مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

مطالعه تشریحی گیاه بادرنجبویه(.Melissa officinalis L) در مراحل مختلف نموی و تاثیر تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید بر برخی ویژگی‌های ریخت شناسی و مولکولی آن

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم‌پایه، دانشگاه گیلان

2 دانشگاه تبریز -گروه زیست شناسی

3 دانشگاه گیلان

چکیده

بادرنجبویه از گیاهان دارویی مهمی است که باتوجه به عدم وجود مطالعات تکوینی در این گیاه، پژوهش حاضر نخست در جهت شناخت ساختار تشریحی و سپس نحوه پاسخ‌دهی آن به تنش خشکی (صفر،fc 2/3،fc 1/3) و تاثیر کاربرد خارجی سالیسیلیک اسید ( صفر، 0.7و 1/5 میلی مولار) صورت گرفت. برای این منظور بذر گیاه بادرنجبویه پس از استریلیزاسیون در گلدان‌های مناسب کشت گردید و اعمال تنش خشکی تیمار سالیسیلیک اسید در مرحله شش برگی انجام شد. همزمان تعدادی گلدان بدون تیمار برای مطالعات تشریحی کشت شد. آزمایشات به صورت فاکتوریل اسپلیت بلات در زمان با سه تکرار انجام شد. تشریح اندام های بادرنجبویه تشابه این گیاه با دیگر گیاهان خانواده نعناعیان را نشان داد و با پیشرفت مرحله نموی بتدریج بر ضخامت بافت‌های استحکامی افزوده گردید و در ساقه، پیدایش یک دسته آوند چوب و آبکش جدید در حد فاصل دستجات آوندی قدیمی تایید شد. درقسمت بررسی تنش ها بر بافت شناسی، کاهش قطر دهانه آوند چوبی و افزایش طول کرک‌ها مشاهده شد که تیمار سالیسیلیک اسید درکاهش آثار ناشی از تنش خشکی بسیار مطلوب بود. مطالعات مولکولی به کمک تکنیک qRT-PCR نشان داد که بیان ژن تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) تغییر قابل ملاحظه‌ای در شرایط تنش نداشته و بیشترین مقدار بیان آن در شرایط تنش خشکیfc 2/3 و غلظتmM0.7 سالیسیلیک اسید مشاهده شد. می‌توان نتیجه گرفت تیمار سالیسیلیک اسید بر مطالعات بافت شناسی، در گیاهان تحت تنش خشکی اثر مثبت داشته، ولی بر روی بیان ژن TAT در گیاهان تحت تنش خشکی تاثیر معنی‌دار نداشته است.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Study of anatomical structure of Melissa officinalis and the effects of drought stress and salicylic acid treatment on its morphological and molecular characteristics

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Jamal Omidi 1
  • Hanieh Mohajjel shoja 2
  • Reihaneh Sariri 3

1 Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran

2 departement of natural science, university of tabriz

3 University of Guilan

چکیده [English]

Melissa officinalis L. is an important medicinal plant. Due to the lack of developmental studies in this plant, the present study was first used to identify the structure and then how to respond to drought stress (0, fc 2/3, fc 1/3) and the effect External application of salicylic acid (0, 0.7 and 1.5 mM). For this purpose, the seeds of lemon balm were cultured in appropriate pots after sterilization .At the same time, a number of untreated pots were cultivated for anatomical studies. Experiments were performed as split plot split factorial with three replications. The description showed the similarity of this plant with other plants of the family of Lamiaceae, and with the advancement of the stage of development, gradually, the thickness of the sclerenchyma tissue was increased, In the study of stresses on histology, decreasing the diameter of the xylem and increasing the length of the trichomes, salicylic acid treatment was highly desirable in reducing the effects of drought stress. Molecular studies using the qRT-PCR technique showed that the expression of tyrosine aminotransferase (TAT) gene was not significantly altered under stress conditions and the highest expression was observed in drought stress conditions of 2/3 fc and salicylic acid 0.7 mM. It can be concluded that salicylic acid treatment has a positive effect on histological studies in plants under drought stress, but has no significant effect on TAT gene expression in plants under drought stress.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Melissa officinalis
  • Drought stress
  • Salicylic acid
  • Anatomy
  • TAT gene

مطالعه تشریحی گیاه بادرنجبویه(Melissa officinalis L.) در مراحل مختلف نموی و تاثیر تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید بر برخی ویژگی­های

ریخت شناسی و مولکولی آن

فاطمه جمال امیدی1، هانیه محجل شجاء1* و ریحانه سریری2

1 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه علوم گیاهی

2 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 26/12/1397          تاریخ پذیرش: 13/07/1398

چکیده

بادرنجبویه از گیاهان دارویی مهمی است که باتوجه به عدم وجود مطالعات تکوینی در این گیاه، پژوهش حاضر نخست در جهت شناخت ساختار تشریحی و سپس نحوه پاسخ­دهی آن به تنش خشکی (صفر،fc  3/2،fc 3/1) و تاثیر کاربرد خارجی سالیسیلیک اسید ( صفر، 7/0 و 5/1 میلی مولار) صورت گرفت. برای این منظور بذر گیاه بادرنجبویه پس از استریلیزاسیون در گلدان­های مناسب کشت گردید و اعمال تنش خشکی تیمار سالیسیلیک اسید در مرحله شش برگی انجام شد. همزمان تعدادی گلدان بدون تیمار برای مطالعات تشریحی کشت شد. آزمایشات به صورت فاکتوریل اسپلیت بلات در زمان با سه تکرار انجام شد. تشریح اندام های بادرنجبویه تشابه این گیاه با دیگر گیاهان خانواده نعناعیان را نشان داد و با پیشرفت مرحله نموی بتدریج بر ضخامت بافت­های استحکامی افزوده گردید و در ساقه، پیدایش یک دسته آوند چوب و آبکش جدید در حد فاصل دستجات آوندی قدیمی تایید شد. درقسمت بررسی تنش ها بر بافت شناسی، کاهش قطر دهانه آوند چوبی و افزایش طول کرک­ها مشاهده شد که تیمار سالیسیلیک اسید درکاهش آثار ناشی از تنش خشکی بسیار مطلوب بود. مطالعات مولکولی به کمک تکنیک qRT-PCR نشان داد که بیان ژن تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) تغییر قابل ملاحظه­ای در شرایط تنش نداشته و بیشترین مقدار بیان آن در شرایط تنش خشکیfc 3/2 و غلظتmM 7/0 سالیسیلیک اسید مشاهده شد. می­توان نتیجه گرفت تیمار سالیسیلیک اسید بر مطالعات بافت شناسی، در گیاهان تحت تنش خشکی اثر مثبت داشته، ولی بر روی بیان ژن TATدر گیاهان تحت تنش خشکی تاثیر معنی­دار نداشته است.

واژه های کلیدی: بادرنجبویه، خشکی، سالیسیلیک اسید، ساختار تشریحی، ژن TAT

* نویسنده مسئول، تلفن:  09141187433  ، پست الکترونیکی:  mohajelh@yahoo.com

مقدمه

 

