بررسی تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در برگ و ساقه گیاه استویا تحت تنش دمای پایین

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه لرستان، خرم‌آباد، ایران

2 ایران، خرم‌آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

3 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه صنعتی خاتم الانبیاء بهبهان، بهبهان، ایران

چکیده

دمای پایین یکی از فاکتورهای مهم محدود کننده رشد، نمو و پراکنش گیاهان است. استویا (Stevia rebaudiana) یک گیاه علفی دارویی شیرین است که در بسیاری از مناطق جهان کشت می‌شود و ممکن است تنش دمای پایین را در زمستان تجربه کند. در این مطالعه، تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که در گیاهان استویا تحت تنش دمای پایین رخ می‌دهد و باعث بقاء آنها می‌شود مورد بررسی قرار گرفت. استویا برای یک ماه تحت تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد قرار داده شد و شاخص‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در برگ و ساقه اندازه‌گیری شد. در دمای پایین محتوی کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در برگ کاهش پیدا کرد. به علاوه، تجمع افزایش یافته پراکسید هیدروژن و مالون دآلدئید در برگ و ساقه استویا در معرض تنش دمای پایین مشاهده شد. تنش دمای پایین فعالیت آنزیم‌های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز و پلی‌فنل اکسیداز را در برگ و ساقه استویا افزایش داد. تنش دمای پایین به تجمع متابولیت‌های ثانویه (ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانین‌ها) و فعالیت افزایش یافته آنزیم‌های کلید مسیر بیوسنتزشان (پلی‌فنیل آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز) در برگ و ساقه استویا منجر شد. در پاسخ به تنش دمای پایین، استویا تجمع قند محلول کل، قند احیاء آمینواسید کل و پرولین را در برگ و ساقه افزایش دادند. به طور کلی، برای غلبه بر آسیب‌های ناشی از تنش دمای پایین، مجموعه‌ای از مکانیسم‌های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در گیاه استویا فعال شد که این مکانیسم‌ها می‌توانند برای شناسایی رقم‌های استویا مقاوم به دمای پایین استفاده شوند.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

the identification of physiological and biochemical changes in leave and shoot of stevia under low temperature

نویسندگان [English]

  • Nasrin Shirzadi 1
  • Maryam Nasr Esfahani 2
  • Shokoofeh Hajihashemi 3

1 Biology Department, Faculty of Science, Lorestan University, Khorramabad, Iran

2 Dept. of Biology, Faculty of Science, Lorestan University, Khorramabad, I.R. of Iran.

3 2Plant Biology Department, Faculty of Science, Behbahan Khatam Alanbia University of Technology, Behbahan, Iran

چکیده [English]

Low temperature is one of the important limiting factors of growth, development and distribution of plants. Stevia (Stevia rebaudiana) is a sweet medicinal herb that is cultivated in many parts of world and may experiences low temperature in winter. In this study, we aimed to identify physiological and biochemical changes that occur in Stevia exposed to low temperature and enable the plants to survive at low temperature. Stevia grown in vitro and incubated under controlled conditions at 5, 10 and 25 ºC for one month and then physiological and biochemical indicators in leave and shoot were measured. Low temperature decreased the contents of chlorophyll a, chlorophyll b, total chlorophyll and carotenoids in the leaves. In addition, we observed increased accumulation of hydrogen peroxide and malondialdehyde in leaves and shoot of Stevia exposed to low temperature. Low temperature increased the activities of Superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, polyphenol oxidase and guaiacol peroxidase in leaves and shoot of Stevia. Low temperature lead to increased accumulation of secondary metabolites (phenoloc compounds, flavonoids and anthocyanins) and also increased activities of the enzymes of their biosynthesis pathway (phenylalanine ammonia lyase and Tyrosine ammonia lyase) in leaves and shot of Stevia plants. In response to low temperature, Stevia plant increased the accumulation of total soluble sugar, reducing sugar, total amino acids and proline in their leaves and shoot. In general, to cope with low temperature, Stevia evolved a variety of physiological and biochemical mechanisms that can be suggested to use for identifying cold-tolerant stevia cultivars.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Low temperature
  • Stevia
  • Oxidative stress
  • Antioxidant system
  • Reactive oxygen species

بررسی تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در برگ و ساقه گیاه استویا تحت تنش دمای پایین

نسرین شیرزادی1، مریم نصراصفهانی1*و شکوفه حاجی هاشمی2

1 ایران، خرم­آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

2 ایران، بهبهان، دانشگاه صنعتی خاتم الانبیاء بهبهان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

تاریخ پذیرش: 07/06/1398          تاریخ دریافت: 05/09/1398

چکیده

دمای پایین یکی از فاکتورهای مهم محدود کننده رشد، نمو و پراکنش گیاهان است. استویا (Stevia rebaudiana) یک گیاه علفی دارویی شیرین است که در بسیاری از مناطق جهان کشت می­شود و ممکن است تنش دمای پایین را در زمستان تجربه کند. در این مطالعه، تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که در گیاهان استویا تحت تنش دمای پایین رخ می­دهد و باعث بقاء آنها می­شود مورد بررسی قرارگرفت. استویا برای یک ماه تحت تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد قرار داده شد و شاخص­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در برگ و ساقه اندازه­گیری شد. در دمای پایین محتوی کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در برگ کاهش پیدا کرد. به علاوه، تجمع افزایش یافته پراکسید هیدروژن و مالون دآلدئید در برگ و ساقه استویا در معرض تنش دمای پایین مشاهده شد. تنش دمای پایین فعالیت آنزیم­های سوپراکسید دیسموتاز، کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، گایاکول پراکسیداز و پلی­فنل اکسیداز را در برگ و ساقه استویا افزایش داد. تنش دمای پایین به تجمع متابولیت­های ثانویه (ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها) و فعالیت افزایش یافته آنزیم­های کلیدی مسیر بیوسنتزشان (پلی­فنیل آمونیالیاز و تیروزین آمونیالیاز) در برگ و ساقه استویا منجر شد. در پاسخ به تنش دمای پایین، استویا تجمع قند محلول کل، قند احیاء آمینواسید کل و پرولین را در برگ و ساقه افزایش دادند. به طورکلی، برای غلبه بر آسیب­های ناشی از تنش دمای پایین، مجموعه­ای از مکانیسم­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در گیاه استویا فعال شد که این مکانیسم­ها می­توانند برای شناسایی رقم­های استویا مقاوم به دمای پایین استفاده شوند.

