اثرات ضد­میکروبی، آنتی­اکسیدانی و مهار­کنندگی کافئین بر فعالیت­آنزیمی، نشت­الکترولیت و رشد چند گونه­ گیاهی

مسعود حیدری زاده^*، عادل محمدی و شهناز زارعی

ایران، سنندج، دانشگاه کردستان، دانشکده علوم پایه، گروه علوم زیستی

تاریخ دریافت: 14/5/98                تاریخ پذیرش: 5/8/98

چکیده

کافئین(تری متیل گزانتین) آلکالوئیدی مشتق از ترکیبات پورینی است. سنتز کافئین در گیاهان یک مکانیزم دفاعی در برابر آفت­ها و عوامل آسیب­رسان است. در این پژوهش اثر کافئین بر نشت یونی و فعالیت آمیلازی بررسی و اثرات ضدباکتریایی، آنتی­اکسیدانی و دگرآسیبی کافئین در گندم، جو و کنجد مقایسه و ارزیابی گردید. طراحی آزمایش با روش فاکنوریل و در نظر­گرفتن دو عامل گونه­(گندم، جو، کنجد) و غلظت­های کافئین(۲/۰، ۱/۰، ۰۵/۰ و ۰۲۵/۰ میلی­مولار) انجام و معنی­دار بودن تفاوت میانگین­ها با آزمون دانکن ارزیابی گردید. نتایج نشان داد کافئین ۲/0 میلی­مولار همه شاخص­های رشد (طول برگ، طول ریشه­چه، وزن برگ و وزن ریشه­چه) هر سه گونه را کاملا متوقف می­نماید. در غلظت­های پائین کافئین، حساسیت و مقاومت این سه گونه تفاوت معنی دار نشان می­دهد.  کاهش شاخص­های (جوانه­زنی­کل، سرعت­جوانه­زنی و ضریب سرعت جوانه­زنی) نشان داد جو بیشتر از گندم به کافئین حساس می­باشد. در این مطالعه کافئین اثر ضد باکتریایی معنی­داری نشان نداد. ویژگی آنتی­اکسیدانی کافئین قابل توجه و معنی­دار بود. کافئین mM20 هدایت الکتریکی محلول پیرامونی بذر و ریشه­چه گندم و جو را افزایش داد. افزایش هدایت الکتریکی محیط پیرامونی بافت زنده می­تواند نتیجه آسیب به تمامیت غشاهای سلولی و نشت الکترولیت­ها باشد. کافئین فعالیت آمیلازی را با الگوی غیروابسته به غلظت به طور معنی­دار مهار ­نمود. کافئین مهارکننده فعالیت آمیلازی بوده، اثرات دگرآسیبی نسبتاً قوی، اثر ضد­باکتریایی نسبتاً ضعیف و ویژگی آنتی­اکسیدانی قابل توجه دارد. مطالعات دگرآسیبی و ضد­میکروبی کافئین در زمینه کنترل علفهای­هرز و آفات می­تواند نتایج کاربردی داشته باشد. ویژگی آنتی­اکسیدانی و ضد­میکروبی کافئین نیز در درمان و داروسازی می­تواند مورد استفاده قرار گیرد. با بررسی اثر کافئین بر نشت الکترولیت­ها و فعالیت آمیلازی، شناخت و درک مکانیسم­های سلولی اثرات زیستی کافئین بهبود خواهد یافت.

واژه های کلیدی: جوانه زنی، دگرآسیبی، فعالیت آمیلازی، کافئین، هدایت الکتریکی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09183780543، پست الکترونیکی:  m.haidarizadeh@uok.ac.ir

مقدمه

استفاده­ی بی­رویه از سموم، حشره­کش­ها و علف­کش­ها باعث آسیب به محصول، خاک، آب، جانوران و خود انسان شده و با برهم زدن روابط طبیعی در اکوسیستم یک بحران زیست­‌محیطی ایجاد کرده است. بررسی روابط آللوپاتیک و دگرآسیبی در بین گیاهان و استفاده از متابولیت­های ثانویه­ی طبیعی دارای ویژگی دگرآسیبی می­تواند جایگزین مناسبی برای این مواد شیمیایی مضر باشد (16 و 18).

کافئینC₈H₁₀N₄O₂ (1،3،7 تری متیل گزانتین) (شکل1)، آلکالوئیدی مشتق از ترکیبات پورینی است که در بیش از ­صد گونه گیاهی یافت می­شود. کافئین خالص پودری سفید رنگ و تلخ است. دانه‌ی قهوه منبع اصلی کافئین می‌باشد. کافئین مهارکننده قدرتمند آنزیم‌های فسفو­دی­استراز نوکلئوتیدی حلقوی است. این آنزیم‌ها پیام­رسانهای ثانویه درون سلولی همچون cAMP را غیرفعال می‌سازند. مقدار کافئین در مواد غذایی بسیار متغیر است (7). کافئین اولین بار توسط یک شیمیدان آلمانی به نام فردیناند فریدریش رانگ (1819) جداسازی شد.

