شناسایی ترکیب­های تشکیل دهنده اسانس، بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی و میزان فنل و فلاونوئید اندام­های مختلف Postia puberula در مرحله بعد از گلدهی

پروانه همتی حسن گاویار¹، حمزه امیری^1* و نظام آرمند²

¹ ایران، خرم آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

² ایران، بهبهان، دانشگاه صنعتی خاتم الانبیا (ص)، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 22/02/1399          تاریخ پذیرش: 27/03/1399

چکیده

در این مطالعه ترکیبات تشکیل دهنده اسانس، قدرت آنتی اکسیدانی و میزان فنل و فلاونوئید عصاره متانولی برگ، ساقه و میوه Postia puberula در مرحله بعد از گلدهی مورد بررسی قرارگرفت. شناسایی ترکیب‌های تشکیل دهنده اسانس با استفاده از دستگاه گاز کروماتوگراف متصل به طیف سنج جرمی صورت گرفت، بررسی اثرات آنتی اکسیدانی با دو روش 2و2 دی فنیل 1-پیکریل هیدرازیل و بتاکاروتن- لینولئیک اسید صورت گرفت. جهت بررسی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی بترتیب از شاهدهای گالیک اسید و کوئرسیتین استفاده شد، نتایج نشان داد که کادینول (30/13%)، هگزیل بنزوآت (01/12%) و کاریوفیلن اکساید (96/11%) فراوان ترین ترکیبات موجود در اسانس برگ هستند و سیس3- هگزیل بنزوآت (07/7%)، دلتا کادینول (71/5%) و هگزادکانوئیک اسید (75/5%) ترکیبات شاخص موجود در اسانس ساقه و نوسیفرول (98/8%)، بنزیل بنزوآت (39/7%) و هگزیل بنزوآت (55/6%) مهم­ترین ترکیبات موجود در اسانس میوه هستند. در هر دو روش DPPH و بتاکاروتن- لینولئیک اسید، برگ قدرت آنتی اکسیدانی بالاتری در مقایسه با دیگر اندام‌ها داشت. همچنین نتایج نشان داد که برگ میزان فنل و فلاونوئید بیشتری در مقایسه با سایر اندام‌ها دارد.

واژه های کلیدی: DPPH، بتاکاروتن- لینولئیک اسید، کادینول، کاریوفیلن اکساید

* نویسنده مسئول، تلفن: 33120611- 066، پست الکترونیکی: amiri_h_lu@yahoo.com

مقدمه

استفاده از ترکیبات دارویی با منشأ گیاهی از زمان‌های بسیار دور مورد توجه بشر بوده است. یکی از دلایل مهم تمایل جوامع پزشکی به استفاده از ترکیبات گیاهی عوارض جانبی پایین آن­ها نسبت به داروهای شیمیایی است (4). اسانس‌ها را می‌توان با روش تقطیر از اندام‌های مختلف از قبیل برگ، ساقه، گل و ریشه گیاهان جدا کرد. اسانس در سراسر جهان برای سالیان کاربرد دارویی داشته است.(22). اسانس‌ها ترکیبات روغنی و معطری هستند که از اندام‌های مختلف گیاهان دارویی و معطر به دست آمده و به طور گسترده‌ایی به عنوان طعم دهنده غذا مورد استفاده قرار می‍گیرند )2). از این مواد برای جلوگیری از رشد باکتری­ها و کپک‌‌‌‌‌‌‌های آلوده کننده مواد غذایی به منظور افزایش عمر نگهداری غذاهای فرآوری شده در سیستم غذایی و نیز افزایش عمر نگهداری میوه‌ها و سبزی‌ها استفاده می‌شود )2). اسانس‌ها می‌توانند به عنوان یک جایگزین مناسب برای مدیریت آفات استفاده شوند (11). براساس مطالعات قبلی سزکوئی ترپن کاریوفیلن اکساید یکی از مهم‌ترین ترکیبات تشکیل دهنده اسانس گیاه P. puberula است که خاصیت ضد قارچی و باکتریایی دارد (15).