واژه های کلیدی: دمای پایین، استویا، تنش اکسیداتیو، سیستم آنتی­اکسیدانت، گونه­ها فعال اکسیژن

* نویسنده مسئول، تلفن: 09131103870، پست الکترونیکی:  Esfahani.m@lu.ac.ir

مقدمه

 

دمای پایین (سرمازدگی) که به دمای بین 0 تا 15 درجه سانتیگراد اطلاق می­شود، یکی از مهمترین تنش­های محیطی است که باعث کاهش رشد و تولید محصول در بسیاری از گیاهان مهم از نظر اقتصادی می­شود (18). گیاهان به عنوان موجودات بی­حرکت تغییرات دمایی را در محیط اطرافشان تشخیص داده و سپس به آن تغییرات پاسخ می­دهند و تعادل دمایی مناسب را در درون سلول­هایشان برقرار می­کنند. این تعادل سلولی از طریق تنظیمات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی ایجاد می­شود (18). دمای پایین تغییراتی را در ساختار غشاء سلولی و ترکیب لیپیدهای غشاء، نشت الکترولیت­ها و آمینواسیدها، محتوی پروتئین­ها و فعالیت­های آنزیمی و همچنین تغییرات در یک طیف گسترده­ای از اجزاء سلولی نظیر پلاستیدها، غشاءهای تیلاکوئیدی، فسفریلاسیون پروتئین­های تیلاکوئیدی و میتوکندری‌ها ایجاد می­کند (37). به علاوه، دمای پایین باعث ایجاد اختلال در فعالیت­های متابولیکی در گیاهان می­گردد به عنوان مثال، میزان فتوسنتز در دماهای پایین کاهش می­یابد که به تشکیل انرژی برانگیختگی اضافی در گیاهان منجر می­شود (32). تنش سرمازدگی میزان تولید گونه­های فعال اکسیژن (ROS) مانند رادیکال­های آنیون سوپراکسید (O2•−)، پراکسید هیدروژن (H2O2) و رادیکال­های هیدروکسیل (OH)  را در بخش­های مختلف سلول نظیر کلروپلاست­ها، پراکسی­زوم و میتوکندری افزایش می­دهد (11). اگرچه تولید پیوسته ROS در سطح غیرسمی به عنوان یک سیگنال برای ارتباطات سلول به سلول عمل می­کند ولی تجمع مقادیر بالای ROS در محیط سلولی باعث تنش اکسیداتیو می­شود که فعالیت­های متابولیکی ضروری برای سلول و نتیجتا بقاء سلول را تحت­تأثیر قرار می­دهد (11). گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو ایجاد شده به واسطه تنش دمای پایین مکانیسم­های محافظتی گوناگون شامل سیستم آنتی اکسیدانتی آنزیمی و غیرآنزیمی را فعال می­کنند. از مهم­ترین آنزیم­های آنتی اکسیدانتی دخیل در حذف ROS می توان به سوپراکسید دیسموتاز ((SOD، گایاکول پراکسیداز ((GPX، پلی فنل اکسیداز (PPO)، کاتالاز (CAT) و آسکوربات پراکسیداز ((APX اشاره کرد. رادیکال­های آزادO2•− ابتدا توسط SOD به H2O2 که یک مولکول غیررادیکالی است تبدیل کرده و در نهایت H2O2 تولید شده توسط آنزیم­های CAT، APX، GPX وPPO به آب و اکسیژن تبدیل می­شود (14). از سیستم­های آنتی­اکسیدانتی غیرآنزیمی می­توان به متابولیت­های ثانویه مانند ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها اشاره کرد که در نتیجه فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیا لیاز PAL)) و یا تیروزین آمونیا لیاز (TAL) به وجود می­آیند و نقش بسزایی در سیستم دفاعی سلول­های گیاهی در مقابل ROS بازی می­کنند (11). گیاهان مقادیر زیادی از انواع مختلف محلول­های سازگار را در پاسخ به تنش­های مختلف محیطی از جمله دمای پایین انباشته می­کنند. محلول­های سازگار ترکیبات آلی محلول با وزن مولکولی پایین هستند که معمولاً در غلظت­های بالا در سلول­های گیاهی سمیت ایجاد نمی­کنند. این محلول­ها از طریق تعدیل و تنظیم اسمتیک سلولی، پاکسازی ROS، محافظت از یکپارچگی غشاءها و ثبات آنزیم­ها و پروتئین­ها از گیاهان در مقابل تنش­های محیطی محافظت می­کنند. از محلول­های سازگار می­توان به پرولین، سوکروز، پلی­ال­ها، ترهالوز، گلیسین بتائین و آلانین اشاره کرد (21). به هرحال، تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که گیاهان برای مقابله با تنش دمای پایین استفاده می­کند بسته به نوع گونه گیاهی، شدت تنش و دوره تنش متفاوت است و شناسایی این تغییرات برای هر گونه گیاهی می­تواند به متخصصان بیوتکنولوژی کمک کند که بتوانند از طریق روش­های مهندسی ژنتیک گیاه مقاوم به تنش سرما ایجاد کنند.

استویا (Stevia rebadiana Bertoni) یک گیاه چندساله دارویی شیرین متعلق به خانواده آستراسه و بومی مناطق پاراگوئه، برزیل و آرژانتین با آب و هوایی نیمه گرمسیری با زمستان­های ملایم است. برگ­های استویا دارای گلیکوزیدهای دی­ترپن یا گلیکوزیدهای استویول شیرین است که محلول در آب بوده و تقریباً 150 تا 300 مرتبه شیرین­تر از شکر هستند. علاوه بر مزه شیرین برای این گیاه فعالیت­های آنتی اکسیدانی گزارش شده است (20). امروزه استویا به دلیل ارزش دارویی­اش در سراسر جهان کشت می­شود و احتمالاً این گیاه در مناطقی با زمستان­های سرد تنش سرما را تجربه می­کند بنابراین در این مطالعه پاسخ­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه استویا در مواجهه با دمای پایین مورد بررسی قرارگرفت. شناسایی شاخص­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که توسط تنش سرما در گیاه استویا تحت ­تاثیر قرار می­گیرد به محققان کمک می­کند که رقم­های استویای حساس و مقاوم به سرما را شناسایی کنند. به علاوه، شناسایی این شاخص­ها مسیر را برای تولید رقم­های استویای مقاوم به سرما توسط روش­های بیوتکنولوژی مدرن و یا دستکارهای ژنتیکی تسهیل می­کند.