کافئین در برخی موارد به عنوان محرک و در مواردی هم به عنوان مهار کننده رشد عمل می­کند. اثرات آللوپاتیک کافئین هم درون و هم برون گونه­ایی است. کافئین و سیتوکینین­ها ساختار مولکولی مشابه داشته و از مشتقات ترکیبات پورینی هستند. در برخی مطالعات اثرات شبه سیتوکینینی کافئین گزارش گردیده است (10و 19). کافئین در گیاهان به عنوان آفت­کش عمل کرده، این ماده­ی تلخ باعث دور شدن، مرگ یا فلج شدن حشراتی می­شود که از گیاه تغذیه نموده یا به آن حمله می کنند (6 و 13(.

شکل1- ساختار مولکولی کافئینC₈H₁₀N₄O₂  (1،3،7 تری متیل گزانتین)(12)

از کافئین در مهار جوانه زنی بذرها استفاده می‌شود. مهار جوانه­زنی توسط کافئین به توانایی آن در مهار میتوز نسبت داده می‌شود (10و11). در یک پژوهش، چوو و همکاران (1980) کافئین و چندین ترکیب دیگر را در عصاره آبی برگ، ساقه و ریشه گیاه قهوه(Coffea Arabica) شناسایی کرده و نشان دادند این عصاره به طور معنی­دار جوانه­زنی بذر و رشد ریشه­چه سه گیاه علف چمنی(Rye grass)، کاهو(Lactuca sativa) و علف بره(Festuca pratensis) را مهار می­نماید (8). در پژوهشی دیگر، مونتز زاوالا و همکاران (2013) اثر دو غلظت µM  25/2 وµM 9 کافئین را بر عملکرد، ضخامت پوست و بافت مغز میوه هندوانه (Citrullus lanatus) ارزیابی کرده و نشان دادند کافئین بر عملکرد، کیفیت میوه، محتوای مواد محلول، pH و ثبات بافت مغز میوه اثر معنی­داری نداشته ولی بر ضخامت پوست میوه تأثیر معنی­داری دارد (13(. در این پژوهش اثر کافئین بر رشد و جوانه­زنی بذر گندم، جو و کنجد بررسی گردید. در پژوهشی دیگر رامان ویسینی و همکاران (2003) اثرات ضد­باکتریایی کافئین در برابر اشریشیا کولی و پسدوموناس فلورسنس را گزارش نمودند (1 و 15(.

آمیلاز در آندوسپرم نشاسته­ای دانه‌ها توسط دو بافت سپر (اسکوتلوم) و لایه آلورون ترشح می­شود. آمیلاز نشاسته را تجزیه و انرژی لازم برای جوانه‌زنی بذر را فراهم می­کند. آمیلازها از آنزیم­های فعال و ضروری در فرایند جوانه‌زنی و رشد اولیه دانه­رست‌ها هستند (2). نتایج تحقیق فرهودی و همکاران (2016) نشان داد عصاره کنگر­فرنگی(Cynara scolymus) بر فعالیت آلفا آمیلاز ریزوم اویلار­سلام ارغوانی(Cyperus rotundus) تأثیر داشته و باعث کاهش جوانه‌زنی ریزوم و رشد گیاه­چه شده است (9). در این پژوهش اثر غلظتهای مختلف کافئین بر فعالیت آمیلازی بررسی شد.

در زمینه اثرات­زیستی و دگر­آسیبی کافئین سوالات متعددی هنوز بدون پاسخ می­باشند. آیا اثرات دگر­آسیبی کافئین در گیاهان مختلف با هم متفاوت است؟ به عبارت دیگر آیا پاسخ گیاهان مورد مطالعه به کافئین تفاوت معنی­داری با هم دارد؟ اثرات دگر­آسیبی کافئین با کدام مکانیسم ها ایجاد می­شوند؟ اثر کافئین بر نشت یونی ریشه و بذر در گونه­های مورد مطالعه چگونه است؟ کافئین چگونه بر فعالیت آمیلازی اثر می­گذارد؟ آیا می­توان از کافئین برای کنترل آفات، جانوران و میکروارگانیزم­ها و همچنین علف­های هرز آسیب­رسان به گیاهان زراعی و باغی استفاده کرد؟ در این پژوهش آزمایش­هایی برای یافتن پاسخ سوالات فوق طراحی گردیدند.

در این تحقیق اثرات ضدباکتریایی، آنتی­اکسیدانی و اثر کافئین بر رشد و جوانه­زنی بذر گندم، جو و کنجد بررسی و  مکانیسم  اثرات مهاری  با بررسی اثر کافئین بر نشت یونی، هدایت الکتریکی و فعالیت آمیلازی مورد مطالعه قرار گرفت.