آنتی اکسیدان‌های سنتزی مانند BHT و BHA در طی فرآوری مواد مورد استفاده قرار می­گیرند اما در سال‌های اخیر گزارش‌هایی مبنی بر وجود عوارض جانبی در آن‌ها ارائه گردیده است، بنابراین محققان توجه خود را بر آنتی اکسیدان‌های طبیعی متمرکز ساخته‌اند. در سراسر جهان گیاه درمانی به طور گسترده‌ای مورد استفاده قرار گرفته است و اعتقاد برا ین است که گیاهان دارویی با اثرات شیمیایی بالقوه منبع مهمی برای جایگزینی معرف‌های شیمیایی هستند. یکی از این کاربردهای بالقوه، استفاده از ترکیبات گیاهی به عنوان عامل آنتی اکسیدانی است. بدیهی است که آنتی اکسیدان‌ها ممکن است در مقابله با سرطان و سایر بیماری‌های مرتبط با جهش مفید باشند (23). اکسیداسیون لیپیدها یکی از دلایل اصلی تضعیف کیفیت عذاها است و باعث از بین رفتن عطر وطعم غذا و کاهش ارزش مواد غذایی موجود در آن‌ها می‌شود (9 و 26). روش‌های متعددی برای کنترل میزان اکسیداسیون چربی‌ها در غذاها وجود دارد. اما یکی از بهترین روش‌ها اضافه کردن آنتی اکسیدان‌ها است، آنتی اکسیدان‎ها گروهی از افزودنی‌های مواد غذایی هستند که بدون هیچ گونه تأثیر مضر برطعم یا خاصیت مواد غذایی باعث افزایش طول عمر مواد غذایی می‌شوند (20 و 24). آنتی اکسیدان‌ها می‌توانند به حفظ سلامت انسان در برابر آسیب‌های ناشی از گونه‌های فعال اکسیژن کمک کنند، بنابراین از این جهت مورد توجه متخصصان زیست شناسی و پزشکان هستند (13و 21). آنتی اکسیدان‌ها برای استفاده در سیستم غذایی باید ارزان و غیرسمی باشند و در غلظت­های پایین اثر کنند (15و 24).

گیاهان خانواده آستراسه در سرتا سر جهان پراکنده شده‌اند و بیشتر در مناطق خشک و نیمه خشک با دمای پایین گسترش دارند (21). جنس پستیا متعلق به خانواده آستراسه دارای دو گونه است که انحصاری ایران هستند.
P. puberula گیاهی بوته‌ای است و زیستگاه آن جنوب و جنوب غرب ایران است (5).

احمد دستگردی و همکاران در سال 2017 نشان دادند که اسانس برگAchillea millefolium subsp. Millefolium  غنی از بورنئول (51/16%)، 1و 8 سینئول (80/9%) و بتاپینن (37/8%) است، و بورنئول (32/12%)، 1و 8 سینئول (51/10%) و بتاپینن (33/9 %) را به عنوان ترکیبات اصلی اسانس گل این گیاه معرفی کردند (7). بررسی های انجام شده روی Centaurea vlachorum Hartvig نشان داد که کاریوفیلن اکساید (9/11%)، اسپازنئول (5/9%) و نرولیدول (8/7%) ترکیبات مهم برگ و کاریوفیلن اکساید (7/26%)، اسپازنئول (7/15%) و ان- هنیکوزان (3/9%) ترکیبات مهم ساقه هستند و کاریوفیلن اکساید (2/18%)، اسپازنئول (6/15%) و 13- اپی مالول اکساید (9/7%) فراوان­ترین ترکیبات موجود در گل این گیاه هستند (16). فعالیت آنتی اکسیدانی مخلوط پلی فنول‌های استخراج شده از عصاره بافت‌های مختلف Artemisia annua L توسط سونگ و همکاران در سال 2015 بررسی شد و نتایج نشان داد که میزان EC₅₀ با روش DPPH در اندام‌های مختلف با هم متفاوت است و میزان آن در گل، برگ، ساقه و ریشه بترتیب 16/915، 98/866، 54/644 و 42/189 میکروگرم بر میلی لیتر گزارش شد (25). فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره اتانولی برگ و ساقه Eriocephalus africanus توسط کاتارینو و همکاران در سال 2018 بررسی شده است، نتایج این بررسی نشان داد که با وجود اینکه هر دو اندام قدرت آنتی اکسیدانی بالایی دارند اما ساقه آنتی اکسیدانی قوی‌تری است، IC₅₀ برگ و ساقه در روش DPPH بترتیب 28 و 17 میکروگرم بر میلی­لیتر گزارش شد. همچنین محتوای فنل ساقه در مقایسه با برگ بیشتر بود و این میزان بترتیب در برگ و ساقه 171و 321 میکروگرم گالیک اسید بر گرم عصاره گزارش شد (12).

از آنجایی که تأثیر نوع اندام بر محتوای متابولیت های ثانویه از جمله ترکیبات تشکیل دهنده اسانس و میزان فنل و فلاونوئید و خواص بیولوژیک مثل فعالیت آنتی اکسیدانی در بسیاری از مطالعات قبلی تأیید شده است و باتوجه با اینکه تاکنون مطالعه‌ای روی اندام‌های مختلف گیاه P. puberula در مرحله بعد از گلدهی انجام نشده است، مطالعه حاضر با هدف بررسی تأثیر نوع اندام (برگ، ساقه و میوه) بر ترکیب­های تشکیل دهنده اسانس، خاصیت آنتی اکسیدانی و میزان فنل و فلاونویید P. puberula در مرحله بعد از گلدهی صورت گرفته است.

