتخاب شدند (جدول 2). ژن اکسیداز تناوبی(AOX) در گیاهان، خانوادهی چند ژنی هستهای کوچکی هستند که در تک لپهایها فقط AOX1 و در دولپهایها AOX1 و AOX2 وجود دارد (10 و 19). البته ژنهای ارتولوگ AOX در گونههای مختلف به صورت متفاوتی به تنشهای زیستی و غیرزیستی پاسخ میدهند (11، 12، 13 و 17) تاکنون مطالعات بیانی در مورد ژنهای AOX در گیاهان تکلپهای (6، 7، 21 و 23) و دولپهای علفی نظیر آرابیدوپسیس (7 و 23)، سویا (6)، یونجه (4)، هویج (3)، ذرت (18)، کاساوا (24) و خیار (20) انجام شده است. درحالی که در درختان گزارشات محدودی در این زمینه وجود دارد (22و 5). برای اولین بار هدایتی و همکاران (2015) ژن OeAOX2 را بهعنوان ژن کاندید و مؤثر در القای ریشهزایی زیتون معرفی کردند (8)، این ژن با طول حدود 4000 جفت باز دارای چهار اگزون و سه اینترون میباشد (شکل 2). همچنین نوگالس و همکاران در سال 2015 به دلیل چندشکلی زیاد در این ژن، آن را بعنوان یک نشانگر مولکولی جهت برنامههای اصلاحی در هویج معرفی نمودند (16).
جدول 2- ژنوتیپهای زیتون ایران با ریشهزایی بالا و پایین
شماره |
ژنوتیپهای زیتون ایران |
استان |
درصد ریشهزایی(%) |
ریشهزایی بالا/پایین |
1 |
سپید دشت |
لرستان |
32 |
ریشهزایی پایین |
2 |
دلی بایار 1 |
کهگیلویه |
15 |
ریشهزایی پایین |
3 |
وارک |
فارس |
24 |
ریشهزایی پایین |
4 |
لیوان |
گلستان |
29 |
ریشهزایی پایین |
5 |
اوزینه 5 |
گلستان |
31 |
ریشهزایی پایین |
6 |
آزادشهر 5 |
گلستان |
9 |
ریشهزایی پایین |
7 |
نگین |
گلستان |
6 |
ریشهزایی پایین |
8 |
گرگان |
گلستان |
24 |
ریشهزایی پایین |
9 |
ماوی 2 |
خوزستان |
100 |
ریشهزایی بالا |
10 |
مینودشت 2 |
گلستان |
100 |
ریشهزایی بالا |
11 |
قاضانقایه 6 |
گلستان |
100 |
ریشهزایی بالا |
12 |
ده سفید 8 |
کرمانشاه |
93 |
ریشهزایی بالا |
13 |
دالاهو |
کرمانشاه |
94 |
ریشهزایی بالا |
14 |
طبس |
یزد |
97 |
ریشهزایی بالا |
15 |
ملکشاهی-سیابدرویش |
ایلام |
95 |
ریشهزایی بالا |
16 |
چونان 1-چوار |
ایلام |
96 |
ریشهزایی بالا |
17 |
دراک |
فارس |
96 |
ریشهزایی بالا |
18 |
قزل |
گلستان |
100 |
ریشهزایی بالا |
19 |
T8 |
گلستان |
98 |
ریشهزایی بالا |
20 |
یاقوت |
گلستان |
93 |
ریشهزایی بالا |
21 |
خوشه |
گلستان |
98 |
ریشهزایی بالا |
22 |
پارسه |
گلستان |
92 |
ریشهزایی بالا |
23 |
T23 |
گلستان |
97 |
ریشهزایی بالا |
شکل 2- طول کامل ژن OeAOX2(شامل 4 اگزون و 3 اینترون)
همچنین آنها نشان دادند که ژن OeAOX2 در زیتونهای ایتالیایی لچینو و دلچه آگوجا هتروزیگوت است و تفرق حاصل از تلاقی آللهای این دو والد، منجر به بروز نتایج با ریشهدهی متفاوت میشود. بهمنظور یافتن ارتباط بین ژن مذکور و ریشهزایی در ژنوتیپهای زیتون ایران، جداسازی و توالییابی طول کامل ژن OeAOX2 از دو ژنوتیپ دالاهو (با توان ریشهزایی بالا) و اوزینه (با توان ریشه زایی پایین) انجام شد (شکل 3) و از ترکیب آغازگرهای مختلف برای تأیید قطعه مربوط براساس جدول 3 استفاده گردید.