مواد و روشها

اثرات آللوپاتی کافئین: بذرهای گواهی شده گندم (.Triticum aestivum L) واریته­ی پیشگام­، جو( Hordeum vulgare) واریته­ی آبیدر و کنجد (Sesamum indicum) از مرکز تحقیقات کشاورزی سنندج تهیه گردیدند. در مرحله نخست از کافئین(Merck) محلول­هایی با غلظت­(۲۰،۱۰،۵ و۵/۲میلی­مولار) و در مرحله بعد  محلول­هایی با غلظت­ (۲/۰، 1/0، ۰۵/۰ و ۰۲۵/۰میلی­مولار) از کافئین تهیه گردید. بذر­های گندم، جو و کنجد به ترتیب با وزن­(۰۰۱/۰±۰۵7/۰)، (۰۰۱/۰±۰۴8/۰) و (۰۰۱/۰±۰۳4/۰) گرم انتخاب گردیدند. به منظور ضدعفونی کردن، بذر­ها ابتدا با آب مقطر شستشو و به مدت 20 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار داده شدند. سپس دوباره با آب مقطر شستشو و به مدت 15 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم ۵/۱ درصد قرار داده شدند. مجدداً بذرها با آب مقطر شستشو و در پنج عدد پتری­دیش بر روی کاغذ صافی ضدعفونی شده کشت گردیدند. در هر پتری­دیش از هر بذر هشت عدد، با فاصله­ تقریباً مساوی قرار داده شد. به هر پتری­دیش ۵/۲ میلی­لیتر از محلول­های تهیه شده کافئین اضافه گردید. پتری­دیش­ها با پارافیلم بسته و به مدت هشت روز در اتاقک رشد قرار داده شد. دستگاه اتاقک رشد با دوره نوری ۱۲ساعت روشنایی و ۱۲ساعت تاریکی، دمای روزانه ۲۵ و شبانه ۱۸ درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی ۲۷ درصد تنظیم شد (17). بعد از هشت روز، طول برگ، طول ریشه­چه، وزن برگ و وزن ریشه­چه­ی گیاهچه­ها اندازه‌گیری شد.

اثرکافئین بر شاخص­های جوانه­زنی بذرهای گندم، جو و کنجد: هدف از انجام این آزمایش ارزیابی اثر کافئین بر شاخص­های جوانه زنی­کل (Total germination)، سرعت جوانه­زنی (Speed of germination) و ضریب سرعت جوانه زنی(Coefficient of  the rate of germination) می­باشد. از بذرهای گندم، جو و کنجد هر کدام 25عدد با وزن (گندم (g)001/0 ±050/0، چاودار(g) 001/0± 038/0 و کنجد (g) ۰۰۱/۰±۰۳4/۰) انتخاب شدند.  بذرها و پتری­دیش­ها با هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد ضد عفونی و با آب مقطر چندین بار شستشو گردیدند. در هر پتری­دیش 25 عدد بذر با فاصله مساوی قرار داده شد. برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد. غلظت 2/0 میلی مولار کافئین به عنوان تیمار و آب مقطر به عنوان شاهد در نظر گرفته شد. به هر پتری­دیش 5/2 میلی­لیتر از محلول­های تهیه شده کافئین اضافه شد. پتری­دیش­ها با پارافیلم بسته و در اتاقک رشد با دوره نوری 12 ساعت روشنایی و 12ساعت تاریکی، و دمای روزانه 25 و شبانه 18 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی 27 درصد قرار داده شدند. روزانه به مدت هشت روز دانه­های جوانه­زده شمارش شدند. بذرهایی که ریشه­چه آن­ها یک میلی­متر باشد به عنوان جوانه­زده در نظر گرفته ­شدند. برای محاسبه شاخص­های جوانه­زنی از فرمول­های ذیل استفاده شد (14(.

TG =  جوانه­زنی کل

 تعداد کل بذرها،  تعداد بذرهای جوانه­زده در آخرین روز اندازه­گیری

…+ (N_n – N_n-1) × +×+ (N₂ – N₁) × + (N₃ – N₂) (S=(N₁×1 سرعت جوانه زنی

N_n تعداد بذر های جوانه­زده در روز

CRG = 

ضریب نسبی جوانه­زنی

 تعداد بذرهای جوانه­زده در روز ،  شماره روز n

اثرات ضد­باکتریایی کافئین: اثرات ضد­باکتریایی به روش چاهک (Well method) ارزیابی گردید. سوسپانسیون میکروبی معادل ۵/۰ مک فارلند ( ۱۰^۸×۵/۱) تهیه و کشت یکنواختی از باکتری در محیط مولرهینتون آگار انجام گردید. در سطح محیط کشت چاهک­هایی به قطر پنج میلی­متر ایجاد و 12 میکرو­لیتر از عصاره آبی برگ و ریشه فرولا اوپودا و کافئین20 میلی مولار در چاهک­ها افزوده و به مدت 24 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی­گراد قرارگرفت. پس از این مدت قطر هاله عدم رشد اندازه­گیری  و حساسیت یا مقاومت باکتری به غلظت­های مختلف کافئین مشخص شد. بررسی فعالیت ضدباکتریایی به روش انتشار دیسک ( Disk diffusion) نیز انجام شد. ابتدا از باکتری­های اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس سوسپانسیون­ میکروبی ۵/۰ مک­فارلند تهیه گردید. با 100 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده در سطح محیط مولرهینتون آگار کشت یکنواخت انجام شد. سپس دیسکهای آغشته به محلول­های مورد نظر (عصاره آبی برگ و ریشه فرولا اوپودا و کافئین20 میلی مولار کافئین) با فاصله معین از یکدیگر و از لبه پلیت روی سطح محیط کشت قرار داده شد. پلیت­ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی­گراد گرماگذاری و قطر هاله­ عدم رشد اندازه­گیری گردید (5(.