مواد و روشها

جمع آوری نمونه: گیاه در مرحله بعد از گلدهی از ارتفاعات اطراف شهر خرم‌آباد استان لرستان جمع آوری گردید، بعد از حذف ضایعات بخش‌های مختلف گیاه (برگ، ساقه و میوه) از هم تفکیک شد و سپس به مدت یک ماه در سایه و در دمای اتاق با تهویه مناسب خشک گردید.

استخراج اسانس: اسانس با روش تقطیر با آب و با استفاده از دستگاه کلونجر (مدل دارونامه بریتانیا) جدا سازی گردید. 50 گرم از هر اندام پاک شده و خشک شده را درون بالن دستگاه کلونجر ریخته و به آن 300 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد، جریان آب سرد مبرد برقرارگردید و بالن درون هیتر برقی دستگاه قرار گرفت، فرایند تقطیر به مدت 3 ساعت در دمای جوش انجام شد. اسانس به دست آمده تا زمان انجام آنالیز در فریزرC°20- نگهداری شد.

شناسایی ترکیب­های تشکیل دهنده اسانس: اسانس گیاه مورد نظر پس از استخراج، به دستگاه گاز کروماتوگراف متصل به طیف سنج جرمی(GC/MS) تزریق شد تا نوع ترکیبات آن مشخص شود دستگاه GC مورداستفاده ازنوع Agilent 6890 ساخت کشور آمریکا با ستون HP-5MS به طول 30 متر، قطر داخلی 25/0 میلی‌متر و ضخامت لایه 25/0 میکرومتر بود .برنامه‌ی دمایی ستون به این نحو تنظیم شد که دمای ابتدایی آون 50 درجه سانتی‌گراد و توقف در این دما به مدت 5 دقیقه با گرادیان حرارتی 3 درجه سانتی‌گراد در هر دقیقه صورت گرفت، سپس افزایش دما تا 240 درجه سانتی‌گراد با سرعت 15درجه سانتی‌گراد در هر دقیقه و پس از آن افزایش دما به 300 درجه سانتی‌گراد با سه دقیقه توقف در این دما (300) صورت گرفت. دما اتاقک تزریق 290 درجه سانتی‌گراد و از گاز هلیم به عنوان گاز حامل با سرعت جریان 8/0 میلی‌لیتر در دقیقه استفاده شد.

طیف سنج جرمی (MS) مورد استفاده مدل Agilent 5973 با ولتاژ یونیزاسیون 70 الکترون ولت، و روش یونیزاسیون EI، دمای منبع یونیزاسیون 220 درجه سانتی‌گراد بود. شناسایی طیف‌ها به کمک شاخص بازداری آن‌ها و مقایسه‌ی آن با شاخص‌های موجود در کتب مرجع و با استفاده از طیف های جرمی ترکیبات استاندارد و استفاده از اطلاعات موجود در کتابخانه‌ی کامپیوتری صورت گرفت (6).

روش استخراج عصاره: 5 گرم از نمونه خرد شده داخل یک کیسه با منافذ ریز ریخته شد. کیسه داخل ظرف شیشه‌ای درب دار قرارگرفت و تا حدی که سطح کیسه کاملاً پوشانده شود روی آن متانول ریخته شد. در پایان کار پس از بستن درب شیشه و پیچاندن فویل دور آن به مکان تاریک انتقال داده شد. پس از سه شبانه روز (72 ساعت) عصاره استخراج شده را صاف نموده و داخل ظرف دیگری ریخته شد و به یخچال C° 4- انتقال یافت، مجدداً به ظرف اولیه حاوی کیسه متانول اضافه شد و در ادامه کلیه مراحل بیان شده تکرار گردید، در مجموع طی 9 شبانه روز، عمل اضافه کردن متانول و صاف کردن عصاره سه بار انجام شد. عصاره‌های مورد نظر با کاغذ صافی صاف شدند، سپس عمل تغلیظ با استفاده از دستگاه روتاریشرکت IKA مدل RV06-ML و پمپ خلأ STEROUAO صورت گرفت.

