نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 عضو هیات علمی گروه علوم باغبانی
2 گروه علوم باغبانی
3 هیئت علمی دانشگاه محقق اردبیلی
چکیده
سوسن چلچراغ، گیاهی زینتی، بومی کشور ایران میباشد که علاوه بر جنبههای زینتی، دارای مواد دارویی نیز میباشد. آزمایش حاضر به منظور بررسی تأثیر غلظتهای مختلف بنزیل آدنین بر تولید برخی متابولیتهای ثانویه در کشت درون شیشهای سوسن چلچراغ صورت پذیرفت. برای این منظور، از محیط کشت MS حاوی یک میلیگرم بر لیتر NAA و غلظتهای 1، 2، 3 و 4 میلیگرم بر لیتر BA مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که بیشترین تعداد و طول ریشه در تیمار شاهد و بیشترین شاخصهای برگ (تعداد، سطح و طول)، ارتفاع گیاهچه، تعداد و قطر پیازچه، تعداد فلس، وزنتر، میزان کلروفیل، آنتوسیانین، فنول کل و فلاونوئیدها در محیط کشت حاوی یک میلیگرم بر لیتر BA به همراه یک میلیگرم بر لیتر NAA به دست آمد و با افزایش غلظت BA در محیط کشت، شاخصهای مذکور کاهش یافتند. همچنین همبستگی مستقیمی بین میزان کلروفیل و تولید آنتوسیانین، فلاونوئیدها و فنول کل در سطح یک درصد مشاهده شد که نشانگر نقش فتوسنتز در تولید متابولیتهای ثانویه در شرایط درون شیشهای میباشد. به طور کلی، تعیین بهترین غلظت سایتوکینین و همچنین نسبت سایتوکینین به اکسین در محیط کشت، برای تولید متابولیتهای ثانویه ضروری میباشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Investigation on the effects of growth regulators on morphological characteristics and antioxidant compounds of Lilium ledebourii Bioss under in vitro conditions
نویسندگان [English]
1 An Academic member of horticultural Dep.
2 Horticultural Dep.
3 Horticultural Dep.
چکیده [English]
Lilium ledebourii is a native ornamental plant in Iran that has medicinal properties beside ornamental aspects. In the present study, the effects of different concentrations of BA on morphologic traits and secondary metabolite production in L. ledebeourii were evaluated. For this purpose, MS medium Supplemented with 1 mg/l NAA and 1, 2, 3 and 4 mg/l BA has been used. Results showed that maximum number and length of roots and Highest indexes of leaves (number, area and length), plantlet height, number and diameter of bulblets, number of scales, chlorophyll, Anthocyanin, Total phenol and flavonoid contents were obtained in control medium and medium Contained 1 mg/ l BA, respectively. With increasing concentrations of BA in the medium, previously described indexes were enhanced. Also, direct regression observed between chlorophyll content and Anthocyanin, Flavonoids and total phenols. This indicated a key role of photosynthesis in secondary metabolite production under in vitro condition. Generally, It Seems necessary that determined optimum Cytokinin concentration and Cytokinin/Auxin ratio in the Culture medium.
کلیدواژهها [English]
بررسی تأثیرتنظیمکنندههای رشد بر صفات مورفولوژیکی و ترکیبات آنتیاکسیدانی سوسن چلچراغ (Lilium ledebourii Bioss) در شرایط درون شیشهای
اسماعیل چمنی*، نرگس کریمی قلعهتکی، مهدی محبالدینی و یونس پوربیرامی هیر
ایران، اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، گروه علوم باغبانی
تاریخ دریافت: 03/10/1398 تاریخ پذیرش: 12/11/1398
چکیده
سوسن چلچراغ، گیاهی زینتی، بومی کشور ایران میباشد که علاوه بر جنبههای زینتی، دارای مواد دارویی نیز میباشد. آزمایش حاضر به منظور بررسی تأثیر غلظتهای مختلف بنزیل آدنین بر تولید برخی متابولیتهای ثانویه در کشت درون شیشهای سوسن چلچراغ صورت پذیرفت. برای این منظور، از محیط کشت MS حاوی یک میلیگرم بر لیتر NAA و غلظتهای 1، 2، 3 و 4 میلیگرم بر لیتر BA مورد استفاده قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که بیشترین تعداد و طول ریشه در تیمار شاهد و بیشترین شاخصهای برگ (تعداد، سطح و طول)، ارتفاع گیاهچه، تعداد و قطر پیازچه، تعداد فلس، وزنتر، میزان کلروفیل، آنتوسیانین، فنول کل و فلاونوئیدها در محیط کشت حاوی یک میلیگرم بر لیتر BA به همراه یک میلیگرم بر لیتر NAA به دست آمد و با افزایش غلظت BA در محیط کشت، شاخصهای مذکور کاهش یافتند. همچنین همبستگی مستقیمی بین میزان کلروفیل و تولید آنتوسیانین، فلاونوئیدها و فنول کل در سطح یک درصد مشاهده شد که نشانگر نقش فتوسنتز در تولید متابولیتهای ثانویه در شرایط درون شیشهای میباشد. به طور کلی، تعیین بهترین غلظت سایتوکینین و همچنین نسبت سایتوکینین به اکسین در محیط کشت، برای تولید متابولیتهای ثانویه ضروری میباشد.