بادرنجبویه یا Lemon balm، با نام علمیL. Melissa officinalisگیاه دارویی به خوبی شناخته شده از خانواده نعناعیان (Lamiaceae) می­باشد که بصورت بوته­ای و چند ساله تا ارتفاع حدود 1 متر رشد می­کند. برگ­های قلبی شکل این گیاه نرم و کرکدار بوده و 2 الی 8 سانتی­متر طول دارند. سطح برگ­ها، بزرگ و دارای رگه­های عمیق می­باشد و لبه ها­ی آنها تیز و دندانه­دار است. گل­های سفید یا صورتی کمرنگ آن حاوی خوشه­های کوچک دارای 4 الی 12 شکوفه می­باشند. طعم و عطر این گیاه شبیه به لیمو بوده و همین امر در نامگذاری آن نقش داشته است (60و64). خشکی یکی از مهمترین استرس­های غیر­زیستی است که رشد و تکوین گیاه را تحت تاثیر قرار می­دهد (19و40). در سطح یاخته­ای، پاسخ گیاه به کمبود آب می­تواند به صورت آسیب­های یاخته­ای (کوچک شدن یاخته) ظاهر شود، به طوریکه اندازه سلول در جریان کمبود آب از آوند چوب به سلول­های اطراف محدود گردد و تقسیم سلولی کاهش یابد (31و 51و 39). درپژوهشMakbul و همکاران روی گیاهان سویای تحت تنش کم آبی گزارش شده است که کورتکس این گیاهان توسط یک لایه کلانشیم، 4 تا 5 ردیف سلول های پارانشیم تخم مرغی شکل با فضای بین سلولی تشکیل شده است که نسبت به گیاهان شاهد افزایش در ضخامت پوست دیده شده است (43). تنش کم آبی در برگ های زیتون به افزایش تراکم کرک، کاهش اندازه سلول­های بشره­ای و مزوفیلی منجر می شود (12). Al-Khalifah و همکاران نشان دادند که تنش کم آبی در comosum Calligonum باعث افزایش شدید تعداد آوند­های چوب باریک و بسیار باریک با دیواره سلولی ضخیم می­شود (7). موفقیت گونه های گیاهی در شرایط تنش بستگی به تعداد فراوان آوند­های چوبی و همچنین باریک بودن این آوند­ها دارد. SA یک ترکیب فنلی است که در تکوین و رشد گیاه نقش دارد و پاسخ دهی گیاه را نسبت به عوامل زیستی و غیر زیستی سازماندهی می­کند (45) و به عنوان مولکول سیگنالی، اثر گذاری مطلوبی بر رشد و گسترش گیاه دارد (37). همچنین، تقسیم و مرگ سلولی را نیز تنظیم کرده و در واقع بین رشد و پیری تعادل ایجاد می­نماید (53). خصوصیات دارویی گیاه بادرنجبویه به دلیل وجود طیف وسیعی از مواد موثره در آن می باشد که مهمترین آنها ترکیبی به نام رزمارینیک اسید است که استر کافئیک اسید و 3و 4 دی هیدروکسی فنیل لاکتیک اسید می باشد. بیوسنتز رزمارینیک اسید از دو اسیدآمینه­ی فنیل-آلانین و تیروزین آغاز می­شود که آنزیم­های کلیدی درگیر آن، آنزیم فنیل آلانین آمینو لیاز (PAL) و آنزیم تیروزین آمینو ترانسفراز (TAT) می باشند (63و62). به دلیل اهمیت دارویی و کاربردهای صنعتی رزمارینیک اسید، تولید آن در گونه­های گیاهی مختلف و در شرایط تیماری متفاوت مورد بررسی قرار گرفته که می توان به مواردی همچون تاثیر یونهای آهن بر محتوای رزمارینیک اسید در گیاهچه­هایofficinalis Melissa(56)، تاثیر نانوذرات گوناگون در تولید رزمارینیک اسید در گونه­های گیاهی (46و37و42) و تاثیر عصاره مخمر در تولید این متابولیت در گیاهان مختلف (49) اشاره نمود. پژوهش­های متعددی تاثیر کاربرد خارجی سالیسیلیک اسید را در گیاهان، مورد بررسی قرار داده و به این نتیجه رسیده­اند که این ترکیب نقش حفاظتی در گیاهان تحت تنش دارد و سبب مقاومت به تنش شوری در گیاهچه­های گندم (58) تحمل به گرما در توتون (15) و مقاومت به تنش خشکی در گوجه فرنگی (26) می­گردد. البته گونه گیاهی و مرحله نموی آن، همچنین غلظت سالیسیلیک اسید و نحوه استعمال آن در نحوه­ی پاسخ­دهی به تیمار سالیسیلیک اسید متفاوت است (39و29و27). با توجه به استقرار جغرافیایی ایران در منطقه خشک و نیمه خشک و مواجهه با شرایط کم آبی، لزوم استفاده از راهکارهایی جهت افزایش مقاومت گیاهان به تنش خشکی امری ضروری و اجتناب ناپذیر است. علی رغم کاربرد دارویی وسیع گیاه بادرنجبویه در سطح کشور، مطالعات تکوینی-تشریحی در مورد آن بسیار اندک بوده و تاثیر تنش کم آبی در رشد و نمو این گیاه تابحال مورد بررسی قرار نگرفته است. هدف از پژوهش حاضر، مطالعه خصوصیات تکوینی- تشریحی اندام­های مختلف گیاه بادرنجبویه در مراحل متفاوت نموی و بررسی تاثیر تنش خشکی بر برخی پارامترهای رشدی و خصوصیات مولکولی این گیاه در حضور یا عدم حضور سالیسیلیک اسید می­باشد.

مواد و روشها

تهیه بذر­ها و ضد عفونی کردن آنها: بذر گیاه بادرنجبویه از مرکزتحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان گیلان تهیه گردید. بذر­ها درون آب و مایع ظرفشویی به مدت 5-3 دقیقه قرار گرفته و 3 بار آبکشی گردیدند. سپس به مدت 20 دقیقه درون محلول هیپوکلریت سدیم % 5 گذاشته شده و پس از 3 بار آبکشی با آب مقطر استریل، به مدت 25-20 ثانیه در االکل % 70 قرار داده شدند و سپس با آب مقطر استریل 3 بار آبکشی شده و در یک گلدان به عنوانه خزانه کشت گردیدند (به دلیل ریز بودن بذرها در تمامی مراحل از پارچه مش استفاده شد). بعد از دوهفته بذر ها شروع به جوانه زدن نمودند، گلدان­های مناسب کشت با خاک مناسب بادرنجبویه با نسبت 3:1:1 ماسه، رس و لومن آماده گردید. در هر گلدان به قطر 20 سانتی متر سه جوانه­ی دو برگی کشت شد. پس از تعیین ظرفیت زراعی (field capacity, fc)، تیمار خشکی در سه سطح صفر، 3/1 ظرفیت مزرعه­ای (fc3/1) و 3/2 ظرفیت مزرعه ای (fc3/2) بعد از مرحله 6 برگی بر روی گیاهچه­ها اعمال شد (14). تیمارسالیسیلیک اسید نیز با سه غلظت صفر، 7/0 و 5/1 میلی مولار دو هفته بعد از اعمال تنش خشکی به صورت اسپری برروی قسمت هوایی گیاه اعمال گردید. (اثر ساده تیمارها به تنهایی و اثر متقابل آن­ها در سه مرحله تکوینی، سه سطح خشکی و سه سطح سالیسیلیک اسید در هر کدام از فاکتورهای اندازه گیری شده، مطالعه شد. سطوح صفر در تیمارسالیسیلیک اسید و تنش خشکی نشان دهنده نمونه­های شاهد می­باشند).

مطالعات تشریحی: به منظور انجام مطالعاتتشریحی، نمونه­گیری از برگ، ساقه و دمبرگ گیاهچه­های بدون تنش در سه مرحله تکوینی (مرحله قبل از گلدهی، مرحله گلدهی و مرحله بعد از گلدهی) انجام شد و نمونه­ها به مدت 30 روز در محلول فیکساتور FAA تثبیت گردیدند. سپس برش­گیری به روش دستی انجام گرفت و برش­ها با محلول سبز متیل و قرمز کنگو رنگ آمیزی شدند. در نهایت مشاهده نمونه­های مختلف با میکروسکوپ نوری انجام شد.

به منظور اندازه گیری قطر دهانه آوند چوب و طول  کرک،

از گیاهانی که در شرایط تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید قرار داشتند در سه مرحله نمونه­برداری شد (شکل1). برای این منظور از نمونه­های فیکس شده در محلول FAA، برش گیری گردید و فاکتورهای مورد نظر (اندازه گیری قطر دهانه آوند چوب، و طول کرک) با استفاده از نرم افزار Image J بررسی شدند.

مطالعاتمولکولی: به منظور بررسی بیان ژن TAT، استخراج RNA کل از گیاهچه­های منجمد شده در فریزر °C 80- با استفاده از ترایزول با استفاده از روش Chomczynski (1993) صورت گرفت. برای ساخت cDNA در حجم  μl20، بر اساس پروتکل کیت Thermoscience Fisher، gµ 2از RNA با lµ 1 oligodT و آب DEPC مخلوط شد. میکروتیوب­ها به مدت 5 دقیقه در دمای  °C 65 قرار گرفتند. سپس lµ 1 آنزیم رونوشت­بردار معکوس (RT)، lµ 5/2بافر آنزیم،l µ 5/2 RNase inhibitor و در نهایت آب دیونیزه استریل تا رسیدن به حجم نهایی  μl20 به تیوب­ها اضافه شد و تیوب­ها به مدت 60 دقیقه در دمای °C 42 قرار گرفتند. در مرحله آخر تیوب­ها به مدت 10 دقیقه در دمای°C 70 - قرار داده شدند تا آنزیم RT غیرفعال شود. برای نگهداری طولانی مدت، cDNA ها به فریزر °C 20- منتقل گردیدند. پرایمر­ها از طریق سایت NCBI طراحی شده و توسط شرکت پیشگام سنتز گردید (جدول 2).

برای اندازه­گیری بیان ژن TAT سه تکرار از هر نمونه­ی مورد آزمایش استفاده شد. محتوای هر میکروتیوب با توجه

به جدول 1 تهیه وبا شرایط دمایی و زمانی 95 (10)، 59 (30)، 72 (30) به دستگاهReal Time (Light Cycler® 96)  System Roche- Germany PCR منتقل شد.

آنالیزآماری: کشت گیاهان با سه تکرار در قالب بلوک­های کاملاً تصادفی انجام شد. تجزیه واریانس داده ها با استفاده از جدول 2. پرایمر های مربوط به ژن های تکثیر شده برنامهSAS 9.4  در قالب طرح اسپلیت بلات × زمان و مقایسه میانگین ها به روش LSD با در نظر گرفتن سطح اطمینان 95% مورد بررسی قرار گرفت.

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل1- تصاویر نمونه­های گیاهی سه مرحله رویشی (قبل گلدهی(مرحله اول نموی)، گلدهی(مرحله دوم نموی) و بعد از گلدهی(مرحله سوم نموی) در تیمار­های سالیسیلیک و تنش خشکی. تیمار 1 (سالیسیلیک اسید صفر، خشکی صفر)، تیمار 2( سالیسیلیک اسید 7/0، خشکی صفر)، تیمار 3 (سالیسیلیک اسید 5/1، خشکی صفر)، تیمار 4 (سالیسیلیک اسید صفر، خشکی 3/2)، تیمار 5 (سالیسیلیک اسید صفر، خشکی 3/1)، تیمار 6 (سالیسیلیک اسید 7/0، خشکی 3/2)، تیمار 7 (سالیسیلیک اسید 7/0، خشکی 3/1)، تیمار 8( سالیسیلیک اسید 5/1، خشکی 3/2)، تیمار 9 (سالیسیلیک اسید 5/1، خشکی 3/1).