بررسی فعالیت آنتی­اکسیدانی نمونه­های مورد مطالعه باروش DPPH : در این روش اسپکتروفتومتری، از رادیکال‌های آزاد DPPH به عنوان معرف استفاده می‌شود و فعالیت اتم‌های هیدروژن و الکترون عصاره‌ها از طریق بی‌رنگ شدن محلول بنفش پررنگ  DPPHاندازه‌گیری می‌شود. از عصاره خشک شده هر اندام محلول هایی با پنج غلظت (04/0، 03/0، 02/، 01/0 و 005/0) میلی­گرم بر میلی­لیتر تهیه شد، سپس به منظور بررسی خاصیت آنتی اکسیدانی، محلول004/0% از DPPH تهیه شد (محلول حاصل به رنگ بنفش پررنگ است)، سپس برای هرنمونه سه لوله آزمایش آماده گردید و در هر لوله 50 میکرولیتر از عصاره و یک میلی لیتر محلولDPPH  اضافه شد، در ادامه لوله‌ها به مکان تاریک انتقال یافتند، پس از 30 دقیقه گرمخانه گذاری در دمای اتاق جذب نمونه ها در طول موج 517 نانومتر قرائت گردید. در این روش از BHT به عنوان شاهد مثبت و متانول به عنوان شاهد منفی استفاده شد. با استفاده از فرمول زیر درصد مهار محاسبه گردید.

I%= (A_blank-A_sample/A_blank)

که در این رابطه A_blank جذب واکنش کنترل منفی (دارای تمام معرف‌ها به جز غلظت مشخص از عصاره مورد نظر) است و A_sample جذب نمونه مورد نظر در مخلوط واکنشی است (26). در ادامه با استفاده از نمودار حاصل از میزان I به دست آمده نتایج نهایی به صورت IC₅₀ (بیانگر غلظتی از عصاره است که باعث 50% بازدارندگی فرآیندهای اکسیداتیو می‌گردد) برحسب میکروگرم بر میلی لیتر بیان گردید.

بررسی فعالیت آنتی ‌اکسیدانی نمونه‌های مورد مطالعه باروش بتاکاروتن- ‌لینولئیک اسید: اسیدهای چرب غیراشباع از جمله لینولئیک اسید در برابر روند اکسیداسیون بسیار حساس می باشند، لذا، مهار اکسیداسیون این ماده به عنوان یک روش با ارزش در تعیین فعالیت آنتی ‌اکسیدانی مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این روش فعالیت آنتی اکسیدانی، با میزان مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید و جلوگیری از ایجاد ترکیبات فرار و هیدرو­پراکسیدهای کونژوگه، مورد سنجش قرار می­گیرد. ابتدا یک استوک از محلول بتاکاروتن لینولئیک اسید تهیه شد، بدین صورت که 5/0میلی گرم بتاکاروتن را در 1 میلی لیتر کلروفرم حل نموده، 25 میکرولیتر لینولئیک اسید و 200 میلی گرم توئین 40 به آن اضافه نموده، سپس کلروفرم آن را به طورکامل تبخیر کرده، و در پایان 100میلی لیتر آب مقطر اشباع از اکسیژن همراه با تکان شدید به آن اضافه گردید. از عصاره‌های متانولی اندام‌های محلول‌هایی با غلظت‌های 500 میکروگرم بر میلی لیتر تهیه شد. جهت بررسی خاصیت آنتی‌ اکسیدانی مقدار 50 میکرولیتر از عصاره‌های  P. puberulaبه 2500 میکرولیتر از محلول بتاکاروتن- لینولئیک اسید اضافه گردید. جذب نمونه ها در لحظه صفر و همچنین بعد از دو ساعت انکوبه شدن در دمای 50 درجه سانتی گراد با استفاده از دستگاه میکروپلیت ریدر (Bio Tek, U.S.A) در طول موج 470 نانومتر قرائت گردید و میزان فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره‌ها با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید.

AA% = (1 - DR_S / DR_C) × 100

DR = ln (a / b) × 1 / t

که AA% میزان فعالیت آنتی اکسیدانی برحسب درصد و DR_S و DR_C بترتیب سرعت بی‌رنگ شدن بتاکاروتن در مخلوط واکنشی حاوی نمونه و بدون نمونه است. a جذب نمونه در لحظه صفر و b جذب نمونه بعد از 120 دقیقه است و t برابر 120 دقیقه می‌باشد (18).

سنجش ترکیبات فنلی: به منظور سنجش ترکیبات فنلی از Folin-Ciocaltue به عنوان معرف و از اسید گالیک به عنوان استاندارد استفاده گردید. از عصاره متانولی اندام‌های مختلف محلول‌هایی با غلظت 2میلی گرم میلی لیتر تهیه گردید و از اسید گالیک محلول‌هایی با غلظت‌های مختلف تهیه شد. برای هر محلول سه لوله آزمایش آماده شد و در هرلوله 100 میکرولیتر از عصاره‌ها یا گالیک اسید با 1500 میکرولیتر Folin-Ciocaltue رقیق شده و 1000میکرو‌لیتر آب مقطر مخلوط شد، بعد از یک دقیقه 1500 میکرولیتر محلول سدیم کربنات 20% اضافه کرده، نمونه‌ها به مدت دو ساعت به مکانی تاریک در دمای اتاق منتقل شدند و سپس جذب آن‌ها در طول موج 760 نانومتر با استفاده از دستگاه میکروپلیت ریدر قرائت گردید (8). در نهایت میزان فنل موجود در عصاره‌ها با استفاده از معادله حاصل از نمودار استاندارد، برحسب میکروگرم گالیک اسید بر میلی گرم وزن خشک عصاره گزارش شد.