واژه های کلیدی: بنزیل آدنین، سوسن چلچراغ، کشت درون شیشهای، متابولیتهای ثانویه
* نویسنده مسئول، تلفن: 09144545314، پست الکترونیکی: echamani@uma.ac.ir
مقدمه
تغییر یافتن شرایط محیطی به وسیله تنش منجر به فعال شدن آنزیمهایی میشود که تا قبل از آن فعال نبودند. این آنزیمها مسیرهای متابولیسمی خاصی را راهاندازی میکنند که متابولیسم ثانویه نامیده میشود (16). از گستردهترین متابولیتهای ثانویه میتوان به فلاونها و مشتقات آنها (فلاونوئید) اشاره داشت، که در بسیاری از گیاهان به صورت آزاد و یا به صورت ترکیب با سایر گلیکوزیدها وجود دارند. فلاونها و آنتوسیانینها در شیره سلولهای گیاهی به صورت محلول میباشند. یکی از دلایل انجام نشدن مطالعات کافی در این زمینه اینست که فلاونها قابلیت انحلال در مواد مختلف را ندارند و استخراج آنها دشوار است (10). ترکیبات فنولی شامل دامنهی گستردهای از مواد دارای حلقه آروماتیکی با یک استخلاف هیدروکسیلی هستند. این ترکیبات توسط آنزیمهای فنیلآلانین و شیکیمات و از مسیر اسید شیکمیک تولید میگردند (11). گیاهان میتوانند از طریق القای آنزیمهای دفاعی آنتیاکسیدان، به طیف وسیعی از تنشها مانند نوسانات دمایی و رطوبتی، اشعهی فرابنفش و حملهی پاتوژنها پاسخ دهند. به عنوان مثال زخمی شدن گیاه منجر به تولید گونههای فعال اکسیژن میگردد که توسط ترکیبات فنلی خنثی میشوند (10).
سوسن چلچراغ با نام علمی Bioss ledebourii Lilium گیاهی تکلپهای، دائمی، پیازی، علفی و از تیره سوسنسانان و جنس سوسن بوده و در مناطقی از ایران نظیر خانقاه اردبیل و کلاردشت مازندران پراکنش داشته (5و 15). تحقیقات روی گیاهان خانوادهی سوسنسانان نشان داده است که حاوی ترکیباتی مانند آلکالوئید، ترکیبات فنولی، ساپونین، استروئید، ویتامین و اسیدچرب میباشند (25). این گیاه دارای متابولیتهای ثانویه با ارزشی است که در صنعت دارویی، بهداشتی و غذایی مورد استفاده قرار میگیرد. سوسنچلچراغ حاوی فلاونوئید، اسیدهای چرب، ترکیبات آروماتیک فرار، اسید لینولئیک، اسیداولئیک، آلکالوئیدها، ساپونین و روغنهای ضروری (ایزوپولگول، پنتاکسن، 3- متیل پنتاکسن، لینالول اکساید) میباشد (22). میتوان از روشهای نوین تولید متابولیتهای ثانویه از قبیل راهکارهای فناوری زیستی (بهرهگیری از علوم مختلف مانند بیوشیمی، ژنتیک، بیوتکنولوژی و غیره) جهت افزایش تولید و بهرهوری از گیاهان دارویی استفاده کرد (38و 1). هر مادهای که به عنوان آغازکننده یا ماده حد واسط در مسیر سنتز متابولیتهای ثانویه نقش داشته باشد و به عنوان یک عامل مناسب برای افزایش عملکرد تولیدمتابولیت ثانویه استفاده گردد تحت عنوان محرک نام برده میشود (36)، که میتوان به تنظیم کنندههای رشد مانند جاسموناتها، اتیلن، اسیدنیتریک، سالیسیلیکاسید و موادی مانند هیدروپراکسیدها، Ca2+ (37) و غیره اشاره داشت. تنظیم کنندههای رشد اغلب یک فاکتور تعیین کننده در جهت تولید و تجمع متابولیتهای ثانویه گیاهی در شرایط درون شیشهای محسوب میشوند. نوع و غلظت اکسین (NAA) و سایتوکینین (BA) و یا نسبت بین این دو ماده تأثیر شگفتانگیزی روی رشد و تولید متابولیتهای ثانویه گیاهی دارد. IAAو NAA باعث تسریع تولید بتاسیانین در هویج و همچنین تولید نیکوتین در کشت سوسپانسیون تنباکو شده است. کینتین نیز تولید آنتوسیانین را در Haplopappus gracilus تحریک کرد اما در کشت سلولی درخت صنوبر بازدارندهی سنتز آنتوسیانین بود. به طور کلی واکنش گیاهان به تنظیم کنندههای رشد به منظور تولید متابولیتثانویه بسته به گونه گیاهی و نوع و غلظت هورمون به کار رفته دارد (36). باتوجه به افزایش تقاضا برای استفاده از ترکیبات دارویی با منشأ گیاهی، شناسایی گیاهان حاوی ترکیبات داروئی و یافتن روش مناسب تولید این ترکیبات از اهمیت ویژهای برخوردار است. از اینرو پژوهش حاضر در راستای بررسی تولید متابولیتهای ثانویه گل سوسن چلچراغ تحت تأثیر هورمون بنزیل آدنین و نفتالین استیک اسیددر شرایط درون شیشهای انجام شد، که میتواند به حذف مشکل مربوط به فصل رشد و زمانبر بودن تکثیر کمک کرده و از سوئی گامی در جهت جلوگیری از انقراض این گیاه با ارزش به منظور بررسی متابولیتهای ثانویه آن، برداشته شود.
مواد و روشها
پیازهای سوسن چلچراغ بعد از خشک شدن بخشهای هوایی، از رویشگاه طبیعی آن، واقع در منطقه خانقاه اردبیل جمع آوری و سپس بخشهای آلوده و صدمه دیده جدا شد. برای ضدعفونی کردن ابتدا لایه های خارجی پیاز که قهوهای رنگ و ناسالم بودند در زیر جریان آب حذف شدند. پس از رسیدن به قسمتهای داخلی و فلسهای سالم و آبدار، فلسها یکی یکی از طبق پیاز جدا شدند (شکل 1) و در داخل بشر حاوی توری قرار داده شده و به مدت یک ساعت زیر آب جاری همراه با چند قطره مایع ظرفشویی شسته شدند. سپس جهت از بین بردن آلودگیهای میکروارگانیسمی (قارچ و باکتری) از اتانول 70 درصد به مدت 30 ثانیه و محلول هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت 20 دقیقه استفاده شد. پس از ضدعفونی کردن ریزنمونهها در سه نوبت به مدت 2، 5 و 15 دقیقه با آب مقطر 2 بار استریل شسته شده و تا زمان کشت در آب مقطر دوبار استریل نگهداری شدند (شکل 2).