 

جدول 1- مواد مصرفی در RT- PCR

حجم مورد نیاز برای یک واکنش

مواد

µl 25/6

Real-Time Mastermix 2X

µl 25/2

آب مقطر استریل

µl 5/0

Forward Primer

µl 5/0

Reverse Primer

µl 3

Template DNA

µl 5/12

Total volume

جدول 2- پرایمر های مربوط به ژن های تکثیر شده

توالی پرایمر

نام پرایمر

5´-CCTACAAGCTACCAGCCGACTC-3ˊ

5ˊ-GCCCGTAGATTGGGAAACACG-3ˊ

5ˊ -TGTATGTTGCCATCCAGGCCG-3´

5´-AGCATGGGGAAGCGCATAACC-3´

 

 

TAT-f

TAT-r

Β-Actin-f

Β-Actin-r

نتایج

بررسی ریخت شناسی و بافت شناسی ساختمان ساقه، برگ و دمبرگ در مرحله قبل از گلدهی: طبق بررسی­های میکروسکوپی صورت گرفته مشخص گردید که ساقه گیاه بادرنجبویه چهار گوش می­باشد که خارجی ترین قسمت آن توسط یک ردیف سلول اپیدرمی احاطه می­شود. سطح اپیدرم توسط لایه­ای نازک از پوستک (کوتیکول) پوشیده می­شود که فراوانی سلول­های کرک بر روی آن بسیار بالاست. در زیر اپیدرم، در ناحیه مریستم زمینه ای، سلول­های کلانشیم مشاهده می­شوند که تراکم آن­ها در چهار گوشه نسبت به بخش­های دیگر بیشتر است و درزیر سلول­های کلانشیم در ناحیه پوست، سلول­های پارانشیمی به اشکال نامنظم و چند وجهی مشاهده می­شوند که دارای منافذ بین­سلولی هستند (شکل E2) .اندودرم آخرین لایه پارانشم زمینه است. استوانه آوندی شامل آوند چوب و آبکش بوده و لایه کامبیوم آوندی به شدت در حال تقسیم می­باشد. دستجات چوب و آبکش در چهار گوشه به صورت منظم دیده می­شوند که برروی آوندهای آبکش سلول های فیبر مستقر شده اند. در ناحیه مغز نیز سلول های پارانشیمی بزرگی مشاهده می­شوند (شکل A2). کوتیکول در هر دو سطح اپیدرم به صورت ناصاف است و بر سطح کوتیکول تریکوم­های محافظت کننده­ای وجود دارند (شکلB2، F2). سلول های اپیدرم فوقانی مستطیلی شکل هستند و از کوتیکول نازکی پوشیده شده اند. در اپیدرم تحتانی سلول­ها کوچک و حالت موجی پیدا می­کنند. در دو سطح اپیدرم علاوه بر تریکوم­های غیر­ترشحی تریکوم­های غده­ای راسی نیز وجود دارند و کرک­های سپری شکل فقط در اپیدرم فوقانی دیده می­شوند. کرک­های غده ای از پایه تک ردیفی و سر یک ردیفی تشکیل شده اند. در زیر اپیدرم پهنک، یک ردیف سلول پارانشیمی نردبانی و 2 تا 3 ردیف سلول پارانشیمی اسفنجی مشاهده می­شود. در قسمت رگبرگ مرکزی، در زیر اپیدرم فوقانی و تحتانی 2 تا 3 لایه کلانشیم مشاهده می­شود که در مراحل اولیه تشکیل می­باشند. آوند چوبی به صورت نیم هلال در قسمت مرکزی قرار گرفته و شامل چندین گروه اشعه مغزی یک ردیفه، دو ردیفه و چند ردیفه می­باشد و آوند آبکش در سطح آوند چوبی به طرف اپیدرم تحتانی مشاهده می­شود. توسعه سلول­های اسکلرانشیمی (فیبر) در سطح آوند آبکش بسیار اندک است (شکل B2،G2). در برش عرضی دمبرگ، سطح مقطع، بیضوی است که توسط یک لایه سلول اپیدرمی کرک­دار پوشیده شده است. ناحیه پوست، از سلول های پارانشیم کروی با فضای بین سلولی تشکیل شده و در قسمت میانی دمبرگ یک دسته آوند بزرگ هلالی شکل قرار دارد که در بخش های انتهایی هلال (کناره های دمبرگ) دو دسته آوند کوچک اما کامل مشاهده می­شود (شکلC2).

بررسی ریخت­شناسی و بافت­شناسی ساختمان ساقه و برگ و دمبرگ در مرحله گلدهی: در این مرحله، در برش عرضی ساقه، اپیدرم به صورت یک لایه سلولی دیده می­شود که بر روی آن سلول های کرک با فراوانی بالایی یافت می­شوند و ضخامت کوتیکول بیشتر از مرحله قبل است. سلول­های کلانشیم در چهار گوشه برش­ها مشاهده می شوند (شکل D3) و در ناحیه استوانه آوندی آوندهای چوب و آبکش قرار گرفته اند که تجمع سلول­های فیبر بر روی سلول­های آبکش و چوب بیشتر از مرحله قبل می‍باشد (شکل E3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل2- مرحله اول نموی (قبل از گلدهی).A. برش عرضی ساقه .B برش عرضی برگ C. برش عرضی دمبرگ (100 ×)D. سلول های کلانشیم و کرک ساقهE. سلول های پارانشیم و کرک پهنک برگF. دستجات آوندی رگبرگ مرکزی برگ (400×). مرحله اول نمونه برداری، متد قرمز کنگو- سبز متیل، ep= اپیدرم، Tri = کرک،  = vbدستجات آوندی،= f  فیبر،p  = پارانشیم، xy= آوند چوب،  ph= آوند آبکش، c = کلانشیم، pi = مغز

 

در ناحیه مغز نیز سلول­های پارانشیم با فشردگی بیشتری دیده می شوند (شکلA 3). برش عرضی برگ­ها در این مرحله نشان داد که بر روی سلول­های اپیدرم، کرک­ها با تراکم بالا و طول بلند قرار دارند) شکلG3،B 3) و تراکم و ضخامت سلول های کلانشیم که در زیر اپیدرم قرار دارند، بیشتر گردیده و سلول­های فیبر بر روی آوند آبکش رگبرگ میانی مشاهده می­شوند. آوند چوب با فشردگی بیشتر در مرکز رگبرگ میانی دیده می­شود (شکل F3). در ناحیه پهنک ضخامت پارانشیم نردبانی بیشتر شده و کرک­ها کشیده­تر هستند (شکلC 3).

برش مقطع دمبرگ­ها نشان داد که بر روی سطح سلول­های اپیدرم، فراوانی کرک­ها بیشتر از مرحله قبل شده و آوند­های جانبی دمبرگ به صورت کامل تشکیل شده­اند و دسته آوند مرکزی به وضوح مشاهده می­گردد. سلول­های فیبر بر روی آوندهای مرکزی مشاهده شدند (شکلF3).

بررسی ریخت شناسی و بافت شناسی ساختمان ساقه، برگ و دمبرگ در مرحله بعد از گلدهی: مشاهدات میکروسکوپی ساقه در مرحله بعد از گلدهی یک تفاوت اساسی با دو مرحله قبل نشان داد و آن پدید آمدن یک دسته آوند چوب و آبکش در فاصله دو دسته آوند بود که علایم تشکیل آن از مراحل قبل نیز قابل تشخیص بود(شکلA4).

 

 
   

 

 

 

 

 

 

 

 

 


E
 

شکل3- مرحله دوم نموی (گلدهی)A. برش عرضی ساقهB. برش عرضی برگ C. برش عرضی دمبرگ (100 ×) D. سلول های کلانشیم ساقه E. آوند های چوبی ساقه F. دستجات آوندی رگبرگ مرکزی برگ G. کرک وسلول های پارانشیم پهنک ) 400 ×). مرحله دوم نمونه برداری، متد قرمز کنگو- سبز متیل، ep = اپیدرم، Tri = کرک،  =vbدستجات آوندی،= f  فیبر، p = پارانشیم،  xy= آوند چوب، ph = آوند آبکش، c = کلانشیم، pi = مغز

تراکم و ارتفاع کرک­ها برروی سلول های اپیدرم زیاد و سلول­های فیبر بر روی آوند آبکش به صورت یک حلقه کامل مشاهده گردید. آوندهای چوب پیوسته تر و متراکم تر از مراحل قبل بودند (شکلD 4،F 4، A4). در مقطع عرضی برگ، سلول­های اپیدرم با کوتیکول ضخیم مشاهده شدند که کرک­ها با تراکم و طول زیاد دیده شد (شکلB4، G4). تراکم سلو­های پارانشیم نردبانی افزایش نشان داد و کناره­های آوند چوب و آبکش مرکزی، به صورت هلال به سمت اپیدرم فوقانی پیچیده شد (شکلE4، B4). سلول­های اپیدرمی دمبرگ در این مرحله کوتیکول ضخیمی داشته که بر روی آن کرک­ها با فراوانی نسبتا بالا مشاهده شدند. مقطع دمبرگ در ناحیه آوندهای جانبی به صورت زائده مانند دیده شد که دو دسته آوند کامل در داخل آن قرار داشت. تراکم بالایی از فیبر اطراف این دو دسته آوند مشاهده شد. دراین مرحله، تراکم بالایی از بافت کلانشیم در زیر سلول های اپیدرم دمبرگ قرار داشت (شکل C4).