درصد قطر نسبی ناحیه مهار به عنوان یک شاخص فعالیت ضد میکروبی با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:

(%) RIZD = (IZD_{zon diameter} - IZD _{negative control}) / IZD_{zon diameter}

RIZD (Relative inhibitory zone diameter) درصد قطر نسبی ناحیه مهار ­و diameter) zone (Inhibitory IZD، قطر ناحیه مهار بر حسب میلی­متر است (5). نتایج در شکل4 نشان داده شده است.

ویژگی آنتی­اکسیدانی کافئین: DPPH (1و1 دی فنیل-2- پیکریل هیدرازیل) از رادیکال­های آزاد پایدار است. در این روش توانایی دادن اتم هیدروژن یا الکترون توسط عصاره، از روی میزان تغییر رنگ محلول از ارغوانی به زرد سنجیده می­شود. بدین منظور 100 میکرو­لیتر از غلظت­های مختلف کافئین (1، 5/0، 25/0، 125/0 میلی مولار) با سه میلی­لیتر از محلول متانولی DPPH (با غلظت150میکرو­مولار) مخلوط شد. از غلظت­های 1، 5/0، 25/0، 125/0 میلی­مولار آسکوربیک اسید (ویتامین C) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. هر نمونه در سه تکرار ارزیابی گردید. جذب نمونه­ها بعد از30 دقیقه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر(مدل Unico 2100) در 517 نانومتر خوانده شد. تمام مراحل آزمایش در تاریکی و دمای 25درجه سانتی­گراد انجام شد. درصد مهارکنندگی رادیکال DPPH به روش زیر محاسبه شد (20(.

{ A _control/ (A _sample A _control -)}= (%) درصدمهار

A _control، جذب واکنش کنترل شامل تمام واکنشگرها به جز نمونه مورد آزمایش است. A _sample جذب نمونه مورد آزمایش است.

اثر کافئین بر نشت الکترولیت (Electrolyte leakage) بذر و ریشه­چه گندم: هدف از انجام این آزمایش اندازه گیری نشت­یونی ریشه­چه و بذر گندم بعد از قرار گرفتن در غلظت­های مختلف کافئین می­باشد. برای ارزیابی نشت الکترولیت، یک گرم از بذر گندم (20عدد) با محلول هیپوکلریت 5/1­درصد ضدعفونی شده و چندین بار با آب مقطر شستشو و در فالکون قرارگرفتند. سه تیمار این آزمایش شامل محلول 2/0 میلی­مولار کافئین، 20میلی­مولار کافئین و آب مقطر تهیه شدند. برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد. از هر تیمار20 میلی­لیتر به بذرهای موجود در فالکون اضافه شد. هر نیم ساعت یک بار تا 5/4 ساعت در دمای ثابت 25 درجه سانتی­گراد هدایت­الکتریکی محلول توسط کنداکتیویتی­متر (هدایت سنج) اندازه­گیری شد. برای اندازه­گیری نشت­الکترولیت ریشه­چه، بعد از ضدعفونی کردن و شستشو با آب مقطر، در هر پتری­دیش 20 عدد بذرگندم را قرار داده و پتری­دیشها را در اتاقک رشد با شرایط استاندارد گذاشته شده تا ریشه­چه کاملاً رشد کند. بعد از رشد کامل ریشه­چه، دانه رستها به گونه­ایی که فقط ریشه­چه در معرض تیمار باشد قرار داده شدند. از غلظت­های (2/0میلی­مولار، 20میلی مولار کافئین و آب مقطر) به مقدار 20 میلی­لیتر به هر ظرف اضافه شد. قابلیت هدایت محلول توسط هدایت سنج (کنداکتیویتی­متر) مدل (inolab-IDS,Multi9310) هر نیم­ساعت یک­بار تا 5/4 ساعت در دمای ثابت 25 درجه سانتی­گراد اندازه­گیری شد (4(.­