مواد و روشها

به منظور بررسی تأثیر تنش دمای پایین روی پاسخ­های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه استویا (S. rebaudiana) رقم 1 که از بانک ژن استویا، کشور بلژیک (EUSTAS Stevia Gene Bank) تهیه شد، این تحقیق به صورت یک طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار اجرا شد. ابتدا بذرهای استویا را چندین مرتبه با آب معمولی شسته و سپس با الکل 70 درصد (برای مدت 30 ثانیه) و محلول 20 درصد حجمی وایتکس (هیپوکلریت سدیم) (برای مدت 15 دقیقه) ضدعفونی کرده و مجدداً در زیر دستگاه لامینار ایرفلو سه مرتبه با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. بذرهای ضدعفونی شده در ظرف­های حاوی محیط کشت پایه MS (30) کشت شدند و در اتاق کشت با دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای 2±25 درجه سانتیگراد و نور µmol m-2 s-1 90 نگهداری شدند. برای ریزازدیادی و تولید انبوه گیاه استویا در شرایط استریل از گیاهان کامل ایجاد شده از کشت بذر استفاده شد. گیاهان دو ماهه حاصل از مرحله ریز ازدیادی به مدت یک ماه در اتاقک های رشد با شرایط دمایی یکسان شب و روز تحت تأثیر تیمارهای دمایی 5 و 10 درجه سانتیگراد قرارگرفتند و گیاهان رشد یافته در دمای 25 درجه سانتیگراد به عنوان شاهد استفاده شدند (21). برگ و ساقه گیاهان نگهداری شده به مدت یک ماه تحت تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد جدا شده و در فریزر ºC 80- برای اندازه­گیری شاخص­های فیزیولوژیکی و بیوشیمایی نگهداری شدند.

اندازه­گیری میزان قند کل، قند احیاء و پرولین و آمینواسیدهای آزاد: میزان قند کل و احیاء در نمونه­ها به ترتیب مطابق روش­های البالاسمه و همکاران (2013) و دابیوس و همکاران (1956) اندازه­گیری شد (4و 13). برای اندازه­گیری میزان پرولین از روش باتس و همکاران (1973) استفاده شد (5). مقدار آمینواسیدهای آزاد براساس رنگ سنجی با نین هیدرین در طول موج 570 نانومتر اندازه­گیری شد (21).

اندازه­گیری پراکسید هیدروژن (H2O2)، مالون­دآلدئید ((MDA و ظرفیت آنتی­اکسیدانت کل: میزان H2O2 و MDA در نمونه­ها مطابق روش ولیکوا و همکاران (2000) اندازه­گیری شد (39). برای اندازه­گیری ظرفیت آنتی­اکسیدانت کل از معرفferric reducing antioxidant power (FRAR) شامل بافر استات 300 میلی­مولار (6/3(pH=، 10 میلی­مولار 2 و 4 و 6-تری­پریدیل-s-تریازین (TPTZ)، 40 میلی­مولار هیدروکلرواستیک اسید و 20 میلی­مولار کلرید آهن استفاده شد. جذب نمونه­ها در طول موج 593 نانومتر خوانده شد (35).

اندازه­گیری میزان فنل کل و فلاونوئیدها: میزان فنل کل با استفاده از روش رنگ­سنجی فولین-سیوکالتو در طول موج 725 نانومتر اندازه­گیری شد (33). میزان فلاونوئیدها توسط اسپکتووفتومتر در سه طول موج 270، 300، 330 نانومتر اندازه­گیری شد (23).

اندازه‌گیری کلروفیل­ها، کاروتنوئیدها و آنتوسانین: کلروفیل­ها و کاروتنوئیدها به وسیله اتانول 96 درصد استخراج و با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتری اندازه­گیری شدند (26). میزان آنتوسیانین براساس روش واگنر (1979) در طول موج 530 نانومتر اندازه­گیری شد (40).

استخراج عصاره جهت اندازه­گیری فعالیت آنزیم­ها: بافت تازه (09/ گرم) در یک هاون چینی سرد با 5/1 میلی لیتر بافر استخراجی سرد که شامل 50 میلی مولار بافر فسفات پتاسیم با (7pH=)، 1 میلی مولار اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA)، 2-1 درصد پلی وینیل پلی پیرولیدون (PVPP) سابیده شده و در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه با دور rpm 14000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدان و میزان پروتئین­های محلول استفاده گردید. میزان پروتئین محلول با استفاده از روش برادفورد (1976) در طول موج 595 نانومتر اندازه­گیری شد (8). فعالیت CAT توسط کاهش غلظت H2O2 در طول موج 240 نانومتر بر انجام گرفت (2). فعالیت APX توسط میزان جذب در طول موج 290 نانومتر براساس اکسیداسیون آسکوربات و کاهش غلظت آسکوربات انجام گرفت (31). فعالیت PPO توسط افزایش در میزان جذب به واسطه اکسیداسیون وابسته به H2O2 پیروگالل در طول موج 430 نانومتر اندازه­گیری شد (39). فعالیت GPX براساس افزایش جذب در طول موج 470 نانومتر به واسطه اکسیداسیون گایاکول انجام گرفت (39). فعالیت آنزیم SOD براساس بازدارندگی نوری نیتروبلو تترازولیوم در طول موج 560 نانومتر اندازه­گیری شد (15). فعالیت آنزیم PAL در طول موج 290 نانومتر براساس میزان تولید سینامیک اسید اندازه­گیری شد (6). فعالیت آنزیم TAL در طول موج 333 نانومتر واکنش براساس تبدیل تیروزین به کوماریک اسید اندازه­گیری شد (6).

تحلیل داده­ها: برای تحلیل داده ها از نرم افزار آماری SPSS نسخه 16 استفاده شد. مقایسه میانگین داده ها براساس آزمون دانکن در سطح آماری 5 درصد) 05/0(P≤ و رسم نمودارها با نرم افزار Excel انجام شد.

نتایج

تأثیرات دمای پایین روی میزان کلروفیل­ها، کاروتنوئیدها و آنتوسیانین­ها در برگ و ساقه گیاه استویا: نتایج نشان داد که در تنش­های دمایی 5 و 10 درجه سانتیگراد، میزان کلروفیلa  برگ به ترتیب 42، 27 درصد، میزان کلروفیلb  برگ به ترتیب 69 و 46 درصد و میزان کلروفیل کل برگ به ترتیب 61 و 32 درصد در مقایسه با شاهد کاهش نشان داد­ند (شکل C-A 1). میزان کاروتنوئیدهای برگ در دمای 5 درجه سانتیگراد 49 درصد نسبت به شاهد کاهش نشان داد (شکل D-1). میزان آنتوسیانین­ها در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 264 و 82 درصد افزایش را در برگ و به ترتیب 125 و 87 درصد افزایش را در ساقه در مقایسه با شاهد نشان داد (شکل E-1).