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل4- مرحله سوم نموی (بعد از گلدهی) .Aبرش عرضی ساقهB . برش عرضی برگ C. برش عرضی دمبرگ  )100×( D. سلول های کلانشیم و کرک ساقه E. دستجات آوندی رگبرگ مرکزی یرگF . آوند چوبی ساقه G. پهنک برگ ( 400×). مرحله نمونه برداری، متد قرمز کنگو- سبز متیل،  ep= اپیدرم، Tri = کرک، =vb دستجات آوندی،= f  فیبر،p = پارانشیم، xy= آوند چوب،  ph= آوند آبکش، c = کلانشیم، pi = مغز

مقایسه قطر دهانه آوند چوب و طول کرک­ها در ساقه نمونه­های شاهد و تحت تنش: بمنظور آگاهی از نحوه­ی پاسخ دهی گیاه بادرنجبویه در مقابل تنش خشکی و نقش سالیسیلیک اسید در این رابطه، قطر دهانه آوند چوبی در ساقه، برگ و دمبرگ و نیز طول کرک­های ساقه و برگ در مراحل متفاوت نموی گیاه (قبل از گلدهی، گلدهی و بعد از گلدهی) در شرایط تنش و شاهد اندازه گیری شد.

با توجه به جدول تجزیه واریانس (جدول 5)، اثر تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید و مرحله نموی (زمان نمونه برداری) هرکدام به تنهایی و نیز تاثیر متقابل بین سالیسیلیک اسیدÍخشکی و یا سالیسیلیک اسیدÍخشکیÍ زمان  نمونه برداری بر قطر دهانه آوند چوبی و طول کرک­های ساقه در سطح احتمال %5 معنی­دار بود. با توجه به جدول 3-الف بزرگترین مساحت دهانه آوند چوب مربوط به ساقه گیاهان تیمار شده با اسید سالیسیلیک mM 7/0در مرحله گلدهی (µm 17/78) و کوچکترین مساحت آن مربوط به ساقه گیاهان تحت تیمار کم آبی با 3/1 ظرفیت مزرعه ای و در مرحله گلدهی (µm 9/44) مشاهده گردید. بهترین نتیجه از برهمکنش بین تیمارهای خشکی و سالیسیلیک اسید نیز برای گیاهان تحت تیمار خشکی با 3/1 ظرفیت مزرعه­ای و سالیسیلیک اسید mM 7/ 0و در مرحله بعد از گلدهی مشاهده شد (µm 79/67). در مورد صفت طول کرک­ها، کوتاهترین طول کرک­های ساقه برای گیاهان شاهد قبل از مرحله گلدهی (µm 05/15) و بلندترین کرک­ها مربوط به گیاهان تحت تنش خشکی با 3/2 ظرفیت مزرعه­ای و در مرحله پس از گلدهی بود (µm 66/27). بهترین نتیجه از برهمکنش بین تیمارهای خشکی و سالیسیلیک اسید نیز برای گیاهان تحت تیمار خشکی با 3/2 ظرفیت مزرعه­ای و سالیسیلیک اسید mM 7/ 0و در مرحله بعد از گلدهی مشاهده شد (µm 42/30).

مقایسه قطر دهانه آوند چوب و طول کرک­ها در برگ نمونه­های شاهد و تحت تنش: قطر دهانه آوند چوبی و طول کرک­ها در برگ نمونه­های شاهد و تحت تنش خشکی در سه مرحله قبل از گلدهی، گلدهی و پس از گلدهی اندازه گیری شد و تاثیر تیمار سالیسیلیک اسید بر تغییر اندازه این پارامتر بررسی گردید. با توجه به جدول تجزیه واریانس (جدول 5)، اثر تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید و زمان هرکدام به تنهایی بر قطر دهانه آوند چوبی و طول کرک­های برگی در سطح احتمال %5 بصورت معنی­دار بود اما اثرات متقابل آن­ها، تنها برای طول کرک­ها معنی­دار بوده و برای قطر دهانه آوندها معنی­دار نبود. با توجه به جدول 3-ب بزرگترین مساحت دهانه آوند چوبی برگها مربوط به گیاهان تیمار شده با اسید سالیسیلیک mM 7/0 در مرحله بعد از گلدهی (µm 8/54) و کوچکترین مساحت آن مربوط به برگ گیاهان تحت تیمار کم آبی با 3/1 ظرفیت مزرعه­ای و در مرحله  قبل از گلدهی (µm 92/23) بود. بهترین نتیجه از برهمکنش بین سالیسیلیک اسید و خشکی نیز، در مرحله قبل از گلدهی و برای گیاهان تحت تیمار کم آبی با 3/1 ظرفیت مزرعه­ای و تیمار 5/1 mMسالیسیلیک اسید مشاهده شد (µm 52/43). در مورد صفت طول کرک­ها، کوتاهترین طول مربوط به برگ گیاهان شاهد قبل از مرحله گلدهی (µm 61/15) و بلندترین طول مربوط به گیاهان تحت تنش خشکی 3/1 ظرفیت مزرعه­ای و در مرحله بعد از گلدهی بود (µm 61/37). بهترین نتیجه از برهمکنش بین تیمارهای خشکی و سالیسیلیک اسید نیز در مرحله گلدهی برای گیاهان تحت تنش خشکی با 3/2 ظرفیت مزرعه­ای و سالیسیلیک اسید  mM7/0 مشاهده شد (µm 51/38).

مقایسه قطر دهانه آوند چوب در دمبرگ نمونه­های شاهد و تحت تنش: قطر دهانه آوند چوبی در دمبرگ نمونه­های شاهد و تحت تنش خشکی در سه مرحله قبل از گلدهی، گلدهی و پس از گلدهی اندازه گیری شد و تاثیر تیمار سالیسیلیک اسید بر تغییر اندازه این پارامتر بررسی گردید. با توجه به جدول تجزیه واریانس (جدول 5)، تاثیر تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید و زمان هرکدام به تنهایی و نیز تاثیر متقابل بین سالیسیلیک اسیدÍخشکی بر قطر دهانه آوند چوبی در دمبرگ معنی­دار بود اما اثر متقابل تنش خشکیÍتیمار سالیسیلیک اسیدÍ زمان در صفت مذکور معنی دار نبود (با احتمال 5 %). با توجه به جدول 3-ج بزرگترین قطر آوند چوبی در دمبرگ مربوط به گیاهان تیمار شده با سالیسیلیک اسید در مرحله گلدهی (µm 82/50) و کمترین مقدار مربوط به گیاهان تحت تنش خشکی با 3/1 ظرفیت مزرعه­ای و در مرحله قبل از گلدهی بود (µm 95/25). بهترین نتیجه از برهمکنش بین سالیسیلیک اسید و خشکی نیز در مرحله گلدهی در گیاهان تحت تنش خشکی3/2 ظرفیت مزرعه ای و تیمار mM5/1 سالیسیلیک اسید به دست آمد (µm 07/47).

 

جدول 3- مقایسه میانگین برخی از صفات تشریحی بررسی شده تحت شرایط تنشی مختلف در ساقه (الف)، برگ (ب) و دمبرگ (ج) گیاهان بادرنجبویه در مراحل مختلف نموی. مقادیرSA  براساس میلی مولار و مقادیر خشکی بر اساس ظرفیت مزرعه­ای می باشند. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی دار بااستفاده از آزمون LSD است.