4000bp |
1500 bp |
3000 bp |
2000 bp |
M 1 2 3 4 5 6 7 8 |
شکل 3- الکتروفورز محصول PCR انجام شده از مسیرهای 1 و 5 (M1)، 2 و 6 (M2)، 3 و 7 (M3)، 4 و 8 (M4)؛ همچنین مسیرهای 1 تا 4 DNAی اوزینه و مسیرهای 5 تا 8 DNAی دالاهو میباشد. مسیر M مربوط به نشانگر وزن مولکولی Ladder Mix (Fermentas) است و مسیرهای M1-4 در جدول 3 توصیف شدهاند.
جدول 3- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده جهت تکثیر ژن OeAOX2
طول محصول تکثیر یافته |
دمای اتصال |
جفت آغازگرهای اختصاصی (OeAOX2) |
نام Master تهیه شده |
bp 3808 |
˚C60 |
3´-UTR-Rev و 5´-UTR-For2 |
M1 |
bp 2572 |
˚C60 |
Exon 3-Rev2 و exon 1-For |
M2 |
bp 2580 |
˚C60 |
3´-UTR-Rev و intron 2-For |
M3 |
bp 1605 |
˚C60 |
exon 3-Revو intron 2-For |
M4 |
بررسیهای بیوانفورماتیکی طول کامل ژن OeAOX2 در ژنوتیپهای دالاهو و اوزینه مشخص نمود که چهار چندشکلی در اگزون 1 و چهار چندشکلی در اینترونها و حذف 3 نوکلئوتید در اینترون دوم اوزینه وجود دارد. مقایسه ژن مذکور در ژنوتیپهای دالاهو و اوزینه با 4 آلل گزارش شده از آن در ارقام زیتون ایتالیایی (8) در بانک اطلاعاتی NCBI مشخص نمود که چندشکلیهای موجود در ناحیه 5’UTR ژن OeAOX2 در ارقام زیتون ایتالیایی، در ژنوتیپهای ایرانی وجود ندارد ولی حذف شدگی 58 جفت بازی ناحیه اینترون دوم در هر دو ژنوتیپ ایرانی مشاهده شد در حالی که این حذفشدگی در همین ناحیه تنها در آلل شماره 2 رقم لچینو وجود داشت. از سوی دیگر به دلیل مشاهده چندشکلی در اگزون 1 ژن OeAOX2 در دالاهو و اوزینه، این ناحیه به همراه 5’UTR در 21 ژنوتیپ دیگر زیتون ایران با ریشهزایی بالا و پایین نیز بررسی شد. مطالعات نشان داد که سه چندشکلی در ناحیه 5’UTR در موقعیتهای 45، 60 و 112 جفت بازی و 4 چندشکلی در موقعیتهای 183، 216، 318 و377 در اگزون شماره یک وجود دارد ولی تفاوت معنیداری بین ژنوتیپهای با توان ریشهزایی بالا و پایین یافت نشد. در بعضی از ژنوتیپهای با توان ریشهزایی بالا و پایین، جفتبازهای هتروزیگوت هم مشاهده شد (جدول 4) ولی چندشکلیهای موجود در اگزون 1، اسیدآمینه را در سطح پروتئین تغییر نداد و فقط تغییر نوکلئوتید در باز 377 (T بجای A) در ژنوتیپهای دراک و مینودشت 6، اسیدآمینه والین را جایگزین گلوتامیک اسید نمود. در اکثر ژنوتیپها نوکلئوتید آدنین در موقعیت 377 مشاهده شد، در حالی که در ژنوتیپهای لیوان با 29 درصد ریشهزایی، قازانقایه 6، ملکشاهی-سیاب درویش و T18 به ترتیب با 100%، 6/94% و 6/91% ریشهزایی در این موقعیت نوکلئوتید A یا T قرارداشت.