شکل1- جداسازی فلسهای پیاز
شکل2- ریزنمونههای ضدعفونی شده
ریز نمونههای فلس برش داده شده (شکل 3) در محیط کشت MS فاقد هورمون جهت باززایی کشت گردید (32). (شکل 4). لازم به ذکر است محیط کشت در ظروف آزمایشگاهی مورد نظر توزیع و با استفاده از اتوکلاو به مدت 20 دقیقه در دمای 121 درجه سانتیگراد استریل شد. مراحل کشت در زیر هود لامینار صورت گرفت.
شکل 3- برش ریزنمونهها
شکل4- باززایی فلسهای کشت شده
سپس ریزنمونههای کشت شده در اتاقک رشد با دمای 2 ±23 درجه سانتیگراد و مجهز به لامپهای فلورسنت با شدت نور 2000 لوکس (16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی) قرارگرفتند تا باززایی در آنها انجام گیرد. 70 روز بعد از کشت از فلسهای باززایی شده به منظور اعمال تیمار BA استفاده گردید (شکل 5).
شکل 5- استفاده از پیازچه باززایی شده جهت اعمال تیمار
ریزنمونههای فلس حاصل از مرحله تکثیر ریزنمونهها، در محیط کشت MS حاوی تیمار BA با غلظتهای صفر، 1، 2، 3 و 4 میلیگرم بر لیتر و NAA با غلظت 1 میلیگرم بر لیتر کشت گردید. بعد از گذشت 4-3 هفته، واکشت گیاهچههای باززایی شده (شکل 6)، انجام گردید. به منظور تهیه گیاهچههای مورد نیاز در راستای اندازهگیری متابولیت ثانویه، 6 مرحله واکشت انجام شد. سپس گیاهچهها به منظوراندازهگیری صفات مورفولوژیکی شامل تعداد، طول، سطح و کلروفیل برگ (از هر تکرار 2 برگ و در هر برگ شاخص کلروفیل قسمت انتهایی، وسط و قسمت ابتدایی برگ با استفاده از دستگاه کلروفیل سنج (Spad-502) اندازهگیری شد)، تعداد و طول ریشه، تعداد و قطر پیاز، تعداد فلس، وزن تر، ارتفاع گیاهچه و ترکیبات آنتیاکسیدان (فنول، فلاونوئید و آنتوسیانین) مورد ارزیابی قرارگرفتند.
شکل 6- باززایی گیاهچههای تیمار شده
اندازهگیری محتوای فنول موجود در عصاره گیاه براساس روش ابراهیمزاده و همکاران (21)، با کمی تغییر صورت گرفت. برای این منظور معرف فولین سیوکالتیو ده برابر رقیق شده به ml 1/0 از عصاره گیاهی سانتریفیوژ شده همراه با ml 4/1 کربنات سدیم 7 درصد اضافه گردید. محلول حاصل بعد از همزدن، به مدت نیم ساعت در تاریکی و در دمای اتاق نگهداری شد. سپس میزان جذب در طول موج 765 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد. نمونه شاهد نیز با جایگزین کردن ml 1/0 آب مقطر به جای عصاره گیاهی تهیه گردید. به منظور رسم منحنی استاندارد و معادله رگرسیون ترکیب فنولی اسیدگالیک استفاده گردید. به منظور اندازهگیری میزان فلاونوئید 2/0 گرم از نمونه گیاهی وزن شده و درون هاون چینی روی ظرف حاوی یخ، له گردید و کم کم ml 3 از اتانول اسیدی (اتانول/اسید استیک: 99/1) به محتویات هاون چینی اضافه شد بعد از سائیدن نمونه گیاهی و تهیه محلول یکنواخت از محتویات هاون، به مدت 15 دقیقه و 12000 دور سانتریفیوژ شد. سپس عصاره سانتریفیوژ شده از کاغذ صافی واتمن شماره یک عبور داده شد و به مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم (مدل SD16) 80 درجه سانتیگراد قرارگرفت. بعد از سرد شدن عصارهها، میزان جذب رنگ در سه طول موج 270، 300 و 330 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای محاسبه غلظت فلاونوئید در هر طول موج به صورت مجزا از فرمول ضریبخاموشی استفاده شد (9).
A=εbc
ε: ضریب خاموشی (cmM33000)، b:عرض کووت (cm) ، c: غلظت فلاونوئید (mol/l)، A: میزان جذب قرائت شده
برای اندازهگیری میزان آنتوسیانین نیز 2/0 گرم از نمونه گیاهی وزن شده و درون هاون چینی قرار داده شده داخل ظرف حاوی یخ، سائیده شد و کمکم ml 3 از متانول اسیدی (متانول/اسید کلریدریک: 99/1) به محتویات هاون چینی افزوده شد. بعد از سائیدن نمونه گیاهی و تهیه محلول یکنواخت از محتویات هاون، به مدت 15 دقیقه و 12000 دور سانتریفیوژ گردید. سپس عصاره سانتریفیوژ شده از کاغذ صافی واتمن شماره یک عبور داده شد و به مدت 24 ساعت در تاریکی و در دمای اتاق قرارگرفت. میزان جذب رنگ در طول موج 550 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. برای محاسبه غلظت آنتوسیانین از فرمول بالا استفاده شد (9). تجزیه واریانس دادهها با استفاده از نرم افزار آماری SPSS16 و در قالب طرح کاملاً تصادفی با 4 تکرار برای صفات کمی و 6 تکرار برای ترکیبات آنتی اکسیدانی انجام گردید. مقایسه میانگین دادهها نیز با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
نتایج
در کل نمودراهای این پژوهش غلظتهای صفر، 1، 2، 3 و 4 میلیگرم در لیتر بنزیل آدنین به ترتیب با حروف اختصاری Control، BA1، BA2، BA3، و BA4، و غلظت 1 میلیگرم در لیتر نفتالین استیک اسید با حرف اختصاری NAA نشان داده شده است.
نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد بین غلظتهای مختلف بنزیل آدنین، از نظر صفات تعداد ریشه، طول ریشه، تعداد برگ، طول برگ، شاخص کلروفیل، سطح برگ و ارتفاع گیاهچه، تعداد پیاز، قطر پیاز، تعداد فلس و وزنتر گیاهچههای باززایی شده سوسن چلچراغ، اختلاف معنیداری وجود داشت (جداول 1و 2).