الف:

طول کرک ساقه (میکرومتر)

قطر دهانه آوند چوبی ساقه (میکرومتر)

تیمار

بعد از گلدهی

گلدهی

قبل از گلدهی

بعد از گلدهی

گلدهی

قبل ازگلدهی

 

36/20ab

9/20ab

05/15b

33/70ad

51/65ah

06/53gj

شاهد

87/21ab

20ab

81/15b

39/71ac

78/17a

14/69ae

سالیسیلیک اسید 7/0(mM)

03/26ab

66/24ab

42/16b

42/66ag

95/77ab

62/70ad

سالیسیلیک اسید 5/1(mM)

66/27ab

36/23ab

10/18ab

53/63j

74/57j

25/59j

   3/2 fcخشکی

69/23ab

81/23ab

20ab

63/46bi

9/44cj

45/49cj

3/1 fc خشکی

42/30a

25/26b

65/21ab

63/61j

14/57cj

73/54ej

خشکی fc3/2 و سالیسیلیک اسید 7/0(mM)

97/29a

28ab

33/25ab

31/63hj

06/66ci

09/58fj

خشکی fc3/2 و سالیسیلیک اسید 5/1(mM)

39/25ab

14/24ab

81/25ab

79/67ij

7/58cj

76/56ej

خشکی fc3/1 و سالیسیلیک اسید 7/0(mM)

68/24a

24ab

11/24ab

56/58ci

18/62ah

66/53cj

خشکی fc  3/1 و سالیسیلیک اسید 5/1(mM)
               

ب:

 

طول کرک برگ (میکرومتر)

    تیما ر                                                                       برگ (قطر دهانه آوند چوبی (میکرومتر )                  

بعد از گلدهی

گلدهی

قبل از گلدهی

بعد از گلدهی

گلدهی

قبل از گلدهی  

 

29/22gj

25/18hj

61/15j

47/41bg

34/53ab

68/48ad

شاهد

14/20gj

19/16ij

11/17hj

8/54a

19/53eh

5/49ad

سالیسیلیک اسید 7/0(mM)

46/25ej

20gj

06/23gj

63/47ae

38/48ad

97/50ac

سالیسیلیک اسید 5/1 (mM)

66/25ej

51/23gj

84/24gj

12/33fh

92/31eh

61/30h

3/2 fc خشکی

61/37a

45/34ab

71/31ab

11/31 fh

85/35fh

92/23gh

خشکی fc3/1

51/38a

31/38a

73/31cd

55/34 eh

76/41ag

50/38bg

خشکیfc3/2 و سالیسیلیک اسید 7/0(mM)

9/30cd

88/28cd

26/26f

47/34fh

69/34cg

85/35b

خشکیfc3/2 و سالیسیلیک اسید 5/1(mM)

76/26de

13/33cd

54/30cd

16/35dg

42/42bg

73/41cg

خشکیfc3/1 و سالیسیلیک اسید 7/(mM)0

62/36ab

28/31cd

70/32cd

56/35fh

24/40fh

52/43eh

خشکیfc3/1 و سالیسیلیک اسید 5/1(mM)
               

ج:

 

قطر دهانه آوند چوبی دمبرگ (میکرومتر)

تیمار

بعد از گلدهی

گلدهی

قبل از گلدهی

 

51/45ab

20/41bf

gh 51/38

شاهد

21/38ab

19/41a

42/41hi

سالیسیلیک اسید 7/0 (mM)

35/45be

82/50a

39/49ab

سالیسیلیک اسید 5/1 (mM)

98/31j

89/31ij

35/28hi

خشکی fc3/2

02/30bg

71/35di

95/25ch

خشکی fc3/1

45/43hj

97/46cf

75/42ej

خشکی fc3/2وسالیسیلیک اسید 7/0(mM)

18/39 ch

07/47bg

98/33gj

خشکی fc3/2و سالیسیلیک اسید 5/1(mM)

96/42hj

23/45di

25/41fj

خشکی fc 3/1و سالیسیلیک اسید 7/0(mM)

46/31 bg

13/39be

47/38dh

خشکی fc3/1و سالیسیلیک اسید 5/1(mM)

 

بررسی بیان ژن تیروزین آمینو ترانسفراز (TAT) در گیاهان شاهد و تحت تیمار در مراحل مختلف نموی: به منظور بررسی الگوی بیان ژن تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) RNA از نمونه­های شاهد و تحت تیمار در سه مرحله نموی (قبل از گلدهی، گلدهی و پس از گلدهی) استخراج شد و کیفیت آن بر روی ژل آگارز بررسی گردید. پس از کسب اطمینان از خلوص بالای RNA استخراج شده، سنتز cDNA از روی آن صورت پذیرفت. واکنش RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی ژن خانه دار اکتین و ژن تیروزین آمینوترانسفراز (TAT) انجام گرفت. با توجه به جدول آنالیز واریانس (جدول 5)، تاثیر تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید به تنهایی بر میزان بیان ژن معنی دار نبود، اما تاثیر متقابل بین سالیسیلیک اسیدÍخشکی تفاوت معنی­داری در بیان ژن مذکور در شرایط تنشی مختلف نشان داد (در سطح احتمال 5 %). با توجه به جدول 4 بیشترین میزان بیان نسبی ژنTAT  در شرایط تیمار با تنش خشکی 3/2 ظرفیت مزرعه­ای و سالسیلیک اسید mM 7/0 در مرحله گلدهی (000527/0) و کمترین میزان آن در شرایط تنشی خشکی 3/2 ظرفیت مزرعه ای و سالسیلیک اسیدmM  5/1 و در مرحله بعد از گلدهی (000225/0) مشاهده شد. بر اساس نتایج همین جدول میزان بیان نسبی ژن TAT در تمام شرایط تنشی، در مرحله پس از گلدهی کمتر از مرحله گلدهی و قبل از آن بود (جدول 5). 

 

شکل4- اثر تنش خشکی DRU)) (0، fc 3/1 و  fc3/2) و تیمار سالیسیلیک اسید (SA) (7/0 و 5/1 میلی مولار) بر بیان نسبی ژن TAT  درگیاه بادرنجبویه در سه مرحله قبل گلدهی (مرحله I)، مرحله گلدهی (مرحله II) و بعد از گلدهی (مرحلهIII). مقادیر، میانگین

 3 تکرار SE± است.

بحث و نتیجه گیری

مطالعات تشریحی گیاهان شاهد: مطالعات تکوینی بر روی ساقه، برگ و دمبرگ گیاه بادرنجبویه در سه مرحله نموی نشان داد که این اندام­ها از نظر ساختار تشریحی مشابه با سایر گیاهان خانواده نعناعیان می­باشند. در مرحله قبل از گلدهی سلول­های اپیدرمی کوچک با تقسیمات فراوان و همراه با کوتیکول نازک در ساقه مشاهده شدند و به تدریج که بر سن گیاه افزوده شد، ضخامت کوتیکول نیز افزایش پیدا کرد. تعداد زیادی کرک غده ای و غیر غده ای بر روی اپیدرم وجود داشت که با پیشرفت مرحله نموی بر طول آن­ها افزوده شد. درزیر اپیدرم، سلول­های کلانشیمی قرار داشت که در مراحل اولیه شامل لایه های با ضخامت کمتر و با افزایش سن گیاه بر تعداد لایه­های آن افزوده شد که بدلیل نقش استحکامی این لایه در مراحل پیشرفته رشد گیاه می­باشد. در قسمت های درونی­تر، بافت پارانشیمی قرار داشت که سلول­های اندودرم داخلی ترین بخش آن را تشکیل داده و در داخل اندودرم دایره محیطیه قرار داشت که آوند چوب و آبکش را احاطه کرده بود و دستجات آوندی به صورت کولترال، در چهار گوشه ساقه استقرار داشتند. به تدریج با پیشرفت مرحله نموی گیاه بر تعداد دستجات چوب و آبکش افزوده شد، بطوریکه در مرحله پس از گلدهی یک دسته آوند چوب و آبکش جدید در حد فاصل دستجات آوندی قدیمی، قابل مشاهده بود (6 و52). بررسی ساختار تشریحی برگ در مراحل نموی مختلف نشان داد که کرک­های اپیدرمی بر روی این اندام، شامل کرک­های ساده ی تک سلولی یا چند­سلولی بودند که با تراکم نسبتا بیشتر در سطح زیرین پهنک و خصوصا در ناحیه رگبرگ اصلی قرار داشتند و کرک­های غده­ای ترشح کننده نیز برروی اپیدرم مشاهده گردید.

 

جدول 5. جدول تجزیه واریانس برخی صفات بررسی شده تحت تنش خشکی و سالیسیلیک اسید گیاه بادرنجبویه. **بیانگر وجود اختلاف معنی­دار در سطح 5 درصد و ns بیانگر عدم معنی­داری می­باشد.

میانگین مربعات   

درجه آزادی

  

بیان نسبی ژن TAT

طول کرک برگ

طول کرک ساقه

مساحت آوند چوب دمبرگ

مساحت آوند چوب برگ

مساحت آوند چوب ساقه

منبع تغییرات

3/039097E-10ns

2181048/4

27022/2

699338/17

570494/48

4921181/2

2

تکرار

3/8827779E-8ns

0819284/95**

695822/42**

942168/550**

821786/356**

204544/386**

2

سالیسیلیک اسید

5/7276229E-9ns

9065168/202**

226479/1165**

253516/340**

759453/1717**

484270/1361**

2

خشکی

6/1529214E-8**

1798089/1**

911901/201**

296842/209**

804996/44ns

097004/250**

4

سالیسیلیک اسید×خشکی

1/2154202E-8

3410516/13

578749/12

007566/28

759762/23

260651/7

16

خطا (1)

1/2183587E-7**

0492446/197**

520787/300**

414631/142**

770612/80**

232159/183**

2

زمان نمونه برداری

5/2778419E-9ns

0827559/23**

858666/24**

937573/38ns

263783/40ns

181593/53**

4

زمان نمونه برداری×سالیسیلیک اسید

7/9646266E-9ns

5672271/39**

109536/14**

754183/23ns

591894/11ns

389774/43**

4

زمان نمونه برداری×خشکی

1/0648574E-8ns

9767277/14**

661766/61**

071998/25ns

980398/44ns

762624/80**

8

زمان نمونه برداری×سالیسیلیک اسید×خشکی

1/4078286E-8

0816782/11

892907/7

129255/1

091818/3

880024/17

4

تکرار(زمان)