جدول 4- چند شکلیهای مشاهده شده در ناحیه 5’UTR و اگزون شماره 1 در ژن OeAOX2 در 23 ژنوتیپ زیتون ایران
|
Rooting% |
5' UTR |
Exon 1 |
Protein |
||||||||
|
|
45 bp |
60 bp |
112 bp |
183 bp |
216 bp |
318 bp |
377 bp |
23 |
34 |
68 |
88 |
سپید دشت |
31.4 |
C |
A |
A |
G |
G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
دلی بایار 1 |
14.5 |
C |
A |
A |
G |
G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
وارک |
23.5 |
C |
A |
A |
G |
G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
لیوان |
29 |
T |
A/C |
A |
G |
G |
G |
A/T |
M |
R |
S |
E/V |
اوزینه 5 |
31 |
T |
A |
A |
G |
A |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
آزادشهر 5 |
8.9 |
T |
A |
A |
G |
G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
نگین |
6 |
T |
A |
A/C |
G |
G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
گرگان |
24.2 |
T |
A |
A |
G |
A |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
ماوی 2 |
98.8 |
T |
A |
A |
G |
A |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
مینودشت 2 |
100 |
T |
C |
A |
G |
G |
G |
T |
M |
R |
S |
V |
قازانقایه 6 |
100 |
T |
A/C |
A |
G |
G |
G |
T/A |
M |
R |
S |
E/V |
ده سفید 8 |
91.3 |
T |
A |
A |
G |
A/G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
دالاهو |
93.8 |
T |
A |
A |
G |
G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
طبس |
97.2 |
T |
A |
A |
G |
G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
ملکشاهی-سیابدرویش |
94.6 |
T |
A/C |
A |
G |
G |
G |
T/A |
M |
R |
S |
E/V |
چونان1-چوار |
96 |
T |
A |
A |
G |
A/G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
دراک |
96.3 |
T |
A |
A |
G |
A/G |
G |
T |
M |
R |
S |
V |
T7 |
100 |
T |
A |
A/C |
A/G |
A/G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
T8 |
97.5 |
T |
A |
A/C |
A/G |
A/G |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
یاقوت |
93 |
T |
A |
A |
G |
A |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
خوشه |
97.8 |
T |
A |
A |
G |
A |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
پارسه |
91.6 |
T |
A/C |
A |
A/G |
G |
G/T |
T/A |
M |
R |
x |
E/V |
T23 |
97.2 |
T |
A |
A |
G |
A |
G |
A |
M |
R |
S |
E |
نظر به اینکه بررسی توالی پروتئین OeAOX2 نیز نشان داد که تغییری در سطوح اسیدآمینهایی در ژنوتیپهای دالاهو و اوزینه نیز رخ نداده است، بنابراین استنتاج میگردد که ژن OeAOX2 در سطح توالی ژنومی و پروتئینی بین 23 ژنوتیپ زیتون ایران با ریشهزایی بالا و پایین تفاوت معنیداری ندارد و به احتمال قوی اثرات این ژن بر روی ریشهزایی در مرحله بیانی یا ترانسکریپتوم، تغییرات پس از رونویسی یا ترجمه میباشد. شایان ذکر است در مطالعات قبلی نیز تفاوت بیانی این ژن در مراحل مختلف ریشهزایی بین ارقام زیتون ایتالیایی با ریشهزایی بالا و پایین مشهود بوده است (8). لذا برای اثبات این فرضیه، بررسی کمی سطوح بیان این ژن در ژنوتیپهای زیتون ایران با ریشهزایی بالا و پایین میتواند راهکار مناسبی جهت اطمینان از نقش اصلی این ژن در فرایند ریشهزایی محسوب گردد، هرچند تأثیر عوامل محیطی، تنشها و سایر فاکتورهای فیزیکی قلمه را نیز در طی این فرایند همواره باید مدنظر قرارداد (1و 2).
سپاسگزاری
این پروژه با حمایت مالی مرکز مطالعات و همکاریهای بینالمللی وزارت عتف و پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیستفناوری انجام شده است. همچنین از حمایت مالی شرکت زیتون گلستان نمونه برای جمعآوری قلمههای زیتون و در اختیار گزاردن امکانات گلخانه میست سپاسگزاری میشود.