Absorbance :0.001 Gallic acid (μg) +0.111 (r² = 0.994)

سنجش ترکیبات فلاونوئیدی: جهت اندازه‌گیری ترکیبات فلاونوئیدی از کلرید آلومینیوم به عنوان معرف و از کوئرسیتین به عنوان استاندارد استفاده شد. از عصاره اندام های مختلف محلول‌های متانولی باغلظت 2 میلی‌گرم بر میلی لیتر تهیه گردید، و از کوئرسیتین محلول‌هایی با غلظت­های مختلف تهیه شد سپس برای هر محلول سه لوله آزمایش آماده گردید ودر هر لوله 500 میکرولیتر از عصاره مورد نظر با1500 میکرولیتر متانول، 100 میکرولیتر کلرید آلومینیوم %10، 100 میکرولیتر استات پتاسیم یک مولار و 2800 میکرولیتر آب مقطر مخلوط شد، نمونه‌ها به مدت 40 دقیقه در دمای اتاق قرارگرفتند سپس جذب آن‌ها با استفاده از دستگاه میکروپلیت ریدر در طول موج 420 نانومتر قرائت گردید (17). در نهایت میزان فلاونویید موجود در عصاره‌ها با استفاده از معادله حاصل از نمودار استاندارد، برحسب میکروگرم کوئرسیتین بر میلی گرم وزن خشک عصاره گزارش شد.

Absorbance: 0.0091quercetin (μg) +0.0206 (r² = 0.995)

مطالعات آماری: کلیه آزمایش‌ها به صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد، تعیین سطح معنا دار بودن تفاوت‌ها از طریقه تجزیه واریانس یک‌طرفه در بسته نرم‌ افزاری Mini Tab ، نسخه 16با آزمون Tukey مورد بررسی قرارگرفت. برای رسم نمودارها از نرم­افزارExcel استفاده شد.

نتایج

آنالیز اسانس: نتایج حاصل از آنالیز اسانس در جدول1 آمده است، براساس نتایج حاصل از این جدول، کادینول (30/13%)، هگزیل بنزوآت (01/12%) و کاریوفیلن اکساید (96/11%) فراوان ترین ترکیبات موجود در برگ می­باشند و سیس3- هگزیل بنزوآت (07/7%)، دلتا کادینول (71/5%) و هگزادکانوئیک اسید (75/5%) ترکیبات شاخص موجود در ساقه و نوسیفرول (98/8%)، بنزیل بنزوآت (39/7%) و هگزیل بنزوآت (55/6%) مهم ترین ترکیبات موجود در میوه هستند. در برگ و میوه سهم ترکیبات ترپنوئیدی و در ساقه سهم آروماتیک استرها بیشتر است.

جدول1- ترکیب‌های تشکیل دهنده اسانس برگ، ساقه و میوه Postia puberula

بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی - روش DPPH: نتایج حاصل از مقایسه میانگین‌ها نشان داد که همه داده ها در سطح احتمال 5% تفاوت معنی­داری با یکدیگر دارند. برگ در مقایسه با میوه و ساقه قدرت آنتی اکسیدانی بالاتری دارد و قدرت آنتی اکسیدانی ساقه از بقیه پایین‌تر است (عصاره ساقه > عصاره میوه > عصاره برگ > BHT) (شکل1).

روش بتاکاروتن لینولئیک  اسید:  نتایج  حاصل  از  آنالیز

آماری نشان داد که همه داده‌ها در سطح احتمال 5% تفاوت معنی‌ داری با یکدیگر دارند. برگ قدرت آنتی اکسیدانی بالاتری نسبت به سایر اندام‌ها دارد اما قدرت آن از BHT کم‌تر است. (عصاره میوه>  عصاره ساقه > عصاره برگ> BHT) (شکل2).

بحث و نتیجه گیری

نتایج این  بررسی  سزکوئی‌ترپن  کاریوفیلن  اکساید  را  به

عنوان ترکیب شاخص موجود در اسانس برگ معرفی می‌کند. این ترکیب به علت دارا بودن خاصیت ضد میکروبی و ضد قارچی به عنوان نگهدارنده در مواد غذایی و داروها و لوازم آرایشی استفاده می­شود (10).

شکل1- مقایسه میانگین بازدارندگی از اکسیداسیون (IC₅₀) عصاره اندام‌های مختلف مرحله بعد از گلدهی گیاه Postia puberula و BHT. حروف غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح احتمال 5% می­باشد.