 

شکل1- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی میزان (A) کلروفیل a ، (B) کلروفیل b ، (C) کلروفیل کل و (D)کاروتنوئید برگ و (E) میزان آنتوسیانین برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگین­ها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیرمشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنی­دار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است. FW: وزن تازه بافت

 

تأثیرات دمای پایین روی میزان H2O2 و MDA در برگ و ساقه گیاه استویا: میزان H2O2 در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 244 و 65 درصد در برگ و به ترتیب 29 و 30 درصد در ساقه در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل A-2). میزان MDA برگ در تیمار دمایی 5 درجه سانتیگراد 87 درصد افزایش را در مقایسه با شاهد نشان داد و میزان آن در ساقه در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 62 و 82 درصد افزایش نشان داد (شکلB-2).

 

شکل2- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی میزان (A) پراکسید هیدروژن (H2O2) و (B) مالون­دآلدئید (MDA) برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگین­ها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیر مشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنی­دار در سطح 5 درصد  بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است. FW: وزن تازه بافت

 

تأثیرات دمای پایین روی میزان پرولین، آمینواسید کل، قند محلول کل، قند  احیاء و پروتئین محلول کل در برگ و ساقه گیاه استویا: میزان پرولین برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 1265 و 464 درصد و در ساقه به ترتیب 289 و135 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل A-3). نتایج حاصل از سنجش اسیدهای آمینه کل در برگ و ساقه گیاه استویا نشان داد که میزان اسید آمینه کل برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 91 و 109 درصد و در ساقه به ترتیب 451 و 207 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل B-3). میزان قند محلول کل برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 326 و 233 درصد و در ساقه به ترتیب 480 و 240 درصد در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل C-3). همچنین، در تیمارهای دمایی 5 و 10 درجه سانتیگراد، میزان قند احیا در برگ به ترتیب 482 و 307 درصد و در ساقه به ترتیب 456 و 421 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل D-3). نتایج این مطالعه نشان داد که میزان پروتئین محلول برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد تفاوت معنی­داری را با میزان آن در شاهد نشان نداد ولی میزان آن در ساقه در دمای 5 درجه سانتیگراد 102 درصد در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل E-3).

 

شکل3- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی میزان (A) پرولین، (B) آمینواسید کل، (C) قند محلول کل، (D) قند احیاء و (E) پروتئین محلول کل برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگین­ها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیرمشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنی­دار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است. FW: وزن تازه بافت

 

تأثیرات دمای پایین روی میزان فنل کل و فلاونوئیدها و فعالیت آنزیم های PAL و TAL در برگ و ساقه گیاه استویا: نتایج آزمایشات این تحقیق نشان داد که میزان فنل کل برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 108 و 61 درصد و در ساقه به ترتیب 318 و 246 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل A-4). میزان فلاونوئیدهای برگ در طول موج 300 و 330 نانومتر در دمای 5 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 114 و 165 درصد افزایش یافته و میزان فلاونوئیدهای ساقه در طول موج 300 و 330 نانومتر در دمای 5 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 170 و 230 درصد افزایش نشان داده است (شکل B-4).

نتایج نشان داده که میزان آنزیم PAL برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 308 و 173 درصد افزایش یافته و فعالیتش در ساقه در دمای 5 درجه سانتیگراد 21 درصد در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل C-4). میزان فعالیت آنزیم TAL برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 161 و 237 درصد و در ساقه به ترتیب82 و 73 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل D-4)

 

شکل4- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی میزان (A) فنل کل (میکروگرم/گرم بافت تازه)، (B) فلاونوئید، (C) فنیل آلانین آمونیا لیاز (PAL) (میکرومول ترانس سینامیک اسید/گرم بافت تازه/ساعت) و (D) تیروزین آلانین آمونیا لیاز (میکرومول p- کوماریک اسید/گرم بافت تازه/ساعت) (TAL) برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگین­ها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیرمشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنی­دار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است. FW: وزن تازه بافت

 

تأثیرات دمای پایین روی فعالیت­ آنزیم­های آنتی­اکسیدانت و ظرفیت آنتی­اکسیدانت کل در برگ و ساقه گیاه استویا: نتایج مقایسه داده­ها در مورد تأثیر تیمار دمای پائین نشان داد که میزان آنزیم سوپر SOD برگ در دمای 5 درجه سانتیگراد نسبت به شاهد به ترتیب 52 درصد افزایش نشان داد و میزان فعالیت این آنزیم در ساقه در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 55 و 64 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل A-5). فعالیت آنزیم CAT برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 4473 و 491 درصد و در ساقه به ترتیب 6028 و 520 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل B-5). نتایج مقایسه میانگین­ها نشان داد که فعالیت آنزیم APX برگ در دمای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 176 و 264 درصد و در ساقه به ترتیب 750 و 600 درصد نسبت به شاهد افزایش نشان داد (شکل C-5). تحت تیمارهای دمایی 5 و 10 درجه سانتیگراد، فعالیت GPX در برگ به ترتیب 844 و 635 درصد و در ساقه به ترتیب663 و 352 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل D-5). به علاوه، فعالیت PPO در برگ تحت تیمارهای 5 و 10 درجه سانتیگراد به ترتیب 255 و 238 درصد و در ساقه به ترتیب 113 و 138 درصد در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد (شکل E-5). اندازه­گیری ظرفیت آنتی­اکسیدانت کل در پاسخ به تیمارهای 5 و 10 درجه سانتیگراد نشان داد که ظرفیت آنتی اکسیدانت کل در برگ به ترتیب 1785 و 1014 درصد و در ساقه به ترتیب 1066 و 333 درصد در مقایسه با شاهد افزایش نشان داد (شکل F-5).

 

شکل5- تأثیر تیمارهای دمایی 5، 10 و 25 درجه سانتیگراد روی فعالیت (A) سوپراکسیددیسموتاز (SOD) (واحد/گرم بافت تازه)، (B) کاتالاز (CAT) (میکرومول H2O2/دقیقه/گرم بافت تازه)، (C) آسکوربات پراکسیداز (APX) (میکرومول آسکوربات/دقیقه/گرم بافت تازه)، (D) گایاکول پراکسیداز (GPX) (میکرومول تتراگایاکول/دقیقه/گرم بافت تازه)، (E) پلی فنل اکسیداز (PPO) (میکرومول purpurogallin/دقیقه/گرم بافت تازه( و (F) آنتی­اکسیدانت کل (میلی­گرم/ گرم بافت تازه) برگ و ساقه گیاه استویا. مقادیر میانگین چهار تکرار ± SE. مقایسه میانگین­ها در برگ و ساقه به طور مجزا انجام گرفت. حروف غیرمشابه در برگ و ساقه نشان دهنده اختلاف معنی­دار در سطح 5 درصد بر اساس آزمون دانکن بین تیمارها است

 