1/3876436E-8

555795/16

627182/10

026251/23

099105/15

796750/10

32

خطا(2)

 

 

با پیشرفت مرحله نموی گیاه بر طول کرک­های برگی افزوده شد. در زیر اپیدرم فوقانی و تحتانی سلول های کلانشیمی قرار داشتند که ضخامت لایه­های آن نیز بتدریج با پیشرفت مرحله نموی گیاه افزوده گشت و در بخش میانی آنها سلول های بافت پارانشیم استقرار داشتند. در قسمت استوانه آوندی برگ، آوند آبکش با دیواره نازک سلولزی قرار داشت که بر روی سلول های آن لایه نازکی از بافت اسکلرانشیم بود که بتدرج بر ضخامت آن افزوده شد و آوند چوب نیز در مجاورت آوندهای آبکش قرار گرفته و در بین سلول های آن، اشعه مغزی یک یا دوسلولی با دیواره نازک سلولزی مشاهده شد. مقطع عرضی دمبرگ به صورت گرد یا بیضوی با دو زایده کناری بود که بر روی سلول های اپیدرمی آن کرک­ های ساده و غده­ای قرار داشت. در قسمت مریستم زمینه سلول های کلانشیم و در بخش درونی تر بافت پارانشیم مشاهده شد که سلول های دایره محیطیه داخل پارانشیم وجود داشت. اطراف دستجات آوندی مرکزی و

کناری دمبرگ سلول­های اسکلرانشیمی مشاهده شدند (6و52).

مطالعات تشریحی گیاهان تحت تنش: تحقیقات بسیاری در زمینه تنش خشکی و نقش مهاری آن در فرآیندهای رشدی گیاهان انجام گرفته که اهمیت آب را در نگهداری فشار اسمزی سلول و گسترش صحیح سلولی به اثبات رسانده­اند (17و50). در شرایط کم آبی، شیوه های مقابله و سازگاری گیاهان بسیار متنوع بوده و شامل تغییر در محتوای متابولیتی و افزایش فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان (4و 25)، افزایش میزان پروتئین و اسیدآمینه هایی همچون (16)، کاهش میزان فتوسنتز و مقدار رنگیزه­های فتوسنتزی (2و65)، افزایش محتوای قندی گیاهان(9) و تغییرات وسیع هورمونی (47) می­باشد.Makbul  و همکاران با تحقیقی که بر روی سویاهای تحت تنش کم­آبی انجام دادند، کاهش تعداد سلول­های بافت آوند چوبی را نسبت به شاهد مشاهده کردند (43). در گیاه بادرنجبویه تنش خشکی سبب کاهش سطح برگ و کاهش دوره رشدی آن می­گردد (1). افزایش تراکم و طول کرک­ها در مراحل مختلف رشد گیاهان نسبت به شرایط محیطی مختلف دستخوش تغییرات عمده­ای می­گردند (48).Banon  و همکاران (2004) افزایش تعداد، تراکم و اندازه کرک ها در اثر تنش کم آبی را گزارش دادند (10). اما مطالعات Shirzadi نشان دادکه تفاوت معنی­داری در تولید بیومس بادرنجبویه در شرایط خشکی وجود ندارد (59). مطالعات ستایش مهـر و گنجعلـی در رابطه با گیـاه دارویـی شـوید (Anethum graveolens L.) نشـان داد کـه بـا افزایش تنش خشکی کلیه صفات ظاهری مانند طـول ساقه، طول ریشه، سطح برگ و تعداد برگ کاهش یافت (57).

در تحقیقی که بر روی گیاه نخود توسط مداح و همکاران (1385) انجام شد، اسپری سالیسیلیک اسید باعث افزایش سلول های بافت پارانشیم گردید (3). در گیاه سویا و ذرت، محلول پاشی با سالیسیلیک اسید بر افزایش طول و ارتفاع ریشه موثر نبود، اما سطح برگ افزایش پیدا کرد (35). لیان در سال 2000 تاثیر مثبت اسپری سالیسیلیک اسید بر روی افزایش سطح برگ سویا را نشان داد (41). محلول­پاشی گیاه گندم با سالیسیلیک اسید، میزان تقسیم سلولی مریستم رأسی ریشه های اولیه را که منجر به افزایش رشد طولی می­شوند، را زیاد کرد (58) در یک بررسی دیگرکاربرد سالیسیلیک اسید بر گیاه خربزه، اثر معنی­دار بر رشد گیاهچه و وزن خشک ریشه داشت (36). در بررسی تأثیر اسیدسالیسیلیک بر صفات ریخت­شناسی بنفشه آفریقایی((Saintpaulia onantha، گزارش شده است که غلظت 5-10مولار از اسیدسالیسیلیک باعث افزایش در تعداد برگها، قطر رزت، تعداد غنچه های گل و کاهش تعداد روز تا گلدهی می­شود (32).

سالیسیلیک اسید با تولید انواع گونه های فعال اکسیژن موجب پیام رسانی در گیاه و افزایش سنتز متابولیت های ثانویه شده و با کاهش pH دیواره سلولی فعالیت آنزیم­هایی همچون اکسیداز­ها و پر اکسیداز­ها را افزایش می­دهد (30و11و55). در این پژوهش، تاثیر تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید هرکدام به تنهایی و نیز اثر متقابل آن­ها در گیاه بادنجبویه بر روی برخی پارامترهای مورفولوژیک-تکوینی و مولکولی نشان داد که خشکی به تنهایی سبب کاهش قطر دهانه آوند چوبی شده و تیمار سالیسیلیک اسید به تنهایی افزایش قطر دهانه آوند چوبی را در پی داشت، اگرچه مرحله تکوینی گیاه نیز در این امر موثر بود. بر اساس مطالعات، تیمار خشکی در گیاهان عمدتا باعث تخریب بافت­های درونی و افزایش بافت استحکامی و چوبی شدن می­گردد (20و24). کاهش قطر دهانه آوند چوبی بدلیل افزایش چوبی شدن نشان دهنده سازگاری گیاه با شرایط تنشی و جلوگیری از هدر رفتن آب است که می­تواند به دلیل افزایش بالای بیان ژن­های مختلفی همچون ژن فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) و افزایش فعالیت آنزیم مربوطه و بدنبال آن افزایش میزان لیگنیفیکاسیون دیواره سلولی صورت گیرد (19). کاهش قطر دهانه آوندی بدلیل افزایش شدت چوبی شدن در اثر تنش­هایی همچون کم آبی و شوری در گیاهان مختلف همچون گیاه آفتابگردان (42) و گیاه Ctenanthe setosa(38) نیز گزارش شده است. تاثیر کاربرد خارجی سالیسیلیک اسید در گیاهان با شرایط مختلف تنشی (شوری، خشکی، اشعه فرابنفش و پاتوژنها) به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است. وابسته به گونه گیاهی، مرحله نموی گیاه، غلظت به کار رفته هورمون و نحوه استعمال آن (محلول پاشی یا آبیاری) این تاثیرات متفاوت است. هرچند مکانیسم عمل این ترکیب فنولی هنوز بطور دقیق مشخص نشده است، اما شواهد نشان می­دهد که افزایش تقسیمات سلولی و توسعه سلولی بهمراه عمل هورمون­هایی نظیر اکسین (22و27و61)، تحریک سنتز ترکیبات لیگنینی (30) و افزایش میزان متابولیت­های ثانویه (66) می­تواند پاسخگوی عملکرد­های SA در گیاهان باشد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که کاربرد غلظت اندک این هورمون در افزایش قطر دهانه آوندهای چوبی نسبت به غلظت بالای آن موثرتر بوده و نیز در شرایط حضور توام خشکی و تیمار با سالیسیلیک اسید، غلظت پایین سالیسیلیک اسید، در اغلب موارد افزایش قطر دهانه آوندها را باعث گردید. مطالعات انجام گرفته در گیاه لوبیا تحت تنش خشکی (5) و گیاه کانولای آفت زده (23) نیز نشان دادند که محلول پاشی سالیسیلیک اسید در غلظتهای پایین سبب بهبود پارامترهای مورفولوژیک-تشریحی گیاهان تحت تنش شده و افزایش تعداد آوندهای چوبی و قطر دهانه آوندها را باعث می­شود. افزایش تعداد آوندهای چوبی در حضور سالیسیلیک اسید نقش موثر این هورمون را در تکوین و توسعه بافت گزیلم بدلیل دخالت آن در سنتز لیگنین دیواره سلولی آوندهای چوب و بدنبال آن افزایش انتقال آب و مواد غذایی در گیاه خاطر نشان می­سازد (30). البته گزارشات متعددی مبنی بر مسمومیت سالیسیلاتی و کاهش اثرات مثبت این ترکیب فنولی در حضور غلظتهای بالای آن نیز وجود دارد (8و21و54). کرک­ها زایده سلول­های اپیدرمی گیاهان می باشند که دارای نقش پوششی یا ترشحی بوده و در مراحل مختلف رشد گیاهان و نیز نسبت به شرایط محیطی مختلف دستخوش تغییرات عمده ای می­گردند (54). در پژوهش حاضر گیاهان تحت تنش (خشکی یا سالیسیلیک اسید یا هر دو تواما) افزایش طول کرک­ها را نسبت به نمونه شاهد از خود نشان دادند که از دلایل آن می­توان به جلوگیری از تبخیر و تعرق بیشتر و حفظ آب درون سلولی اشاره در شرایط تنشی نمود (42و47). افزایش تراکم و طول کرک­های برگی در شرایط تنشی دیگری همچون رویارویی با تشعشعات فرابنفش جهت محافظت از لایه­های زیرین برگ و یا در هوای آلوده جهت جلوگیری از ورود آلاینده­های گازی از طریق روزنه­ها به درون برگ مشاهده شده است (34و44).