شکل2- مقایسه درصد فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره اندام­های مختلف گیاه Postia puberula و  BHTبا روش بتاکاروتن- لینولئیک اسید در مرحله بعد از گلدهی. حروف غیر مشابه نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح احتمال 5% می­باشد.

سنجش فنل و فلاونوئید: نتایج نشان می‌دهد که میزان فنل در برگ، ساقه و میوه بترتیب 5/196، 186 و 132 میکروگرم گالیک اسید بر میلی‌گرم وزن خشک عصاره است، همچنین میزان فلاونویید در این اندام‌ها بترتیب 30/52، 37/24 و 33/30 میکروگرم کوئرسیتین بر میلی­گرم عصاره است. این نتایج نشان می‌دهد که میزان فنل و فلاونوئید موجود دربرگ بیشتر ازساقه و میوه است. ساقه فنل بیشتری نسبت به میوه دارد اما میزان فلاونوئید آن از میوه کم‌تر است. اندام‌ها در هر دو سنجش در سطح احتمال 5% تفاوت معنی داری با یکدیگر دارند (شکل3).

شکل3- مقایسه میزان فنل و فلاونویید در عصاره اندام­های مختلف گیاه Postia puberula در مرحله بعد ازگل‌دهی. حروف غیرمشابه نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح احتمال 5% می­باشد.

همان طور که در جدول 1 مشاهده می­شود، میوه فاقد این سزکوئی ترپن کاربردی است، بنابراین در بین اندام‌های مختلف، برگ جهت استخراج کاریوفیلن اکساید به منظور استفاده به عنوان نگهدارنده درصنایع غذایی، دارویی و بهداشتی پیشنهاد می‌گردد.

تاکنون هیچ مطالعه‌ای روی ترکیبات تشکیل دهنده اسانس Postia puberula در مرحله بعد از گلدهی صورت نگرفته است.

مطالعات انجام شده روی Postia puberula در مرحله گلدهی توسط Hemmati Hassan Gavyar and Amiri در سال 2019 نشان داد که سیس هگزیل بنزوآت (75/10%)، بنزیل بنزوآت (16/8%) و کاریوفیلن اکساید (12/8%) ترکیبات مهم موجود در برگ هستند و بنزیل بنزوآت (92/21%)، ایی نوسیفرول (58/11%) و دی بوتیل فتالات (08/7%) ترکیبات شاخص ساقه و همچنین بنزیل بنزوآت (99/9%)، کاریوفیلن اکساید (14/8%) و ایی نوسیفرول (13/8%) فراوان‌ترین ترکیبات موجود در گل هستند (15).

نتایج حاصل از مطالعه Hemmati Hassan Gavyar and Amiri در سال 2018 نشان داد که در اسانس گونهPhlomis. lurestanica ، هگزادکان (97/8%)، 2-دودکانال (57/6%) و هپتا دکان (32/6%) ترکیبات شاخص برگ بوده در حالی که آلفا پینن (40/12%)، گاما کادینن (92/10%) و گاما المن (96/6%) مهم‌ترین ترکیبات موجود در ساقه این گیاه هستند (16).

Yagliogluو  Ibrahimدر سال 2015 ترکیبات عمده اسانس برگ گیاه  Centaurea polypodiifolia var. polypodiifolia را ژرماکرین دی (8/28%)، اسپاتونول (7%) و آلفا کادینول (3/6%) و مهم­ترین ترکیبات مهم ساقه را آلفا بیسابولول (9/23%) و ان هگزادکانوئیک اسید (8/10%) ترنس نرولیدول (5/8%) و فراون‌ترین ترکیبات گل را کاریوفیلن اکساید (6/17%)، تتراکوزان (1/14%) و هنی کوژان (1/12%) گزارش کردند (28).

Wannes و همکاران در سال 2010 با بررسی اسانس myrtle (Myrtus communis var. italica L) آلفاپینن (05/58%)، 1و 8 سینئول (67/21%) و بتاپینن (45/6%) رابه عنوان مهم­ترین ترکیبات موجود در برگ، 1و 8 سینئول (48/32%)، آلفا پینن (53/10%)، ایی بتا اّسایمین (48/9%) را اصلی ترین ترکیبات ساقه و آلفا پینن (53/17%)، 1و 8 سینئول (70/12%) ائوژنول (11/10%) و لیمونن (11/10%) را به عنوان ترکیبات عمده گل معرفی کردند (28).