جدول 1- تجزیه واریانس تأثیر تیمار بنزیلآدنین بر صفات مورفولوژیکی سوسن چلچراغ
میانگین مربعات
منابع تغییرات |
درجهآزادی |
تعداد ریشه |
طول ریشه |
تعداد برگ |
طول برگ |
تعداد پیاز |
قطر پیاز |
بنزیل آدنین |
4 |
ää24/77 |
ää346/492 |
ää248/36 |
ää410/97 |
ä909/1 |
ä374/3 |
خطا |
15 |
712/0 |
157/13 |
122/1 |
22/5 |
419/0 |
675/0 |
ضریب تغییرات |
|
99/7 |
90/27 |
65/13 |
20/7 |
48/13 |
5/26 |
* و ** به ترتیب معنیدار در سطح احتمال 5 و 1درصد
جدول 2- ادامه تجزیه واریانس تأثیر تیمار بنزیلآدنین بر صفات مورفولوژیکی سوسن چلچراغ
میانگین مربعات
منابع تغییرات |
درجهآزادی |
تعداد فلس |
شاخص کلروفیل |
سطح برگ |
وزنتر |
ارتفاع گیاهچه |
بنزیل آدنین |
4 |
ä697/18 |
ää886/1 |
ää304/9 |
ä185/5 |
ää05/309 |
خطا |
15 |
596/3 |
247/0 |
044/1 |
257/1 |
58/8 |
ضریب تغییرات |
|
91/8 |
29/3 |
57/14 |
51/6 |
62/8 |
* و ** به ترتیب معنیدار در سطح احتمال 5 و 1 درصد
مقایسه میانگین دادهها نشان داد بیشترین تعداد ریشه را تیمار شاهد حاوی NAAmgl-1 1 به خود اختصاص داد. کمترین تعداد ریشه نیز از غلظت NAAmgl-11+ mgl-1BA 4 حاصل گردید (نمودار a-2). بیشترین طول ریشه نیز از تیمار شاهد به دست آمد. کمترین طول ریشه از غلظت NAAmgl-1 1+mgl-1BA 4 حاصل شد (نمودار b-2). بر اساس مقایسه میانگین دادهها غلظت mg l-1 1 بنزیل آدنین بیشترین تعداد برگ را به خود اختصاص داد. غلظتهای mg l-1 2، mg l-1 3 و mg l-1 4 BA + NAAmg l-1 1 نیز باعث افزایش تعداد برگ شد و از این لحاظ اختلاف معنیداری با شاهد داشتند. کمترین تعداد برگ از تیمار شاهد حاصل گردید (نمودار a-1). براساس مقایسه میانگین دادهها بیشترین طول برگ را تیمار NAAmg l-1 1+mgl-1BA 1 به خود اختصاص داد. NAAmg l-1 1+mgl-1BA 2 نیز باعث افزایش طول برگ شد و از این نظر اختلاف معنیداری با شاهد داشت. کمترین طول برگ از تیمار NAAmg l-1 1+mgl-1BA 4 به دست آمد (نمودار b -1). براساس مقایسه میانگین دادهها بیشترین تعداد پیاز از غلظت NAAmg l-1 1+mgl-1BA 1به دست آمد (نمودار b -3). مقایسه میانگین دادهها نشان داد. بیشترین قطر پیاز از غلظت NAAmg l-1 1+mgl-1BA 1به دست آمد (نمودار a -3). براساس مقایسه میانگین دادهها بیشترین تعداد فلس از غلظت NAAmg l-1 1+mgl-1BA 1حاصل گردید و اختلاف معنیداری با شاهد نداشت. سایر غلظتهای بنزیل آدنین باعث کاهش تعداد فلس شد (نمودار d -3). مقایسه میانگین دادهها نشان داد بیشترین سطح برگ مربوط به غلظت NAAmg l-1 1+mgl-1BA 1میباشد. سایر غلظتهای بنزیل آدنین اختلاف معنیداری با شاهد داشتند (نمودار c -1). همچنین بیشترین شاخص کلروفیل را غلظت NAAmg l-1 1+mgl-1BA 1به خود اختصاص داد و سایر غلظتهای بنزیل آدنین اختلاف معنیداری با شاهد نداشتند و کمترین محتوای کلروفیل، از غلظت NAAmg l-1 1+mgl-1BA 4حاصل شد (نمودار b -4). مقایسه میانگین دادهها نشان داد بیشترین وزنتر را غلظت NAAmg l-1 1+mgl-1BA 1به خود اختصاص داد و نسبت به شاهد اختلاف معنیداری نداشت. سایر غلظتهای بنزیل آدنین باعث کاهش وزنتر شدند (نمودار c -3). براساس مقایسه میانگین دادهها بیشترین ارتفاع گیاهچه را غلظت NAAmg l-1 1+mgl-1BA 1 به خود اختصاص داد. همچنین سایر غلظتهای بنزیل آدنین باعث افزایش ارتفاع گیاهچه شدند و از این لحاظ اختلاف معنیداری با شاهد داشتند (نمودار d -1).
نمودار1 - تأثیر غلظتهای مختلف BA بر تعداد برگ (a)، طول برگ (b)، سطح برگ (c) و ارتفاع گیاهچه (d)
نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد بین غلظتهای مختلف بنزیل آدنین در صفت محتوای فنول کل گیاهچههای باززایی شده سوسن چلچراغ، اختلاف معنیداری در سطح احتمال 1 درصد وجود دارد (جدول 3). بیشترین محتوای فنول از غلظت mg l-1 1 بنزیل آدنین حاصل شد و از این لحاظ اختلاف معنیداری با شاهد داشتند. کمترین میزان فنول از تیمار شاهد به دست آمد (نمودار a -4).نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها نشان داد بین غلظتهای مختلف بنزیل آدنین برای صفت غلظت آنتوسیانین گیاهچههای باززایی شده سوسن چلچراغ، اختلاف معنیداری در سطح احتمال 1 درصد وجود داشت (جدول 3).