مطالعات مولکولی در گیاهان تحت تنش

تنش­های مختلف در گیاهان، طیف وسیعی از تغییرات در سطح مولکولی را موجب می­گردند که طی آن بیان مجموعه ای از ژن­ها کاهش، برخی افزایش و عده ای نیز بدون تغییر باقی می­مانند. افزایش محتوای متابولیتی مانند ترکیبات ثانویه (فنل،فلاونوئید و آنتوسیانین،) گیاه بادرنجبویه تحت تنش خشکی و تیمار سالیسیلیک اسید که در مطالعه پیشین به آن اشاره نمودیم (33) می­تواند ناشی از تغییر بیان ژن­های کلیدی درگیر در مسیر بیوسنتز رزمارینیک اسید (RA) و افزایش فعالیت آنزیمهای مربوطه باشد. نتایج پژوهش حاضر نشان داد که بیان ژن تیروزین آمینو ترانسفراز (TAT) که مسیر تیروزینی سنتزRA  را هدایت می­کند، تغییر قابل ملاحظه­ای در هیچ کدام از شرایط تنشی نداشته و بیشترین مقدار بیان معنی­دار آن در شرایط تنش خشکی و تیمار با غلظت پایین سالیسیلیک اسید (خشکی  fc3/2 وSA 7/0 mM) مشاهده شد که آن نیز تفاوت چشمگیری با شرایط شاهد نداشت. مقداربیان ژن TAT در مرحله گلدهی نسبت به مرحله قبل و بعد از گلدهی افزایش داشته ولی هورمون سالیسیلیک اسید در افزایش بیان TAT موثر نبوده و فقط تنش خشکی سبب افزایش مقدار بیان ژن TAT در مرحله گلدهی بوده است. بر اساس گزارشات متعدد، فعالیت آنزیم­های درگیر در مسیرهای بیوسنتزی متابولیت­های ثانویه، از گیاهی به گیاه دیگر و در شرایط تنشی گوناگون بسیار متفاوت است. نتایج بدست آمده با نتایجی که نصیری (2014) برروی بیان ژن TAT در گیاه بادرنجبویه که تحت تیمار با عصاره مخمر بود همخوانی ندارد، در نتایج آن­ها گزارش شده بود که بیان ژن TATبا تولید رزمارینیک اسید هماهنگ است (49). اما در تحقیقی دیگرکمال زاده و همکاران بیان کردند که در گیاه بادرشبو تیمار شده با نانو ذرات بیان ژن PAL روند افزایشی داشته اما بیان ژن TAT از الگوی خاصی پیروی نکرد (18). در گیاه مریم گلی تیمار شده با عصاره مخمر، فعالیت آنزیم PAL بدون تغییر و فعالیت آنزیم TAT چندین برابر شد (63).

به طور کلی می­توان چنین نتیجه گیری نمود که استعمال غلظتهای پایین سالیسیلیک اسید در شرایط تنش خشکی در گیاه بادرنجبویه تاثیر مطلوبی بر ویژگیهای ریخت شناسی-بافت شناسی گیاه داشته و سازگاری و تحمل هر چه بیشتر گیاه به شرایط تنشی را موجب می­گردد.

سپاسگزاری

از دانشگاه گیلان و تبریز که شرایط را برای کار آزمایشگاهی نویسندگان آماده نمودند، تشکر و قدردانی می­شود.