در مطالعه Hemmati Hassan Gavyar and Amiri در سال 2019 نیز دی بوتیل فتالات فقط در ساقه یافت شد (15). گزارشات Yagliogluو  Ibrahimدر خصوص آنالیز اسانس اندام های مختلف گیاه Centaurea polypodiifolia var. polypodiifolia بیان می‌کند که ساقه فاقد ائوزینول و لیمونن است در حالیکه این ترکیب‌ها در سایر اندام‌ها مشاهده می شوند (26)، Wannes و همکاران (2010) نشان دادند که ساقه گیاه myrtle (Myrtus communis var. italica L) فاقد آلفا کادینول و ان هگزادکانوئیک اسید است همچنین در گل این گیاه آلفا بیسابولول مشاهده نشد (28). بررسی‌های انجام شده توسط Hemmati Hassan Gavyar and Amiri در سال 2018 روی Phlomis lurestanica نشان دادکه ترکیبات شاخص تشکیل دهنده برگ و ساقه کاملاً متفاوت هستند (14). به طور کلی علاوه بر عواملی مانند منطقه جغرافیایی، ﭘﺘﺎﻧﺴﻴﻞ ژﻧﺘﻴﻜﻲ و ﻋﻮاﻣﻠﻲ مانند ﺷﺮاﻳﻂ رﺷﺪ، ﻣﺮﺣﻠﻪ نموی، زﻣﺎن ﺑﺮداﺷﺖ که در سایر مطالعات به آن‌ها اشاره شده است (3)، نوع اندام نیز می‌تواند روی ترکیبات عمده تشکیل دهنده اسانس در یک گیاه موثر باشد.

نتایج بررسی فعالیت‌های آنتی اکسیدانی گیاه P. puberula نشان می‌دهد که برگ با روش DPPH و بتاکاروتن - لینولئیک اسید قدرت آنتی اکسیدانی بالاتری نسبت به ساقه و میوه دارد، از آنجایی که میزان فنل و فلاونوئید موجود در این اندام از ساقه و میوه بیشتر است می‌توان نتیجه گرفت که احتمالاً قدرت بالای آنتی اکسیدانی این گیاه مربوط به مقادیر بالاتر ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی آن است. قدرت آنتی اکسیدانی میوه در روش DPPH از ساقه بیشتر است اما ساقه در روش بتاکاروتن –لینولئیک اسید قدرت آنتی اکسیدانی بالاتری دارد، از آنجایی که میوه میزان فنل کم‌تر اما فلاونوئید بیشتری نسبت به ساقه دارد احتمالاً قدرت بالای آنتی اکسیدانی این اندام در روش DPPH مربوط به ترکیبات فلاونوئیدی آن است و حتی می‌توان گفت، هرچند میزان ترکیبات فنلی میوه نسبت به ساقه کم‌تر است اما این فنل‌ها ترکیباتی قطبی با خاصیت آنتی اکسیدانی بالا هستند. ساقه که در روش بتاکاروتن - لینولئیک اسید قدرت آنتی اکسیدانی بالاتری دارد میزان فنل آن نیز نسبت به میوه بیشتر است احتمالاً ترکیبات فنلی مسئول این قدرت بالای آنتی اکسیدانی هستند، البته می‌توان گفت هرچند میزان ترکیبات فلاونوئیدی ساقه از میوه کم‌تر است اما ممکن است این فلاونوئیدها ترکیباتی غیر قطبی­تر با خاصیت آنتی اکسیدانی بالاتر باشند که در مقادیر کم قدرت آنتی اکسیدانی بالایی از خود نشان داه‌اند. تاکنون مطالعه‌ای روی قدرت آنتی اکسیدانی و میزان فنل و فلاونوئید اندام‌های مختلف Postia puberula در مرحله بعد از گلدهی صورت نگرفته است.

مطالعات انجام شده روی Postia puberula در مرحله گلدهی توسط Hemmati Hassan Gavyar and Amiri در سال 2019 نشان داد که میزان IC₅₀  با روش DPPH برگ (28/2204)، ساقه (54/2411) و گل (56/2380) است. همچنین درصد مهار با روش بتاکاروتن - لینولئیک اسید نیز در برگ، ساقه و گل بترتیب (62/64%)، (91/51%) و (95/43%) است. میزان فنل در برگ، گل و ساقه بترتیب 5/130، 84 و 5/120 میکروگرم گالیک اسید بر میلی‌گرم وزن خشک عصاره است. همچنین میزان فلاونوئید در این اندام­ها به ترتیب 59/34، 99/14و 37/24 میکروگرم کوئرسیتین بر میلی‌گرم عصاره است (15)، مقایسه این نتایج با نتایج حاصل از پژوهش حاضر که میزانIC50  با روش DPPH برگ (93/965)، ساقه (59/1536) و گل (05/1270) است، درصد بازدارندگی برگ، ساقه و میوه بترتیب (7/80%)، (32/57%) و (34/44%) است.، میزان فنل برگ، ساقه و میوه بترتیب (5/196)، (186) و (132) میکروگرم گالیک اسید بر میلی­گرم وزن خشک عصاره و میزان فلاونوئید این اندام‌ها نیز بترتیب (30/52)، (37/24) و (33/30) میکروگرم کوئرسیتین بر گرم وزن خشک عصاره است، نشان می‌دهد که قدرت آنتی اکسیدانی، میزان فنل و فلاونوئید در اندام‌های مختلف Postia puberula در مرحله بعد از گلدهی بیشتر از مرحله گلدهی است، این نتایج بیان می‌کند که مرحله نموی می‌تواند یکی از عوامل مهم و اثرگذار بر قدرت آنتی اکسیدانی، میزان فنل و فلاونوئید این گیاه باشد.