بحث

نتایج ما در این مطالعه نشان داد که محتوی کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و کاروتنوئیدها در برگ گیاه استویا رشد یافته در دمای پایین به میزان قابل ملاحظه­ای در مقایسه با میزان این رنگیزه­ها در برگ گیاه شاهد کاهش پیدا کرد. در یک مطالعه اخیراً نشان داده شده است که سرعت فتوسنتز در ارقام مختلف گیاه استویا در دمای 5 درجه سانتیگراد به شدت کاهش پیدا می­کند که البته میزان کاهش سرعت فتوسنتز بسته به رقم استویا متفاوت گزارش شده است (20). کاهش میزان رنگیزه­های فتوسنتزی و کاهش انتقال الکترون در تیلاکوئیدها و تثبیت کربن می­تواند یکی از دلایل مهم کاهش سرعت فتوسنتز در گیاهان تحت تنش دمای پایین است (30 و 37). از جمله عواملی که باعث کاهش محتوی رنگیزه­های فتوسنتزی برگ در تنش­های محیطی می­شوند می­توان به تخریب ساختمان کلروپلاست و دستگاه فتوسنتزی، فتواکسیداسیون کلروفیل­ها، تخریب و ویرانی پیش ماده­های تولید کننده کلروفیل و همچنین افزایش فعالیت آنزیم­های تجزیه کننده کلروفیل از جمله کلروفیلاز اشاره نمود (29). به هرحال، در پاسخ به تنش دمای پایین، محتوی کاهش یافته کارتنوئیدهای برگ استویا در مقایسه با سطح کاهش یافته کلروفیل کل برگ کمتر بود که می­توان به نقش کاروتنوئیدهای چرخه گزانتوفیل در آزاد کردن انرژی گرمایی و محافظت کردن از مراکز واکنش فتوسیستم II می­شود اشاره کرد (13).

در این مطالعه، تنش دمای پایین تجمع افزایش یافته H2O2 را در برگ و ساقه گیاه استویا را تحریک کرداز سوی دیگر میزان H2O2 در برگ نسبت به ساقه با شدت گرفتن میزان تنش افزایش قابل توجهی نشان داد که با گزارش مشابهی مبنی بر افزایش میزان H2O2 تحت دمای پایین در گیاهانی مانند گندم مطابقت داشت (23). تنش دمای پایین تولید و تجمع ROS مانند H2O2 را در گیاهان تحت تنش از طریق به هم خوردن تعادل بین جذب نور و استفاده از نور به واسطه بازداشته شدن فعالیت سیکل کالوین، افزایش یافتن جریان انتقال الکترون فتوسنتزی به O2 و احیاء بیش از اندازه زنجیره انتقال الکترون تنفسی افزایش می­دهد و در نتیجه منجر به تنش اکسیداتیو از طریق اکسیداسیون لیپیدها، پروتئین­ها و اسیدهای نوکلئیک می­شود که به ساختارها و ماکرومولکول­های سلولی آسیب وارد کرده و باعث مرگ سلولها می­شود (34). نتایج این تحقیق نشان داد که میزان MDA در برگ و ساقه گیاه استویا تحت تنش دمای پایین به میزان قابل ملاحظه­ای در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد که تأیید کننده لیپید پراکسیداسیون غشاء­های سلولی در گیاه استویا در پاسخ به تنش دمای پایین است. به علاوه، میزان MDA در برگ نسبت به ساقه با تشدید تنش سرما افزایش نشان داد. در توافق با این نتایج، مطالعات انجام شده روی گیاهچه­های ماش (Vigna radiate) به افزایش میزان  MDAتحت تنش دمای پایین اشاره شده است (33). H2O2 و سایر رادیکال­های فعال اکسیژن ترکیبات سمی برای سلول­ها هستند که باید در کمترین زمان و به سرعت توسط سیستم دفاع آنتی اکسیدانی جاروب شوند. در صورتی که توان دفاع آنتی اکسیدانتی سلول­ها اعم از آنزیمی یا غیرآنزیمی برای از بین بردن رادیکال­های فعال اکسیژن کافی نباشد، این رادیکال­ها که بسیار واکنش­گرند با خارج کردن H+ از فسفولیپیدها موجب تشکیل رادیکال فعال اسید چرب شوند و رادیکال اسید چرب در حضور اکسیژن با سنتز پراکسید اسید چرب می­تواند ضمن تخریب چربی­ها و پروتئین­ها رادیکال­های بیش­تری تولید نماید. آلدئیدهایی مانند مالون­دی­آلدئید از جمله محصولات واکنش­های پراکسیداسیون لیپیدها هستند که به عنوان شاخصی برای ارزیابی این واکنش­ها در نظر گرفته می­شوند. در گیاهانی که قادر به سازگاری نباشند روند تولید MDA با افزایش پراکسیداسیون چربی­های غشاء ادامه می­یابد و تداوم این وضعیت موجب از هم گسیختگی ساختار غشاء و خروج آب و یون­ها از سلول می­شود و تداوم این شرایط تنش در نهایت به مرگ سلول منجر می­شود (25). پاسخ گیاه به تنش اکسیداتیو القاء شده توسط دمای پایین شامل افزایش فعالیت آنزیم­های سیستم دفاع آنتی­اکسیدانتی مانند SOD، CAT، APX و GPX می­باشد که با جاوب کردن ROS از تجمع­شان جلوگیری می­کند (44). نتایج پژوهش اخیراً نشان داد که دمای پایین فعالیت آنزیم SOD را در برگ و ساقه گیاه استویا افزایش داد و میزان فعالیت آن در ساقه نسبت به برگ با شدید شدن تنش سرما افزایش بیشتری نشان داد در توافق با این نتایج، مطالعات انجام شده روی تنباکو نیز تأیید کرده است که فعالیت SOD در پاسخ به دمای پایین افزایش می­یابد (43). سوپراکسید دیسموتاز اولین آنزیم­ پاکسازی کننده ترکیبات ROS به شمار می­رود که باعث تبدیل O2•− به H2O2 می­شود، میزان H2O2 تولید شده به وسیله آنزیم­های زیادی کنترل می­شود که CAT و APX از جمله مهم­ترین آن­ها هستند (9). نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم­های CAT، APX، GPX و PPO که در مهار و پاکسازی کردن H2O2 دخالت دارند (11) در پاسخ به تنش دمای پایین در برگ و ساقه گیاه استویا در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد. میزان فعالیت آنزیم GPX و PPO در برگ­ها نسبت به ساقه­های تحت تنش سرما افزایش بیشتری نشان داد در حالیکه آنزیم­های APX و CAT در ساقه نسبت به برگ افزایش بیشتری را نشان دادند. به هرحال، اگرچه دمای پایین باعث شد که فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی (SOD، CAT، APX، GPX و PPO) در برگ و ساقه استویا افزایش پیدا کند و ظرفیت آنتی­اکسیدانتی در برگ و ساقه گیاه استویا در شرایط تنش دمای پایین بالاتر از ظرفیت آنتی اکسیدانتی در گیاه شاهد بود، ولی میزان تجمع H2O2 و MDA در برگ و ساقه استویا تحت تنش دمای پایین هنوز در مقایسه با میزان آنها در گیاه شاهد بالاتر بود که نشان می­دهد افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت به اندازه کافی بالا نبوده که بتواند H2O2 تولید شده تحت تنش دمای پایین را به طور کارآمد پاکسازی کند و از پراکسیداسیون لیپیدهای غشاءهای سلولی جلوگیری کند.