1- اردکانی، م.، عباس زاده، ب.، شریفی عاشورآبادی، ا.، لباسچی، م.، معاونی، پ.، محبتی، ف. (1389). اثر تنش خشکی بر شاخص های رشد بادرنجبویه. (Melissa officinalis L.). گیاه و زیست بوم. 21 (5): 47-58.
2-افشارمحمدیان، م.، امیدی پور، م.، جمال امیدی، ف. (1397). اثر سطوح مختلف تنش خشکی بر محتوا و شاخص های فلورسانس کلروفیل دو رقم لوبیا. مجله پژوهشهای گیاهی. 3 (31) :709-694.
3-مداح، م.، فلاحیان، ف.، صباغ پور، ح.، چلبیان، ف. (1385). اثر سالیسیلیک اسید بر عملکرد، اجزا عملکرد و ساختار تشریحی گیاه نخود (.Cicer arietinum L). ویژه نامه زیست شناسی. 62 (16):61-70.
4- نصیری بزنجانی، س.، رضوی زاده، ر.، علومی، ح. (1396). بررسی محتوای ترکیبات فنیل پروپانوئیدی شیرابه و ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه آنغوزه (Ferula assa-foetida L.) در برخی رویشگاه­های طبیعی استان کرمان. مجله پژوهشهای گیاهی.3 (30) :644-655.
5 .Abdelaa K A A., Hafez Y M., El-Afry M M., Tantawy D L. (2015). Effect of Salicylic acid and Abscisic acid on morpho-physiological and anatomical characters of faba bean plants (Vicia faba L.) under drought stress. International Journal of Plant Production 6 (11): 1771-1788.
6 .Abdel-Naime W A., Refaat Fahim J., Fouad M A., Kamel MS. (2016). Botanical studies of the leaf of Melissa officinalis L., Family: Labiatae, cultivated in Egypt. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 5(6): 98-104.
7. Al-Khalifah N., Khan P., Al-Abdulkader A., Nasroun T. (2006). Impact of water stress on the sapwood anatomy and functional morphology of Calligonum comosum. IAWA Journal 27(3): 299-312.
8 .Ashraf A., Iris F., Manfred G., Karl-Josef D. (2003). Salicylic acid alleviates the cadmium toxicity in barley seedlings. Plant Physiology 132: 272-281.
9 .Bakhshi khaniki G., Javadi S., Mehdikhani P., Tahmasebi D. (2011). Investigation of drought stress effects on some quantity and quality characteristics of new eugenics sugar beet genotypes. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal 1 (3): 65-74.
10. Bañon S., Fernandez J ., Franco J., Torrecillas A., Alarcón J., Sánchez-Blanco M J. (2004). Effects of water stress and night temperature preconditioning on water relations and morphological and anatomical changes of Lotus creticus plants. Scientia Horticulturae 101(3): 333-342.
11 .Borsani O., Valpuesta V., Botella M A. (2001). Evidence for a role of salicylic acid in the oxidative damage generated by NaCl and osmotic stress in Arabidopsis seedlings. Plant Physiology126(3): 1024-1030.
12. Bosabalidis A., Kofidis M and G. (2002). Comparative effects of drought stress on leaf anatomy of two olive cultivars. Plant Science 163(2): 375-379.
13. Chomczynski P. (1993). A Reagent for the Single-step Simultaneous Isolation of RNA, DNA and Proteins from Cell and Tissue Samples. Biotechniques 15(3): 532-535
14. Cong Z T., Lü H., Ni G. (2014). A simplified dynamic method for field capacity estimation and its parameter analysis. Water Science and Engineering 7(4): 351-362.
15 .Dat JF., Lopez-Delgado H., Foyer CH., Scott I M. (1998). Parallel changes in H2O2 and catalase during thermotolerance induced by salicylic acid or heat acclimation in mustard seedlings. Plant Physiology 116: 1351–1357
16 .Da Man., Yong-Xia Bao., Lie-Bao Han. (2011). Drought tolerance associated with proline and       hormone metabolism in two tall fescue cultivars. Horticultural science46(7): 1027-1032
17 .Delaney T P., Uknes S., Vernooij B., Friedrich L. (1994). A central role of salicylic acid in plant disease resistance. Science 266(5188): 1247-1250.
18 .Dong J., Wan G., Liang Z. (2010). Accumulation of salicylic acid-induced phenolic compounds and raised activities of secondary metabolic and antioxidative enzymes in Salviamiltiorrhiza cell culture. Journal of Biotechnology 148(2-3): 99-104.
19. Duan H., Amthor J S., Duursma R A., O'grady A P., Choat B., Tissue D T. (2013). Carbon dynamics of eucalypt seedlings exposed to progressive drought in elevated [CO2] and elevated temperature. Tree Physiology 33(8): 779-792.
20 .Duldulao MCG., Gomez RA. (2008). Effects of vehicular emission on morphological characteristics of young and mature leaves of sunflower (Tithonia diversifolia) and napier grass (Pennisetum purpureum). BSU Graduate School ResearchJournal85: 142-151.
21 .Elhamahmy M A M., Mahmoud M F., Bayoumi T Y. (2016). The effect of applying exogenous salicylic acid on aphid infection and its influence on histo-physiological traits and thermal imaging of canola. Cercetări Agronomice În Moldova (166): 67-85. 
22 .Fariduddin Q., Hayat S., Ahmad-A. (2003). Salicylic acid influences net photosynthetic rate, carboxylation efficiency, nitrate reductase activity, and seed yield in Brassica juncea. Photosynthetica 41(2): 281-284.
23 .Gill S S., Tuteja N. (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant physiology and biochemistry 48(12): 909-930.
24 .Goldberg R., Pang A., Rolando C., Francesh C. (1991). Cell wall peroxidases and lignification: tissue and substrate specificity. Biochemical, Molecular And Physiological Aspects Of Plant Peroxidases 109-220.
25 .Guo H Y Y., Yu Y., Yang M M., Kong D S. (2018). Effect of Drought Stress on Lipid Peroxidation, Osmotic Adjustment and Antioxidant Enzyme Activity of Leaves and Roots of Lycium ruthenicum Murr. Seedling. Russian Journal of Plant Physiology 2(65): 244–250
26 .Hayat S., Hasan S A., Fariduddin Q., Ahmad A. (2008). Growth of tomato (Lycopersicon esculentum) in response to salicylic acid under water stress. Journal of Plant Interactions 3(4): 297-304.
27 .Hayat S., Iran M., Ahmad A. (2010). Effect of exogenous salicylic acid under changing environment: a review. Environmental and Experimental Botany 68(1): 14-25.
28 .Herrera-Vásquez A., Salinas P., Holuigue L. (2015). Salicylic acid and reactive oxygen species interplay in the transcriptional control of defense genes expression. Front Plant Science 6: 171.
29 .Horváth E., Szalai G., Janda T. (2007). Induction of abiotic stress tolerance by salicylic acid signaling. Journal of Plant Growth Regulation 26(3): 290-300.
30 .Humphreys J M., Chapple C. (2002). Rewriting the Lignin Roadmap. Current Opinion In Plant Biology 5: 224-229.
31. Hussain A I., Anwar F., Sherazi S T H., Przybylski R. (2008). Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activities of basil (Ocimum basilicum) essential oils depends on seasonal variations. Food Chemistry 108(3): 986-995.
32. Jabbarzadeh Z., Khosh-Khui M., Salehi H. (2009). The effect of foliar-applied salicylic acid on flowering of African violet. Australian Journal of Basic and Applied Sciences 3(4): 4693-4696.
33 .Jamal Omidi F., Mohajjel Shoja H., Sariri R. (2018). Effect of water deficit stress on secondary metabolites of Melissa officinalis L.: role of exogenous salicylic acid. Caspian Journal of Environmental Sciences (CJES) 16(2). 123-136.
34 .Karabourniotis G., Bornman J F. (1999). Penetration of UV‐A, UV‐B and blue light through the leaf trichome layers of two xeromorphic plants, olive and oak, measured by optical fibre microprobes. Physiologia Plantarum 105(4): 655-661.
35. Khan A., Safdar M., Khan M M A., Khattak K N., Anderson R A. (2003). Cinnamon improves glucose and lipids of people with type 2 diabetes. Diabetes care 26(12): 3215-3218.
36. Korkmaz A., Topal T., Oter S . (2007). Pathophysiological aspects of cyclophosphamide and ifosfamide induced hemorrhagic cystitis; implication of reactive oxygen and nitrogen species as well as PARP activation. Cell biology and toxicology 23(5): 303-312.
37. Krantev A., Yordanova R., Janda T., Szalai G., Popova L. (2008). Treatment with salicylic acid decreases the effect of cadmium on photosynthesis in maize plants. Journal of plant physiology165(9): 920-931.
38 .Kutlu N., Terzi R., Tekeli C., Şenel G., Battal P., Kadioğlu A. (2009). Changes in anatomical structure and levels of endogenous phytohormones during leaf rolling in Ctenanthe setosa under drought stress. Turkish Journal of Biology 33 (2): 115-122.
39. Le Gall H., Philippe F., Domon J-M., Gillet F., Pelloux J., Rayon C. (2015). Cell wall metabolism in response to abiotic stress. Plants 4(1): 112-166.
40. Li Y., Sperry J S., Shao M. (2009). Hydraulic conductance and vulnerability to cavitation in corn (Zea mays L.) hybrids of differing drought resistance. Environmental and Experimental Botany 66(2): 341-346.
41. Lian B., Zhou X., Miransari M., Smith D. (2000). Effects of salicylic acid on the development and root nodulation of soybean seedlings. Journal of Agronomy and Crop Science 185(3): 187-192.
42 .Majd A., Jonoubi P., Zeinipour M. (2009). Research on the effects of water stress on anatomical structure of Sunflower (Helianthus annuus L.). Journal of Developmental Biology 1(4): 11-24.
43. Makbul S., Güler N S., Durmuş N ., Güven S. (2011). Changes in anatomical and physiological parameters of soybean under drought stress. Turkish Journal of Botany 35(4): 369-377.
44 .MCG M., RA G. (2008). Effects of vehicular emission on morphological characteristics of young and mature leaves of sunflower (Tithonia diversifolia) and napier grass (Pennisetum purpureum). BSU Graduate School ResearchJournal 85: 142-151.
45. Miura K., Tada Y. (2014). Regulation of water, salinity, and cold stress responses by salicylic acid. Frontiers in plant science 5: 4.
46 .Monica R C., Cremonini R. (2009). Nanoparticles and higher plants. Caryologia 62(2): 161-165.
47 .Moradi P. (2018). The impact of drought stress on growth and hormone alterations in Thyme plant. Journal of PlantProcess and Function6 (19): 311-322.
48 .Morales M A., Alarcón J J., Torrecillas ASánchez-Blanco MJ. (2000). Growth and water relations of Lotus creticus creticus plants as affected by salinity. Biologia plantarum 43(3): 413-417.
49 .Nasiri-Bezenjani M., Riahi-Madvar A., Baghizadeh A. (2014). Rosmarinic acid production and expression of tyrosine aminotransferase gene in Melissa officinalis seedlings in response to yeast extract. Journal of Agricultural Science and Technology 16(4): 921-930.
50 .Neumann P M. (1995). The role of cell wall adjustments in plant resistance to water deficits. Crop science. 35(5): 1258-1266.
51. Nonami H. (1998). Plant water relations and control of cell elongation at low water potentials. Journal of Plant Research 111(3): 373-382.
52 .Pegoraro R L., Techio V H., Barp E A., Soares GLG. (2011). Morpho-anatomical changes in leaves of Mentha x gracilis Sole (Lamiaceae) submitted to different levels of shade. INSULA Revista de Botânica (40): 55.
53. Popova L., Pancheva T., Uzunova A. (1997). Salicylic acid: properties, biosynthesis and physiological role. Bulgarian Journal of Plant Physiology23(1-2): 85-93.
54 .Raskin I. (1992). The role of salicylic acid in plants. Annual review of plant physiology and plant molecular biology43: 439–463.
55 .Sairam R K., Deshmukh P S., Shukla D S. (1997). Increased antioxidant enzyme activity in response to drought and temperature stress related with stress tolerance in wheat genotypes. (ISSP), IARI, and New Delhi p. 69
56 .Salestani K E., Riahi-Madvar A., Maziyar M A. (2014). Antioxidant Enzymes Activity and Anthocyanin Content in Fe2+ treated Lemon Balm Seedlings. International Journal of Farming and Allied Sciences 3 (5): 562-565
57. Setayesh M Z., Ganjeali A. (2013). Effects of drought stress on growth and physiological characteristics of dill (Anethum graveolens L.). zhongguo zhong yao za zhi 39(11):1995-9
58 .Shakirova F M., Sakhabutdinova A R., Bezrukova MV., Fatkhutdinova R. (2003). AChanges in the hormonal status of wheat seedlings induced by salicylic acid and salinity. Plant science 164(3): 317-322.
59. Shirzadi M., Khajehpoor R., Hemayati S. (2010). Study on application of some organic matters and drought stress on agronomic traits and yield of lemon balm (Melissa officinalis). Plant Ecophysiol 2: 165-168.
60. Turhan M. (2006). Hand book of herbal plants, chapter 4.  3: 184-245.
61. Wang L-J., Fan L., Loescher W., Duan W. (2010). Salicylic acid alleviates decreases in photosynthesis under heat stress and accelerates recovery in grapevine leaves. BMC plant biology 10(1): 34.
62. Weitzel C., Petersen M. (2010). Enzymes of phenylpropanoid metabolism in the important medicinal plant Melissa officinalis L. Planta 232(3): 731-742.
63 .Yan Q., Shi M., Ng J., Wu J. (2006). Elicitor-induced rosmarinic acid accumulation and secondary metabolism enzyme activities in Salvia miltiorrhiza hairy roots. Plant Science 170: 853-858.
64. Zargari A. (1995). Medicinal plants, Tehrari University Publications. ISBN.
65 .Zulini L., Rubinigg M., Zorer R., Bertamini M. (2007). Effects of Drought Stress on Chlorophyll Fluorescence and 2 Photosynthetic Pigments in Grapevine Leaves (Vitis vinifera cv. ‘White 3 Riesling’). Acta horticulturae 754:289-294.
66 .Zuzana D., Veronika P., Miroslav R. (2013). Salicylic acid regulates secondary metabolites content in leaves of Matricaria chamomilla. Biologia 68(5): 904–909
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 33، شماره 3
مهر 1399
صفحه 528-543
  • تاریخ دریافت: 26 اسفند 1397
  • تاریخ بازنگری: 11 شهریور 1398
  • تاریخ پذیرش: 13 مهر 1398