جدول 3- تجزیه واریانس تأثیر بنزیل آدنین بر ترکیبات آنتی اکسیدانی سوسن چلچراغ
میانگین مربعات
منابع تغییرات |
درجهآزادی |
فنول |
آنتوسیانین |
فلاونوئید270 |
فلاونوئید300 |
فلاونوئید330 |
بنزیل آدنین |
4 |
ää243/3260 |
ää925/2 |
ää482/1 |
ä115/11 |
ää267/26 |
خطا |
25 |
114/35 |
086/0 |
088/0 |
047/3 |
445/0 |
ضریب تغییرات (%) |
|
18/26 |
66/27 |
92/22 |
47/21 |
06/17 |
* و ** به ترتیب معنیدار در سطح احتمال 5 و 1 درصد
براساس مقایسه میانگین دادهها بیشترین غلظت آنتوسیانین از غلظت یک میلیگرم در لیتر بنزیل آدنین حاصل شد و سایر غلظتهای بنزیل آدنین بهطور معنیداری محتوی آنتوسیان کمتری نسبت به شاهد داشتند (نمودار a -5). براساس نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها، تأثیر غلظتهای مختلف بنزیل آدنین بر غلظتهای فلاونوئید در طول موج 270، 330 و 300 نانومتر به ترتیب اختلاف معنیداری در سطح احتمال 1 درصد و 5 درصد و 1 درصد وجود داشت (جدول 3). بیشترین میزان فلاونوئید در طول موج 300 نانومتر قرائت گردید و بیشترین غلظت فلاونوئید در هر سه طول موج به کار رفته از محیط حاوی mg l-1 1 بنزیل آدنین حاصل گردید. همچنین کمترین غلظت فلاونوئید در هر سه طول موج به کار رفته، از تیمار شاهد حاصل گردید (نمودارb, c and d -5).
|
|
نمودار2-تأثیرغلظتهای مختلف BA بر صفات تعداد ریشه (a) و طول ریشه (b)
|
|
|
نمودار3-تأثیر غلظتهای مختلف BA بر قطر پیازچه (a)، تعداد پیازچه (b)، وزن تر (c) و تعداد فلس (d) گیاهان باززایی شده
|
نمودار4- تأثیر غلظتهای مختلف BA بر میزان فنول کل (a) و محتوای کلروفیل کل (b) در گیاهچههای باززایی شده
نمودار5- تأثیر BA بر میزان آنتوسیانین (a) و فلاونوئید در طول موجهای 270 (b)، 300 (c) و 330 (d) نانومتر
شکل 7-گیاهچههای به دست آمده از تیمار شاهد (a) و تیمار با یک میلیگرم بر لیتر بنزیل آدنین (b)
ضرایب همبستگی صفات مورد مطالعه (جدول 4) نشان داد که بین آنتوسیانین و فلاونوئید اندازهگیری شده در طول موجهای مختلف با تعداد پیاز، قطر پیاز و تعداد فلس همبستگی معنیداری وجود نداشت. لازم به ذکر است ضریب همبستگی مثبت و معنی داری (01/0P≤ ) بین سطح برگ و ارتفاع گیاهچه با ترکیبات آنتی اکسیدانی مشاهده شد. بین صفات تعداد و طول ریشه با تعداد برگ، تعداد و قطر پیاز، تعداد فلس، محتوای فنول و فلاونوئید در طول موج 330 نانومتر همبستگی معنیداری وجود نداشت. بین صفات تعداد و طول ریشه و محتوای فنول و فلاونوئید در طول موجهای 270 و 300 نانومتر همبستگی منفی و معنیداری (01/0P≤ ) مشاهده شد. ضرایب همبستگی صفات مورد مطالعه نشان داد بالاترین همبستگی (**897/0) را صفات تعداد برگ و ارتفاع گیاهچه با غلظت فلاونوئید اندازهگیری شده در طول موج 330 نانومتر به خود اختصاص دادند. طبق نتایج بررسی همبستگی بین ترکیبات آنتی اکسیدان، همبستگی مثبت و معنیداری بین غلظت فلاونوئید در سه طول موج مورد بررسی با غلظت آنتوسیانین وجود داشت. همچنین همبستگی مثبت و معنیداری (01/0P≤ ) بین محتوای فنول، آنتوسیانین و غلظت فلاونوئید (در طول موجهای 300و 330 نانومتر) مشاهده شد. باتوجه به این که ترکیبات آنتیاکسیدانی مورد ارزیابی از خانواده فنولیکها (فلاوونها، فنول، فلاونوئید) میباشند (15) قابل توجیه است که همبستگی مثبتی با یکدیگر داشته باشند، بین غلظت فلاونوئید در طول موج 270 نانومتر با محتوای فنول، آنتوسیانین و غلظت فلاونوئید (در طول موجهای 300 و 330 نانومتر) نیز همبستگی وجود دارد که میتواند ناشی از خطای آزمایشی باشد. بین آنتوسیانین و تعداد، طول و سطح برگ و همچنین ارتفاع گیاه و مقدار کلروفیل نیز همبستگی معنیداری وجود داشت (جداول 4و 5).