آنزیم­های PAL و TAL اولین مرحله مسیر فنیل پروپانوئید را کاتالیز می­کنند که برای سنتز چندین متابولیت ثانویه مرتبط با سیستم دفاعی مانند فلاونوئیدها و فنل­ها دخالت دارند و سلول­های گیاهی را در مقابل لیپید پراکسیداسیون توسط ROS محافظت می­کنند (17). نتایج این تحقیق نشان داد که به موازات افزایش فعالیت آنزیم­های PAL و TAL در گیاه استویا تحت تنش دمای پایین، میزان تجمع ترکیبات فنلی و فلاونوئیدها نیز در گیاه استویا در پاسخ به دمای پایین در مقایسه با میزان این ترکیبات در گیاه شاهد افزایش پیدا کرد که احتمالاً با تجمع بیشتر ROS در این گیاه در دمای پایین مرتبط می­باشد. میزان ترکیبات فنل کل و فلاونوئیدها در ساقه نسبت به برگ با شدت گرفتن میزان تنش، افزایش بیشتری نشان دادند و میزان فعالیت آنزیم­های PAL و TAL در برگ نسبت به ساقه در تنش شدیدتر سرما افزایش قابل ملاحظه­ای نشان دادند. در یک مطالعه انجام شده روی گیاه استویا تحت تنش خشکی مشخص شد که میزان تجمع ترکیبات فنلی در گیاه استویا در پاسخ به تنش خشکی افزایش نشان داد (19). به علاوه، در گزارشاتی بیان شده است که میزان تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدها که از مشتقات مسیر فنیل پروپانوئید سلول­ها هستند در پاسخ به تنش‏های محیطی نظیر خشکی (38) و کمبود عناصر غذایی (16) افزایش می­یابد به طوری که افزایش غلظت این ترکیبات سبب جاروب کردن ROS و مهار پراکسیداسیون لیپیدها می­‏شوند (7). در شرایطی محیطی مانند دمای پایین که فعالیت فتوسنتزی گیاه کاهش پیدا می­کند، جریان فوتونی وارد شده به درون برگ بیش از توانایی گیاه برای مصرف فوتون می­باشد و بنابراین انرژی برانگیختگی اضافی در درون دستگاه فتوسنتزی ممکن است به عملکرد کلروپلاست آسیب وارد کرده و باعث کاهش سریع کارآیی کوانتومی فتوسیستم II و تولید مقادیر زیادی ROS و نتیجتاً اکسیداسیون نوری می­شود. نتایج مطالعه اخیراً نیز نشان داد که میزان آنتوسیانین در برگ و ساقه گیاه استویا در پاسخ به تنش دمای پایین به میزان قابل ملاحظه­ای در مقایسه با میزان آن در گیاه شاهد افزایش نشان داد.نتایج این تحقیق نشان داد که آنتوسیانین در برگ در مقایسه با ساقه در پاسخ به تنش سرما به میزان بیشتری تجمع پیدا کرد آنتوسیانین­ها که به گروه متابولیت­های ثانویه فلاونوئیدی تعلق دارند، با از بین بردن بخشی از فوتون­های اضافی وارد شده به درون برگ قادرند کلروپلاست­ها را آسیب­های ناشی از فوتون اضافی محافظت کنند (25). به علاوه، یک ارتباط قوی بین تنش دمای پایین و تجمع آنتوسیانی­ها در گیاهان وجود دارد (39). آنتوسیانین­ها از مسیر فنیل پروپانوئید سنتز می­شوند و سنتزشان توسط آنزیم­های کلیدی این مسیر مانند آنزیم PAL کنترل می­شود (3). به این ترتیب، افزایش در تجمع آنتوسیانین در گیاه استویا رشد یافته تحت تنش دمای پایین به فعالیت افزایش یافته آنزیم PAL در این گیاه مرتبط می­باشد.

یکی دیگر از تنش­هایی که به دنبال تنش دمای پایین در گیاهان تحت تنش ایجاد می­شود تنش اسمتیک است که استراتژی مهم گیاهان در مقابل تنش اسمتیک تجمع محلول­های سازگار یا اسمولیت­ها مانند قندها، آمینواسیدها و مشتقات دیگر مانند بتایین است که از تشدید تنش اسمتیک جلوگیری می­کند (37). در این مطالعه، تجمع قابل ملاحظه قندهای محلول و احیاء در برگ و ساقه گیاه استویا در پاسخ به تنش دمای پایین مشاهده شد که با گزارشی مبنی بر تجمع افزایش یافته قندهای محلول در برگ گونه­های گیاهی مختلف در پاسخ با دمای پایین مطابقت داشت (1). تجمع قندها در برگ ممکن است به دلیل بهم خوردن تعادل بین بافت­های منبع و مخزن باشد و سرعت تولید قند از سرعت صادرات قند به برگ­های مخزن تجاوز کند (1).به علاوه، نتایج این تحقیق نشان داد که میزان تجمع قندهای محلول و احیاء در ساقه نسبت به برگ در پاسخ به تنش سرما افزایش بیشتری نشان داد که می­تواند با نقش ساقه به عنوان جایگاهی برای ذخیره کوتاه مدت کربوهیدرات­ها در حین تنش مطابقت داشته باشد (12). همچنین، تجمع قندهای محلول در گیاهان در پاسخ به تنش­های محیطی در تنظیم اسمزی و نیز در ثبات و استحکام غشاءها و ذخیره کربن نقش بازی می­کنند (36).