اثر کافئین بر فعالیت آمیلازی دانه­رست­ها: آمیلازها از آنزیم­های لازم برای جوانه­زنی بذر می­باشند. در این آزمایش، اثر غلظت­های مختلف کافئین بر فعالیت آمیلازی عصاره آنزیمی بذر گندم واریته­ی پیشگام بررسی شد. مواد، محلول­ها و معرفهای مورد نیاز براساس دستورالعمل تهیه گردیدند. چسب نشاسته با اضافه کردن ۲/۰ گرم نشاسته به 25 میلی­لیتر آب مقطر در حال جوش و هم زدن کامل آن تهیه ­شد، پس از حل شدن کامل نشاسته در آب مقطر، حجم آن به 50 میلی­لیتر ­رسید. بافراستات نیز با اضافه کردن 158 میلی­لیتر استات سدیم (۲/۰ مولار) به 42 میلی­لیتر محلول اسید استیک (۲/۰ مولار تهیه گردید، pH بافر تهیه شده در ۲/۵ باید ثابت باشد. معرف لوگول نیز تهیه گردید. عصاره آنزیمی حاوی آمیلاز از بذرهای جوانه­زده  چهار روزه در شرایط استاندارد و استریل، با روش زیر استخراج گردید. جهت استخراج عصاره آنزیمی 15 عدد از بذر­های جوانه­زده گندم (فقط دانه) را جدا نموده با 15 میلی­لیتر آب مقطر در هاون چینی ساییده و مخلوط شیری رنگ را بعد سه تا چهار دقیقه صاف کرده و از محلول صاف شده یک میلی­لیتر برداشته و در یک بالن ژوژه حجم آن را با آب مقطر به 50 میلی­لیتر رسانده می­شود. عصاره حاصل محتوی آنزیم آمیلاز می­باشد. pH مناسب فعالیت آنزیم آمیلاز 5 تا ۵/۵ می­باشد. جهت سنجش فعالیت آن، pH محیط در این محدود ه باید تثبیت گردد. به منظور تهیه نشاسته بافری، برای هر گروه آزمایشی سه میلی­لیتر از چسب نشاسته به 27 میلی­لیتر بافر استات اضافه و به عنوان مخلوط واکنش از آن استفاده شد. مخلوط واکنش شامل پنج لوله آزمایش به ترتیب محتوی پنج میلی لیترمحلول 0، 5/2، 5،10 و 20میلی­مولار کافئین تهیه شدند. به همه لوله­های آزمایش پنج میلی­لیتر نشاسته بافری و پنج میلی­لیتر عصاره آنزیمی اضافه گردید. بعد از مدت زمان آزمایش (15 دقیقه) به همه لوله­های آزمایش پنج قطره معرف لوگل اضافه گردید. لوله­ها را خوب تکان داده تا محتویات آن یکنواخت شود. لوگول فرایند آنزیمی را متوقف می­کند. لوگول بعد از واکنش با نشاسته رنگ آبی تیره ایجاد می­نماید. جذب نور محلول­های مذکور در طول موج 640 نانومتر با اسپکتروفتومتر (مدل Unico 2100) اندازه­گیری گردید (2). آزمایش در سه تکرار برای هرکدام از لوله­های فوق انجام گرفت.

روش آماری: تحلیل داده ها با نرم افزار Spss21 انجام شد. آنالیز واریانس تغییرات میانگین­ها با روش فاکنوریل و در نظر گرفتن دو عامل گونه و غلظت­های مختلف کافئین انجام و معنی­دار بودن تفاوت میانگین­ها با آزمون دانکن ارزیابی گردید.

نتایج

اثر آللوپاتی: کافئین در غلظت­های ۲۰، ۱۰، ۵ و ۵/۲ میلی مولار باعث مهار کامل جوانه­زنی و رشد بذرهای گندم، جو و کنجد شد. بنابراین محلولهایی با غلظتهای کمتری از کافئین تهیه و اثرات آنها بر شاخص­های رشد و جوانه زنی ارزیابی گردید. کافئین در غلظت­های پایین­تر (۲/۰، ۱/۰، ۰۵/۰ و ۰۲۵/۰ میلی­مولار) باعث کاهش طول و وزن ریشه­چه و برگچه و وزن­کل دانه­رست­ها شد (شکل2).  نمودار­ الف(شکل2) اثر غلظت­های مختلف کافئین بر وزن ریشه­چه سه گونه گندم، جو و کنجد را نشان می­دهد. غلظت ۰۲۵/۰ کافئین وزن ریشه­چه جو و کنجد را افزایش داد. غلظت۱/۰، ۰۵/۰ کافئین به طور نسبی و غلظت ۲/۰ کافئین بطور کامل وزن ریشه­چه هر سه گونه را کاهش داد.  نمودار­ب(شکل2) اثر غلظت­های مختلف کافئین بر طول ریشه­چه گندم، جو و کنجد را نشان می­دهد. کافئین بصورت معنی­دار بیشترین اثر مهارکنندگی را بر طول ریشه­چه نشان داد. به نظر می­رسد طول ریشه­چه بیشترین حساسیت را به کافئین نشان می­دهد. نمودار­پ(شکل2) اثر غلظت­های مختلف کافئین را بر طول برگچه گندم، جو و کنجد نشان می­دهد. طول برگچه نیز به کافئین حساسیت نشان می­دهد. نمودار­ث(شکل2) اثر غلظت­های مختلف کافئین بر وزن برگچه گندم، جو و کنجد را نشان می­دهد. نمودارج (شکل2) اثر غلظت­های مختلف کافئین بر وزن کل دانه­رست­های گندم، جو و کنجد را نشان می­دهد.