جدول 4- ضرایب همبستگی صفات مورد مطالعه
صفت |
تعداد ریشه |
طول ریشه |
تعداد برگ |
طول برگ |
تعداد پیاز |
قطر پیاز |
تعداد فلس |
سطح برگ |
تعداد ریشه |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
طول ریشه |
**929/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
تعداد برگ |
**586/0- |
**577/0- |
1 |
|
|
|
|
|
طول برگ |
ns062/0 |
ns12/0- |
**661/0 |
1 |
|
|
|
|
تعداد پیاز |
ns382/0 |
ns320/0 |
ns096/0 |
ns436/0 |
1 |
|
|
|
قطر پیاز |
ns275/0 |
ns259/0 |
*456/0 |
**648/0 |
230/0 |
1 |
|
|
تعداد فلس |
ns383/0 |
ns321/0 |
ns188/0 |
**581/0 |
**637/0 |
*530/0 |
1 |
|
سطح برگ |
**574/0- |
**583/0- |
**759/0 |
ns383/0 |
ns077/0 |
ns145/0 |
ns042/0 |
1 |
مقدارکلروفیل |
ns052/0 |
ns058/0- |
**599/0 |
**735/0 |
ns414/0 |
*474/0 |
*458/0 |
*479/0 |
وزن تر |
ns325/0 |
ns234/0 |
ns249/0 |
*513/0 |
**605/0 |
*506/0 |
**660/0 |
ns089/0 |
ارتفاع گیاه |
**58/0- |
**606/0- |
**915/0 |
**663/0 |
ns062/0 |
ns342/0 |
ns020/0 |
**746/0 |
فنول |
ns23/0- |
ns346/0- |
**775/0 |
**786/0 |
ns329/0 |
**603/0 |
ns343/0 |
**657/0 |
آنتوسیانین |
*561/0- |
**617/0- |
**815/0 |
*549/0 |
ns241/0 |
ns275/0 |
ns286/0 |
**796/0 |
فلاونوئید270 |
**910/0- |
**876/0- |
**614/0 |
ns049/0- |
ns251/0- |
ns253/0- |
ns283/0 |
**663/0 |
فلاونوئید300 |
ns333/0- |
ns404/0- |
*552/0 |
318/0 |
ns123/0 |
ns197/0 |
ns120/0 |
*467/0 |
فلاونوئید330 |
**743/0- |
**758/0- |
**897/0 |
*492/0 |
ns019/0 |
ns168/0 |
ns036/0 |
**860 |
ns، * و ** به ترتیب غیرمعنی دار و معنیدار در سطح احتمال 5 و 1 درصد
جدول 5- ادامه ضرایب همبستگی صفات مورد مطالعه
صفت |
مقدار کلروفیل |
وزن تر |
ارتفاع گیاه |
فنول |
آنتوسیانین |
فلاونوئید270 |
فلاونوئید300 |
فلاونوئید330 |
مقدارکلروفیل |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
وزن تر |
*538/0 |
1 |
|
|
|
|
|
|
ارتفاع گیاه |
**600/0 |
ns133/0 |
1 |
|
|
|
|
|
فنول |
**678/0 |
ns443/0 |
**808/0 |
1 |
|
|
|
|
آنتوسیانین |
**632/0 |
ns252/0 |
**829/0 |
**770/0 |
1 |
|
|
|
فلاونوئید270 |
ns067/0 |
ns192/0- |
*559/0 |
ns259/0 |
**628/0 |
1 |
|
|
فلاونوئید300 |
382/0 |
ns063/0- |
**593/0 |
*544/0 |
*556/0 |
ns263/0 |
1 |
|
فلاونوئید330 |
*493/0 |
ns054/0 |
**897/0 |
**741/0 |
**825/0 |
**714/0 |
**609/0 |
1 |
ns، * و ** به ترتیب غیرمعنی دار و معنیدار در سطح احتمال 5و 1 درصد
بحث و نتیجه گیری
در پژوهش حاضر بیشترین تعداد و طول ریشه در گیاهچههای باززایی شده از تیمار شاهد (کلیه محیط کشتها حاوی یک میلیگرمNAA بود) به دست آمد. در پژوهش پاداشت دهکائی و همکاران (5) مشخص شد که با افزایش غلظت NAA در گیاهچههای سوسن چلچراغ، میزان ریشهزایی افزایش یافت و بیشترین تعداد ریشه در تیمار 1 میلیگرم بر لیتر NAA به دست آمد. تاتاری ورنوسفادرانی و همکاران (6) بیان کردند بیشترین تعداد ریشه در سوسن چلچراغ، از محیط حاوی 1/0 میلیگرم NAA حاصل گردید. گزارشهای أخیر با نتایج به دست آمده در این تحقیق مطابقت دارند. نات (33) گزارش کرد که ریشهزایی شاخسارههای سوسن عید پاک در شرایط درون شیشهای بدون حضور NAA نیز صورت میگیرد، ولی با افزایش غلظت NAA، میزان ریشهزایی افزایش مییابد. با افزایش غلظت BA، تعداد و طول ریشه در سوسن چلچراغ کاهش مییابد. کاربرد سایتوکینین سبب کاهش در اندازه مریستم ریشه به خاطر کاهش تصاعدی در تعداد سلولهای مریستمی میگردد و در نتیجه میزان ریشهزایی کاهش مییابد (31). آزادی و خوشخوی (15) گزارش کردند که طویلترین ریشه از کشت فلس سوسن چلچراغ جمعآوری شده از منطقه داماش گیلان در محیط کشت حاوی 5/0 میلیگرم بر لیتر NAA و 5/0 میلیگرم بر لیتر BA به دست آمد. نتایج پژوهش حاضر با گزارش ذکر شده مغایر بود که میتواند به دلیل سن، موقعیت فلس و محل جمعآوری گیاه باشد، زیرا سن فلس و ژنوتیپ نیز، میتواند از عوامل تأثیرگذار بر میزان هورمونهای درونزا باشد (28 و 6).
براساس یافتههای تحقیق حاضر بیشترین تعداد برگ و طول برگ در محیط کشت حاوی یک میلیگرم BA به همراه یک میلیگرم NAA حاصل شد که میتواند به دلیل تأثیر سایتوکینینها در حذف غالبیت انتهایی و تسهیل پرآوری شاخساره باشد (26). وجود سایتوکینینها برای شاخسارهزایی در محیط کشت ضروری است و در میخک مشخص شده است که BA نسبت به سایر سایتوکینینها تأثیر بهتری در این زمینه دارد، چون گیاه BA را نسبت به سایر سایتوکینینها راحتتر مصرف میکند و همچنین BA در تحریک تولید هورمونهای درونی مانند زآتین نقش دارد (39). در بین انواع سایتوکینینها، بنزیل آدنین به طور گستردهای در کشت درون شیشهای گونههای جنس سوسن استفاده شده است که به خاطر تأثیرات آشکار آن بر تشکیل شاخسارههای نابجا در این گیاه میباشد. بیشترین میزان تولید شاخساره از ریزنمونههای L. pumilum در محیط کشت حاوی NAA و BA به دست آمده است (26). هی- هان و همکاران (24) گزارش کردند غلظت 2/2 میکرومولار بنزیل آدنین به منظور شاخهزایی هیبریدهای شرقی سوسن مطلوب بود. این گزارش با نتایج حاصل از پژوهش حاضر همخوانی ندارد که احتمالاً به دلیل تفاوت ژنتیکی و میزان هورمونهای درونزای این دو گیاه میباشد و یا اینکه در پژوهش حاضر تمامی تیمارها همراه با یک میلیگرم NAA اعمال گردیده است. در بررسی ریز ازدیادی L.longiflorum در محیط مایع مشخص شد که با افزایش غلظت BA، میزان تولید شاخساره افزایش مییابد، اما طول شاخساره و وزن تر در هر پیازچه کاهش مییابد (23) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.