تنش دمای پایین تجمع آمینواسیدها را در برگ و ساقه گیاه استویا افزایش داد که احتمالاً یک پاسخ به تنش اسمتیک است که به دنبال در معرض قرارگرفتن گیاه استویا در تنش سرما ایجاد می­شود آمینواسیدها یکی دیگر از محلولهای سازگار است که به عنوان اسمولیت در گیاهان تحت تنش­های غیرزیستی نظیر تنش سرما تجمع می­یابد (31). از میان آمینواسیدها، پرولین مهمترین آمینواسیدی است که به عنوان یک محافظت کننده اسمزی نقش مهمی در حفظ تعادل اسمتیک و ثبات ساختارهای سلولی در گیاهان بازی می­کند و گیاهان ­را از آسیب­های ناشی از تنش اسمتیک محافظت می­کند (10) و با عملکردش برای جاروب کردن رادیکال­های آزاد و عمل آنتی اکسیدانتی برای محافظت از گیاه در مقابل تنش اکسیداتیو عمل می کند (22). نتایج ما در این مطالعه نشان داد که دمای پایین باعث شد که پرولین در برگ و ساقه استویا به میزان قابل ملاحظه­ای تجمع پیدا کند که با گزارش ارائه شده برای گیاه Zoysiagrass تحت تنش دمای پایین مطابقت دارد (26). از آنجایی که برگ­ها همواره به عنوان جایگاه اصلی فرایندهای متابولیسمی هستند روند افزایشی در تجمع پرولین در برگ نسبت به ساقه با تشدید تنش سرما مشاهده شد.

نتیجه­گیری

محتوای رنگیزه­های (کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل

و کاروتنوئید) در گیاه استویا تحت شرایط تنش سرما (5 و 10 درجه سانتیگراد) کاهش پیدا کرد که احتمالاً به کاهش در سرعت فتوسنتز منجر می­گردد. تنش سرما باعث شد که گیاه استویا با تنش اکسیداتیو هم روبرو گردد به طوری که افزایش تجمع H2O2 ونیز تجمع MDA در برگ و ساقه مشاهده شد. بنابراین، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت (SOD، CAT، APX، GPX و PPO)، متابولیت­های ثانویه (ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها) و ظرفیت آنتی­اکسیدانت کل در برگ و ساقه گیاه استویا در معرض تنش سرما افزایش پیدا کرد. به علاوه، تجمع قند محلول کل، قند احیاء، آمینواسید کل و پرولین در برگ و ساقه گیاه استویا در معرض تنش دمای پایین افزایش پیدا کرد که احتمالاً یک پاسخ گیاه به تنش اسمتیک است که به واسطه تنش سرما به وجود آمده است. این تغییرات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی که در گیاه استویا در پاسخ به تنش سرما به وجود می­آید یک استراتژی مهم برای به حداقل رساندن آسیب­های حاصل از دمای پایین است به طوری که گیاه بتواند در شرایط تنش زنده باقی بماند و با برطرف شدن شرایط تنش مجدداً رشد اولیه خود را به دست آورد. نتایج این تحقیق اطلاعاتی را فراهم کرد که می­تواند برای شناسایی رقم­های استویای حساس و مقاوم به تنش دمای پایین استفاده شود ضمناً متخصصان بیوتکنولوژی می­تواند از نتایج این تحقیق برای ایجاد رقم­های استویای مقاوم به تنش دمای پایین از طریق دستکاری­های ژنتیکی استفاده کنند.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از معاونت پژوهشی و تحصیلات تکمیلی دانشگاه لرستان به دلیل حمایت مالی از انجام این پژوهش تشکر می­کنند.