الفب

ثپ

ج

شکل2- اثر غلظتهای مختلف کافئین برطول و وزن (ریشه چه، برگچه) و وزن­کل دانه­رستهای گندم، جو و کنجد

نمودارهای شکل2 و جدول 1 نشان می­دهند که کافئین بیشترین تأثیر را بطور معنی­دار هم در سطح 5 درصد و هم در سطح 1درصد بر طول ریشه­چه و طول برگچه دانه­رست­ها دارد. کمترین اثر­پذیری نیز در وزن­کل دانه­رست­ها  مشاهده می­شود. غلظت ۲/0 کافئین همه شاخص­ها جز وزن کل را کاملاً متوقف کرد. به دلیل در نظر گرفتن وزن باقیمانده بذر در شاخص وزن کل دانه­رست تغییرات این شاخص با تغییرات شاخص­های دیگر متفاوت است. به نظر می­رسد شاخص­هایی که طول را ارزیابی می­نمایند، (طول ریشه­چه و طول برگچه) حساسیت بیشتری به کافئین نسبت به شاخص­های وزنی مانند وزن کل، وزن برگچه و وزن ریشه­چه نشان می­دهند. در شاخص­های وزنی امکان خطای آزمایشی به دلیل در نظر گرفتن وزن­تر بیشتر است. آنالیز واریانس(جدول1) تغییرات شاخص­های رشد دانه رست­های گندم، جو و کنجد تحت تأثیر پنج غلظت کافئین نشان می­دهد که هر دو عامل غلظت کافئین و گونه­های مورد مطالعه تأثیر معنی­داری هم در سطح یک درصد و هم در سطح پنج درصد بر تغییرات هر پنج متغیر وزن کل، وزن برگچه، وزن ریشه چه، طول ریشه چه و طول برگچه نشان داده­اند (جدول1). در مورد متغیر وزن ریشه­چه عامل گونه­های مورد مطالعه نیز در سطح یک درصد معنی دار است. آزمون دانکن در مورد همه متغیرها با گروه­بندی  عامل غلظت کافئین در پنج گروه تفاوت معنی­دار اثر غلظت کافئین را تأیید می نماید. در مورد گونه های گندم، جو و کنجد آزمون دانکن در همه متغیرها بجز طول برگ اولیه و وزن ریشه چه عاملی، گونه را در سه گروه طبقه بندی نمود، یعنی حساسیت و مقاومت گونه­ها نسبت به کافئین با هم تفاوت معنی­دار دارد.

جدول 1- آنالیز واریانس اثر غلظت­های مختلف کافئین بر شاخص­های رشد دانه­رست­های گندم، جو وکنجد

^{*، **} به ترتیب معنی دار در سطح 5 و 1 درصد

اثر بر شاخص­های جوانه­زنی: شکل3 اثر غلظت 2/0 و 05/0 میلی­مولار کافئین و آب مقطر (کنترل) بر شاخص­های جوانه زنی، بذرهای گندم و جو را نشان می­دهد.  نمودار الف ( شکل3) اثر غلظت 2/0 و 05/0 میلی مولار کافئین بر جوانه زنی کل گندم و جو را نشان می­دهد.  نمودارب (شکل3) اثر غلظت 2/0 و 05/0 میلی­مولار کافئین بر سرعت جوانه­زنی گندم و جو را نشان می­دهد. کافئین بطور معنی­دار نسبت به گروه کنترل سرعت جوانه­زنی بذر گندم و جو را کاهش داده است. اثر کافئین بر کاهش سرعت جوانه­زنی چاودار نسبت به گندم به طور معنی­دار بیشتر است.  نمودار­پ( شکل3) اثر غلظت 2/0 و 05/0 میلی­مولار کافئین بر ضریب نسبی جوانه­زنی گندم و جو را نشان می­دهد. نسبت به گروه کنترل ضریب­نسبی­جوانه زنی بذر­های گندم و جو بطور معنی­دار کاهش نشان داد. کاهش ضریب نسبی جوانه­زنی جو نسبت به گندم بطور معنی­دار بیشتر است.

شکل3- اثر غلظت 2/0 و 05/0 میلی­مولار کافئین و آب مقطر (کنترل) بر جوانه­زنی­کل (الف) سرعت جوانه­زنی­(ب) و ضریب سرعت­جوانه­زنی(پ) گندم و جو

اثر آنتی­اکسیدانی: درصد مهارکنندگی رادیکال DPPH مبنایی برای ارزیابی ویژگی آنتی­اکسیدانی می­باشد. نمودار الف (شکل4) درصد مهارکنندگی رادیکال DPPH بر اثر غلظت­های (1، 5/0، 25/0، 125/0 میلی­مولار) از کافئین ویتامین C را نشان می­دهد. نمودار الف شکل4 نشان می­دهد قدرت مهارکنندگی کافئین قابل مقایسه با ویتامین C نبوده و بطور معنی­دار از آن کمتر است. درصد بازدارندگی بیشتر به معنای خاصیت آنتی­اکسیدانی بیشتر است. نتایج نشان می­دهد درصد بازدارندگی و ویژگی آنتی­اکسیدانی ویتامین C بطور معنی­دار بیشتر از کافئین است. با افزایش غلظت کافئین بطور معنی­دار خاصیت آنتی­اکسیدانی و مهارکنندگی رادیکال DPPH نیز افزایش نشان می­دهد.