Nabavi و همکاران در سال 2010 با بررسی میزان فنل، فلاونوئید و قدرت آنتی اکسیدانی اندام­های مختلف Ferula gummosa Boiss نشان دادند که میزان و قدرت آنتی اکسیدانی (IC₅₀) 906، 789 و 1130میکروگرم بر میلی لیتر بترتیب در گل، ساقه و برگ است و میزان فنل 91/0±08/20، 58/0± 5/18و 39/0 ± 9/12میلی گرم اکی والانت گالیک اسید بر گرم عصاره، و میزان فلاونوئید 46/0 ± 2/9، 23/0 ± 2/8 و 31/0± 9/6 میلی گرم اکی والانت کوئرسیتین بر گرم عصاره است (19).

 Wannesو همکاران در سال 2010 با بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی گیاه Myrtus communis Var. italic L. نشان دادند که میزان  IC₅₀با روش DPPH در برگ برابر با 8، در ساقه 90 و در گل 3 میکروگرم بر میلی لیتر است. همچنین میزان IC50 با روش بتاکاروتن - لینولئیک اسید نیز در برگ، ساقه و گل بترتیب 70 ،124 و 78 میکروگرم بر میلی لیتر است. میزان فنل برگ 76/33، گل 70/15، و ساقه 11/11 میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک عصاره است. همچنین میزان فلاونوئید برگ 3، گل 37/0 و ساقه17/5 میلی گرم اکی والانت کاتچین بر گرم است (27).

مطالعات انجام شده روی Phlomis lurestanica نشان داد که میزان IC50 با روش DPPH نیز 9/1168و 6/1536 میکروگرم بر میلی لیتر( بترتیب در برگ و ساقه) است. همچنین درصد مهار با روش بتاکاروتن - لینولئیک اسید نیز بترتیب در برگ و ساقه 2/96 و 95 درصد است میزان فنل موجود در برگ و ساقه بترتیب 301 و 2/45 میلی گرم گالیک اسید بر گرم وزن خشک عصاره است، همچنین میزان فلاونوئید برگ و ساقه نیز بترتیب 3/172 و 8/18 میلی گرم کوئرسیتین بر گرم وزن خشک عصاره است (14).

فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد باکتریایی سه گونه از جنس Centaurea L. (مرکبان) از ایران توسط الماسی و همکاران در سال 1394 مورد بررسی قرارگرفت. نتایج این پژوهش نشان داد که هر سه گونه قدرت آنتی اکسیدانی قابل توجهی دارند و میزان فنل و فلاونوئید نیز در آن‌ها بالا است. گونه C. iransharii حاوی بیشترین میزان فنل و فلاونوئید است و بیشترین مهار کنندگی رادیکال آزاد DPPH نیز مربوط به عصاره اندام هوایی این گونه است (1).

مقایسه تحقیقات انجام شده روی سایر گیاهان که در بالا بیان شد با پژوهش حاضرشباهت‌هایی را در نتایج نشان می­دهد از جمله اینکه در بسیاری از موارد رابطه مستقیمی بین قدرت آنتی اکسیدانی و میزان فنل و فلاونوئید وجود دارد. اما در برخی موارد نیز قدرت آنتی اکسیدانی گیاه رابطه‌ای با میزان فنل و فلاونوئید ندارد. در این موارد احتمالاً قدرت آنتی اکسیدانی گیاه مربوط به سایر ترکیبات آنتی اکسیدانی مانند کاروتنوئیدها و ساپونین­ها و ..... می­باشد. هم چنین نتایج نشان می­دهد که نوع اندام بر قدرت آنتی اکسیدانی و میزان فنل و فلاونوئید گیاه موثر است و بنابر نتایج این بررسی برگ گیاه P. puberula بهترین اندام و مرحله پس از گلدهی بهترین مرحله فنولوژیکی در جهت استفاده از این گیاه به عنوان یک منبع آنتی اکسیدانی است.

نتیجه گیری

باتوجه به غنی بودن اسانس برگ از ترکیب ضد قارچی و ضد میکروبی کاریوفیلن اکساید و همچنین قدرت آنتی اکسیدانی بالای برگ‌های این گیاه و کاربرد آن در طب سنتی، P. puberula در آینده می‌تواند در صنایع دارویی و غذایی به طور گسترده مورد استفاده قرار گیرد.