  • Adams, W. W., Muller, O., Cohu, C. M., and Demmig-Adams, B., 2013. May photoinhibition be a consequence, rather than a cause, of limited plant productivity? Photosynthesis research, 117, PP: 31-44.
  • Aebi, H., 1984. Catalase in vitro. Methods in enzymology, 105, PP: 121-126.
  • Ahmed, N. U., Park, J. I., Jung, H. J., Hur, Y., and Nou, I. S., 2015. Anthocyanin biosynthesis for cold and freezing stress tolerance and desirable color in Brassica rapa, Functional & integrative genomics, 15, PP: 383-394.
  • Albalasmeh, A. A., Berhe, A. A., and Ghezzehei, T. A., 2013. A new method for rapid determination of carbohydrate and total carbon concentrations using UV spectrophotometry. Carbohydrate Polymers, 97, PP: 253-261.
  • Bates, L. S., Waldren, R. P., and Teare, I. D., 1973. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39, PP: 205-207.
  • Beaudoin-Eagan, L. D., and Thorpe, T. A., 1985. Tyrosine and phenylalanine ammonia lyase activities during shoot initiation in tobacco callus cultures, Plant Physiology, 78, PP: 438-441.
  • Blasco, B., Leyva, R., Romero, L., and Ruiz, J. M., 2013. Iodine efects on phenolic metabolism in lettuce plants under salt stress, Journal of agricultural and food chemistry, 61, PP: 2591-2596.
  • Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Analytical biochemistry, 72, PP: 248-254.
  • Cook, D., Fowler, S., Fiehn, O., and Thomashow, M. F., 2004. A prominent role for the CBF cold response pathway in configuring the low-temperature metabolome of Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,101, PP: 15243-15248.
  • Dar, M. I., Naikoo, M. I., Rehman, F., Naushin, F., and Khan, F. A., 2016. Proline Accumulation in Plants: Roles in Stress Tolerance and Plant Development. In Osmolytes and Plants Acclimation to Changing Environment: Emerging Omics Technologies (Iqbal, N., Nazar, R. and A. Khan, N., eds), New Delhi: Springer India, PP: 155-166.
  • Das, K., and Roychoudhury, A., 2014. Reactive oxygen species (ROS) and response of antioxidants as ROS-scavengers during environmental stress in plants. Frontiers in environmental science, 2, PP: 1-13.
  • Davidson, D., and Chevalier, P., 1992. Storage and remobilization of water-soluble carbohydrates in stems of spring wheat. Crop Science 32, PP: 186-190.
  • Demmig-Adams, B., and Adams, W. W., 2006. Photoprotection in an ecological context: the remarkable complexity of thermal energy dissipation, The New phytologist, 172, PP: 11-21.
  • Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., and Smith, F., 1956. Colorimetric method for determination of sugar and related substances, Recent research developments in analytical chemistry, 28, PP: 350–356.
  • Erdal, S., Genisel, M., Turk, H., Dumlupinar, R., and Demir, Y., 2015. Modulation of alternative oxidase to enhance tolerance against cold stress of chickpea by chemical treatments, Journal of plant physiology, 175, PP: 95–101.
  • Giorgi, A., Mingozzi, M., Madeo, M,. Speranza, G., and Cocucci, M., 2009. Effect of nitrogen starvation on the phenolic metabolism and antioxidant properties of yarrow (Achillea collina Becker ex Rchb.), Food Chemistry, 114, PP: 204-211.
  • Golan, K., Sempruch, C., Górska-Drabik, E., Czerniewicz, P,. Łagowska, B., Kot, I., Kmieć, K., Magierowicz, K., and Leszczyński, B., 2017. Accumulation of amino acids and phenolic compounds in biochemical plant responses to feeding of two different herbivorous arthropod pests. Arthropod-Plant Interactions, 11, PP: 675-682.
  • Guy, C., Kaplan, F., Kopka, J., Selbig, J., and Hincha, D. K., 2008. Metabolomics of temperature stress. Physiologia Plantarum, 132, PP: 220–235.
  • Hajihashemi, S., and Ehsanpour, A. A., 2014. Antioxidant response of Stevia rebaudiana B. to polyethylene glycol and paclobutrazol treatments under in vitro culture, Applied biochemistry and biotechnology, 172, PP: 4038-4052.
  • Hajihashemi, S., Noedoost, F., Geuns, J. M. C., Djalovic, I., and Siddique, K. H. M., 2018. Effect of Cold Stress on Photosynthetic Traits, Carbohydrates, Morphology, and Anatomy in Nine Cultivars of Stevia rebaudiana, Frontiers in Plant Science, 9
  • Hayat, S., Hayat, Q., Alyemeni, M. N., Wani, A. S., Pichtel, J., and Ahmad, A., 2012. Role of proline under changing environments: a review. Plant signaling & behavior, 7, PP: 1456-1466.
  • Hossain, M. A., Hoque, M. A., Burritt, D. J., and Fujita, M., 2014. Proline protects plants against abiotic oxidative stress: biochemical and molecular mechanisms, In Oxidative damage to plants: Elsevier, PP: 477-522.
  • Kader, D. Z. A., Saleh, A. A. H., Elmeleigy, S. A., and Dosoky, N. S., 2011. Chilling-induced oxidative stress and polyamines regulatory role in two wheat varieties, Journal of Taibah University for Science, 5, PP: 14-24.
  • Landi, M., Tattini, M., and Gould, K. S., 2015. Multiple functional roles of anthocyanins in plant-environment interactions, Environmental and experimental botany. 119, PP: 4-17.
  • Li, Q. Y., Niu, H. B., Yin, J., Wang, M. B., Shao, H. B., Deng, D. Z., Chen, X. X., Ren, J. P., and Li, Y. C., 2008. Protective role of exogenous nitric oxide against oxidative-stress induced by salt stress in barley (Hordeum vulgare), Colloids and surfaces, B, Biointerfaces. 65, PP: 220-225.
  • Li, S., Yang, Y., Zhang, Q., Liu, N., Xu, Q., and Hu, L., 2018. Differential physiological and metabolic response to low temperature in two zoysiagrass genotypes native to high and low latitude, PloS one, 13, PP: e0198885-e0198885.
  • Lichenthaler, H. K., and Wellburn, A. R., 1983. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents. Biochemical Society transactions, 11, PP: 591-592.
  • Murashige, T., and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum. 15, PP: 473-497.
  • Neocleous, D., and Vasilakakis, M., 2007. Effects of NaCl stress on red raspberry (Rubus idaeus L. ‘Autumn Bliss’), Scientia horticulturae, 112, PP: 282-289.
  • Nievola, C. C., Carvalho, C. P., Carvalho, V., and Rodrigues, E., 2017. Rapid responses of plants to temperature changes. Temperature (Austin, Tex.), 4, PP: 371-405.
  • Ruelland, E., Vaultier, M. N., Zachowski, A., and Hurry, V., 2009. Chapter 2 cold signalling and cold acclimation in plants. In Advances in Botanical Research: Academic Press, PP: 35-150.
  • Ruelland, E., and Zachowski, A., 2010. How plants sense temperature. Environmental and experimental botany, 69, PP: 225–23.
  • Saleh, A. A., 2007. Amelioration of chilling injuries in mung bean (Vigna radiata L.) seedlings by paclobutrazol, abscisic acid and hydrogen peroxide. Am., Journal of Plant Physiology, 2, PP: 318-332
  • Sharma, P., Jha, A. B., Dubey, R. S., and Pessarakli, M., 2012. Reactive oxygen species, oxidative damage, and antioxidative defense mechanism in plants under stressful conditions. Journal of experimental botany, PP: 1-12.
  • Singleton, V. L., and Rossi, J. A., 1965. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents, American Journal of Enology and Viticulture, 16, PP: 144-153.
  • Slama, I., Abdelly, C., Bouchereau, A., Flowers, T., and Savoure, A., 2015. Diversity, distribution and roles of osmoprotective compounds accumulated in halophytes under abiotic stress. Annals of Botany, 115, PP: 433-447.
  • Theocharis, A., Clement, C., and Barka, E. A., 2012. Physiological and molecular changes in plants grown at low temperatures, Planta, 235, PP: 1091-1105.
  • Tomar, N. S., and Agarwal, R., 2013. Influence of treatment of Jatropha curcas L., leachates and potassium on growth and phytochemical constituents of wheat (Triticum aestivum L.). American Journal of Plant Sciences, 4, PP: 1134-1150.
  • Ubi, B. E., Honda, C., Bessho, H., Kondo, S., Wada, M., Kobayashi, S., and Moriguchi, T., 2006. Expression analysis of anthocyanin biosynthetic genes in apple skin: Effect of UV-B and temperature. Plant science : an international journal of experimental plant biology, 170, PP: 571-578.
  • Velikova, V., Yordanov, I., and Edreva, A., 2000. Oxidative Stress and Some Antioxidant Systems in Acid Rain- Treated Bean Plants: Protective Role of Exogenous Polyamines. Plant science : an international journal of experimental plant biology, 151, PP: 59-66.
  • Veljovic-Jovanovic, S. D., Pignocchi, C., Noctor, G., and Foyer, C. H., 2001. Low Ascorbic Acid in the vtc-1 Mutant of Arabidopsis Is Associated with Decreased Growth and Intracellular Redistribution of the Antioxidant System. Plant Physiology, 127, PP: 426-435.
  • Wagner, G. J., 1979. The subcellular site and nature of intracellular cadmium in plants. Trace Substances in Environmental Health, 12, PP: 115-123.
  • Xu, S. C., Li, Y. P., Hu, J., Guan, Y. J., Ma, W. G., Zheng, Y. Y., and Zhu, S. J., 2010. Responses of antioxidant enzymes to chilling stress in tobacco seedlings. Agricultural Sciences in China, 9, PP: 1594-1601.
  • Yang, Q., Rao, J., Yi, S., Meng, K., Wu, J., and Hou, Y., 2012. Antioxidant enzyme activity and chilling injury during low-temperature storage of Kiwifruit cv., Hongyang exposed to gradual postharvest cooling. Horticulture, environment and biotechnology, 53, PP: 505-512.
دوره 34، شماره 2
مرداد 1400
صفحه 467-480
  • تاریخ دریافت: 27 بهمن 1397
  • تاریخ بازنگری: 07 شهریور 1398
  • تاریخ پذیرش: 05 آذر 1398