براساس یافتههای این پژوهش تعداد و قطر پیازچه و همچنین تعداد فلس در هر پیازچه تنها در محیط کشت حاوی یک میلیگرم بر لیتر BA از تیمار شاهد بیشتر بود ولی تفاوت معنیداری نداشت و در سایر تیمارها، از تیمار شاهد کمتر میباشند. در پژوهش معمار مشرقی و همکاران (12)، بیشترین تعداد پیازچه و ریشهزایی در تیمار شاهد (بدون تنظیمکننده رشد) به دست آمد و با افزایش غلظت BAP شاخصهای مذکور کاهش یافت. همچنین بیشترین میزان وزن پیازچه در تیمار 1/0 میلیگرم BAP به همراه 01/0 میلیگرم NAA به دست آمد. در تحقیق دیگری، بیشترین تعداد پیازچه و وزن پیازچه در محیط کشت فاقد تنظیمکننده رشد به دست آمد و افزایش غلظت BA، سبب کاهش این شاخصها شد (6). آزادی و مجتهدی (2)، بهترین محیط کشت برای دستیابی به حداکثر قطر پیازچه، وزن پیازچه، تعداد فلس در هر پیازچه، تعداد و طول ریشه را محیط کشت حاوی 5/0 میلیگرم بر لیتر BA به همراه 01/0 میلیگرم NAA گزارش کردند. گزارشهای أخیر با نتایج این پژوهش مطابقت دارد. پاداشت دهکائی و همکاران (4) دریافتند که غلظتهای مختلف BA بر تعداد سوخک و ریشه تشکیل شده در سوسن چلچراغ تأثیر ندارد که با نتایج این پژوهش همخوانی ندارد، اما با افزایش غلظت NAA، این شاخصها افزایش مییابد. همچنین در بررسی تأثیر توأم IAA و BA بر باززایی درون شیشهای L. longiflorum مشخص شد که با افزایش غلظت BA در محیطهای با میزان IAA یکسان، قطر پیازچه و وزن تر افزایش مییابد که با نتایج این پژوهش در تضاد است (23). اما لیان و همکاران (30) در سوسن شرقی رقم کازابلانکا و آزادی و خوشخوی (15) در سوسن چلچراغ، اثر متقابل NAA و BA را بر تعداد پیازچه و وزن تر پیازچه معنیدار گزارش کردند، به طوری که بیشترین شاخصها در محیط حاوی 1/0 میلیگرم NAA و 1/0 میلیگرم BA به دست آمد. البته باید توجه داشت در تحقیق حاضر، صفات تعداد پیازچه، تعداد فلس در هر پیازچه و وزن تر تنها در غلظت یک میلیگرم بر لیتر BA نسبت به سایر غلظتها متفاوت است و در سایر غلظتها تفاوتی دیده نمیشود. بر این اساس به نظر میرسد که ریزنمونههای سوسن چلچراغ حاوی سایتوکینین درونی کافی میباشند و به سایتوکینین خارجی نیاز نداشته و یا نیاز کمی دارند و غلظتهای بالای آن، سبب بر هم خوردن تعادل هورمونی میگردد (6). از طرفی اثرات متفاوت BA بر تشکیل پیازچه ممکن است به علت تفاوتهای فیزیولوژیکی و مراحل رشدی باشد (34)، بنابراین با قطعیت نمیتوان نیاز یا عدم نیاز ریزنمونههای سوسن چلچراغ را به سایتوکینین تعیین نمود.
بیشترین محتوای کلروفیل کل در گیاهچههای باززایی شده سوسن چلچراغ در محیط کشت حاوی یک میلیگرم بر لیتر BA به دست آمد و با افزایش غلظت BA، شاخص کلروفیل روند کاهشی نشان داد. سایتوکینین ها از طریق افزایش بیان ژنهای آنزیمهای دخیل در بیوسنتز کلروفیل مانند پروتوکلروفیلید اکسیدوردوکتاز، سبب افزایش تولید کلروفیل میگردند (18). سایتوکینینها در حضور نور سبب افزایش بیوسنتز 5-آمینو لوولینیک اسید (ALA) میشوند و از آنجایی که ALA پیش ماده تولید تتراپیرول است، افزایش ALA سبب افزایش تولید کلروفیل میگردد (35). احتمالاً افزایش محتوای کلروفیل در محیطهای حاوی BA، نسبت به تیمار شاهد که فاقد سایتوکینین است، به همین دلیل میباشد. هرچند از طرفی کاهش محتوای کلروفیل با افزایش غلظت سایتوکینین را میتوان به ایجاد سمیت در غلظتهای بالا نسبت داد (8). کارالیجا و همکاران (27)، کاهش محتوای کلروفیل a، b و کل را در گیاهچههای باززایی شده از فلسهای L. bosniacum و L. cattaniae در محیط کشتهای حاوی BA و 2, 4-D نسبت به تیمار شاهد گزارش کردند. کاهش شاخص کلروفیل در گیاهچههای باززایی شده موز در محیط کشت حاوی BA نسبت به تیمار بدون هورمون نیز گزارش شده است (14). این گزارشها، با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. هر چند در نتایج مربوط به مطالعه جمشیدی و همکاران (7) استفاده از تنظیم کنندههای رشد سایتوکنین و اکسین در جلبکChlorella sorokiniana منجر به افزایش رنگیزههای فتوسنتری شده و میزان کلروفیل را افزایش داده است.