اثر ضد باکتریایی: نمودار­ب شکل4، درصد قطر نسبی ناحیه مهار رشد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و اشیرشیا کلی در اثر­ عصاره آبی برگ و ریشه فرولا اوپودا (50گرم بر لیتر) (به عنوان شاهد) را نشان می­دهد. قطر ناحیه­ی مهار به معنای خاصیت ضد­باکتریایی عصاره می­باشد. در مورد هر دو باکتری عصاره آبی برگ نسبت به عصاره آبی ریشه اثر مهاری قوی­تری دارد. قطر ناحیه­ی مهار و درصد آن در غلظت 20 میلی­مولار کافئین نشان داد به طور کلی اثر ضد باکتریایی کافئین از عصاره آبی برگ و ریشه فرولا اوپودا به عنوان گروه کنترل بطور معنی­دار کمتر است. همچنین به طور نسبی اثر کافئین بر اشیرشیا کلی بیشتر از استافیلوکوکوس اورئوس می­باشد.

اثر بر نشت الکترولیت و هدایت الکتریکی: شکل5 اثر غلظت­های 20 و 2/0 میلی­مولار کافئین بر هدایت الکتریکی محلول پیرامونی بذر گندم (الف)، بذر­ جو (ب)، ریشه­چه گندم (ث)­ و ریشه­چه جو (پ) را نشان می­دهد.

شکل4- نمودار (الف) اثر غلظت­های­(1، 5/0، 25/0، 125/0 میلی­مولار) کافئین و ویتامین C بر درصد مهارکنندگی رادیکال DPPH را نشان می­دهد. نمودار (ب) میانگین درصد قطر هاله عدم رشد باکتری استافیلوکوک اورئوس و اشیرشیا کلی توسط غلظت­های مختلف عصاره آبی برگ و ریشه فرولا اوپودا و کافئین20 میلی­مولار را نشان می­دهد.

نمودارهای شکل5 نشان می­دهند در همه موارد کافئین mM20 هدایت الکتریکی محلول پیرامونی بذر و ریشه­چه هر دو گونه گندم و جو را افزایش داده است. غلظت mM2/0کافئین (نمودارهای ب،ث) مانند گروه شاهد (آب مقطر) اثری یکسان بر هدایت الکتریکی بذر جو (ب)، و ریشه چه گندم نشان داده است.

اثر کافئین بر فعالیت آمیلازی: لوگول در ترکیب با محلول نشاسته رنگ آبی تیره ایجاد می­کند. آمیلاز تجزیه نشاسته را کاتالیز می­نماید. فعالیت بیشتر آنزیم باعث کاهش مقدار نشاسته شده و سبب کاهش رنگ و در نتیجه کاهش میزان جذب نوری در طول موج640 نانومتر می­شود.

شکل5- اثر غلظت 20 و 2/0 میلی­مولار کافئین و شاهد­(آب مقطر­) بر هدایت الکتریکی بذر گندم (الف) بذر جو­(ب) ریشه­چه جو(پ) و ریشه­چه گندم(ث)

شکل 6- اثرغلظت­های مختلف کافئین(۲۰، ۱۰، ۵ و ۵/۲ میلی­مولار) بر فعالیت آمیلازی (عصاره آنزیمی استخراج شده از بذرهای جوانه زده گندم) بر اساس مقدار نشاسته باقیمانده

شکل6، اثر غلظت­های مختلف کافئین بر فعالیت آمیلازی را نشان می­دهد. در گروه شاهد صفر میلی­مولار (بدون کافئین) فعالیت آمیلازی آنزیم حداکثر و در نتیجه میزان نشاسته حداقل است. در گروههای تیمار 20، 10، 5، 5/2 میلی­مولار کافئین فعالیت آمیلازی را مهار و در نتیجه نشاسته تجزیه نشده و مقدار آن کاهش نیافته وحداکثری است. تفاوت معنی­داری بین اثر غلظت­های مختلف کافئین بر مهار فعالیت آمیلازی مشاهده نمی­شود. بررسی اثر غلظت­های مختلف کافئین بر فعالیت عصاره آنزیمی استخراج شده از بذرهای گندم نشان داد کافئین اثر مهاری معنی‌داری بر فعالیت آمیلازی دارد.