براساس نمودارهای 4 و 5، کاربرد BA در تمامی غلظتها سبب افزایش میزان فلاونوئید، فنول کل و آنتوسیانین در گیاهچههای باززایی شده نسبت به تیمار شاهد گشته است و با افزایش غلظت BA، میزان این ترکیبات کاهش مییابد. در مطالعه کومار و همکاران (29) بر تولید متابولیتهای ثانویه در کشت کالوس Heliotropium indicum مشخص شد که بیشترین میزان فنول کل و فلاونوئید در محیط کشت حاوی 2 میلیگرم برلیتر NAA به همراه 5/0 میلیگرم BA حاصل میشود و محیط کشتهایی که تنها حاوی اکسین (NAA یا 2, 4-D) میباشند کمترین میزان این ترکیبات را تولید میکنند. بیشترین میزان ترکیبات فنولی سالیسیلیک اسید و هیدروکسی بنزوئیک اسید در کشت درون شیشهای Aronia melanocarpa در محیط کشت MS حاوی یک میلیگرم BA و 5/0 میلیگرم NAA به دست آمده است (37). بیدشکی و همکاران (3) در پژوهشی به این نتیجه رسیدند که استفاده از ایندول بوتیریک اسید در محیط کشت بافت اسطوخودوس باعث کاهش مقدار اسانس و ماده مؤثره گلاندولار شد، در حالی که استفاده از این اکسین همراه با بنزیل آدنین باعث افزایش میزان اسانس گردید. در بررسی تأثیر انواع سایتوکینین بر تولید هایپریسین و شبه هایپریسین در گل راعی، مشخص شد که BA نسبت به سایر سایتوکینین ها (2ip، TDZ و Kin) در ترکیب با NAA، به میزان بیشتری تولید این مواد را افزایش میدهد (19). گزارشهای مذکور، با نتایج این پژوهش همخوانی دارند. در مطالعه پور عباد و همکاران (35) بر تولید متابولیتهای ثانویه در Lallemantia iberica، مشاهده شد که تولید متابولیتهای ثانویه در محیط کشت حاوی NAA به تنهایی بیشتر از محیط کشت حاوی NAA و BA است که با نتایج پژوهش کنونی مطابقت ندارد.
تغییر در تولید متابولیتهای ثانویه در کشت درون شیشهای از طریق تغییر محیط کشت، از جمله تنظیمکنندههای رشد امکانپذیر است. نوع و غلظت اکسین و سایتوکینین و نسبت اکسین به سایتوکینین در میزان تولید متابولیتهای ثانویه تأثیرگذار است (36). مشخص شده است که سایتوکینینها تولید متابولیتهای ثانویه را در بسیاری از گیاهان، از طریق تحریک مسیرهای بیوسنتزی، تحریک میکنند (13). به عنوان مثال، نشان داده شده است که کاربرد BA خارجی در علف گوش موشی، سبب القای بیان آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز که آنزیم کلیدی در بیوسنتز سینامات است میگردد و منجر به تجمع آنتوسیانین در این گیاه میشود (20). همچنین کاربرد انواع دیگر از سایتوکینینها مانند 2ip و متاتوپولین نیز سبب تجمع ترکیبات فنولی مانند کافئیک اسید، وانیلیک اسید و پروتوکاتکوئیک در گیاه Merwilla plumbea در شرایط درون شیشهای میگردد (13). ازطرفی سایتوکینینها میتوانند از طریق مسدود کردن انتقال نیترات از طریق تحریک بیوسنتز یا متابولیسم سایتوکینینهای درونی، تولید متابولیتهای ثانویه از جمله فنولها را افزایش دهد (35). بیان ژنهای درگیر در مسیرهای تولید متابولیتهای ثانویه مانند مسیر شیکیمات و فلاونوئید، میتوانند توسط نیترات سرکوب شوند، در حالی که انتقالدهندههای برخی عناصر غذایی مانند نیترات، آمونیوم، سولفات و فسفات میتواند توسط سایتوکینین ها سرکوب گردد.
براساس نتایج به دست آمده از همبستگی صفات (جدول 5)، مشخص میشود که شاخص کلروفیل با ارتفاع گیاهچه، میزان فنول کل، آنتوسیانین، صفات وزن تر، فلاونوئید همبستگی مستقیم دارد. با افزایش غلظت BA در محیط کشت، شاخص کلروفیل کاهش مییابد (نمودار b-4) و به دنبال آن شاخصهای مذکور نیز کاهش مییابد. با کاهش شاخص کلروفیل، میزان فتوسنتز و تولید قندها در گیاه کاهش مییابد و از آنجایی که قندها، برای فعالیتهای گیاه به عنوان منبع انرژی ضروری میباشند، بنابراین کاهش میزان فتوسنتز، سبب کاهش تولید فنول، فلاونوئید، آنتوسیانین و همچنین وزن تر و ارتفاع گیاهچه میگردد. به طورکلی، متابولیتهای ثانویه از قبیل فنولها و فلاونوئیدها نقشهای حیاتی در ریز ازدیادی برخی گونهها ایفا میکنند (14). بر طبق فرضیه بوئر و همکاران (17)، ریشهزایی در حضور برخی از انواع فلاونوئیدها افزایش مییابد؛ اما در پژوهش حاضر شاخصهای تعداد و طول ریشه با فلاونوئیدها همبستگی منفی دارد (جدول 4). این بدان معنی است که با افزایش غلظت فلاونوئیدها، میزان ریشهزایی کاهش مییابد و این در تضاد با نظریه بوئر و همکاران (17) میباشد.
باتوجه به نتایج این پژوهش، میتوان چنین عنوان کرد که بهترین غلظت BA برای دستیابی به بهترین شاخصهای مورفولوژیکی و حداکثر میزان تولید متابولیتهای ثانویه در کشت درون شیشهای سوسن چلچراغ، غلظت یک میلیگرم بر لیتر میباشد و با افزایش غلظت این تنظیمکننده رشدی، شاخصهای مذکور کاهش مییابد. همچنین نتایج همبستگی صفات نشان میدهد که میزان فتوسنتز و محتوای کلروفیل در شرایط درون شیشهای، ارتباط مستقیمی با تولید متابولیتهای ثانویه دارد.