بحث و نتیجه گیری

پژوهش­های متعدد نشان می­دهند که مواد شیمیایی آزاد شده توسط گیاهان و همچنین مواد تجزیه شده گیاهی توانایی کنترل علف­های هرز را داشته و می­توانند به عنوان علف­کش و آفت­کش طبیعی عمل نمایند (3). در یک پژوهش  چوو و همکاران (1980) کافئین و چندین ترکیب مشابه دیگر را در عصاره آبی برگ، ساقه و ریشه گیاه قهوه (Coffea Arabica) شناسایی و جداسازی کرده و نشان دادند عصاره آبی 1 درصد برگ، ساقه و ریشه این گیاه بطور معنی­دار جوانه­زنی دانه و رشد ریشه­چه سه گیاه علف چمنی­(Rye grass)، کاهو­(Lactuca sativa) و علف بره­(Festuca pratensis) را مهار می­نماید (8). فریدمن و والر (1983) گزارش کردند کافئینmM  10 باعث مهار رشد دانه­رستهای قهوه ( Coffea Arabica) شده، این مهار در مرحله میتوز و تشکیل صفحه سلولی در ریشه­چه اتفاق می­افتد (10).

پژوهش­های متعددی گزارش نموده­اند که کافئین باعث غیر­فعال شدن سیتوکینین­ها در لپه­های تربچه (Raphanus Sativus) شده و در غلظت­های 50-2000 میکرومولار کافئین کاهش تعداد و طول ریشه­ها در هیپو­کوتیل ماش­(Phaseoulus aureus) مشاهده نمی­شود. همچنین کافئین 10000-25000 میکرومولار باعث کاهش تعداد سلولهای ریشه در دانه­رست­های نخود (Pisum Satiumm­) می­گردد (13). در جنین­های در حال رشد دانه­های قهوه غلظت 40-60 میلی­مولار کافئین گزارش شده است. به نظر می‍رسد این جنین­ها نوع ویژه­ای از توانایی مهار و اجتناب از خود­سمیتی نسبت به کافئین را دارا هستند. با رشد طولی ناحیه زیر­لپه و هیپوکوتیل، ناحیه تقسیم سلولی نوک ریشه از ناحیه غنی از کافئین اندوسپرم دور شده و تقسیم سلولی در نوک ریشه تحت تأثیر کافئین قرار نمی­گیرد. بنابراین با جداسازی ناحیه ذخیره کافئین و ناحیه تقسیم سلولی، از اثرات خود سمیتی اجتناب می­شود (10). در یک پژوهش مونتز زاوالا و همکاران (2013) اثر غلظت µm 25/2 وµm  9 کافئین را بر عملکرد، ضخامت پوست و بافت مغز میوه هندوانه (Citrullus lanatus) ارزیابی کرده و نشان دادند کافئین تأثیر معنی­داری بر عملکرد، کیفیت میوه، محتوای مواد محلول، pH و ثبات بافت مغز نداشته ولی بر ضخامت پوست میوه تأثیر معنی­داری دارد (13). نتایج این پژوهش نشان داد که کافئین در غلظت­های (۲۰، ۱۰، ۵ و ۵/۲ میلی­مولار) باعث مهار کامل رشد و جوانه­زنی بذرهای گندم، جو و کنجد شد. غلظت­های بیش از ۲/0 میلی­مولار کافئین اثرات مهارکنندگی قطعی بر رشد و نمو گیاهان نشان می­دهند. در این پژوهش غلظت ۲/0 میلی­مولار کافئین همه شاخص­های رشد هر سه گونه گندم، جو و کنجد را کاملاً متوقف نمود. در این غلظت تفاوت معنی­داری در حساسیت گندم، جو و کنجد به کافئین مشاهده نشد. در غلظت­های (۱/۰، ۰۵/۰ و ۰۲۵/۰ میلی­مولار) در برخی شاخص­ها تفاوتهایی جزئی و غیر معنی­داری در پاسخ­های گندم، جو و کنجد به کافئین مشاهده شد. این نتایج با نتایج چوو و همکاران (1980) که مهارکنندگی عصاره برگ، ساقه و ریشه گیاه قهوه (Coffea Arabica) محتوی کافئین طبیعی را تایید کردند، همخوانی دارد.

شکل3 نتایج اثر کافئین بر جوانه­زنی­کل، سرعت جوانه­زنی و ضریب نسبی جوانه­زنی را نشان می­دهد. کافئین بیشترین تأثیر را بر سرعت جوانه­زنی نشان ­داد. اثر پذیری جوانه­زنی کل نسبت به کافئین کمترین است. به نظر می­رسد کافئین فرایندهای متابولیسمی بعد از جوانه­زنی را بیشتر تحت تأثیر قرار می­دهد. در هر سه شاخص اثرپذیری و حساسیت جو به کافئین بیشتر از گندم بوده و گندم مقاومت بیشتری به کافئین نشان می­دهد.

در یک پژوهش رامان ویسینی و همکاران (2003) اثرات ضد­باکتریایی کافئین در برابر اشریشیا کولی و پسدوموناس فلورسنس را بررسی و نشان دادند کافئین در غلظت بالای 1 درصد محیط کشت، رشد هر دو باکتری را به طور کامل مهار می­نماید. کافئین در غلظت­های ۱/۰ و 5/۰ به طور نسبی رشد را مهار می­نماید­. حساسیت اشریشیا کولی نسبت به کافئین به طور معنی­دار بیشتر از پسدوموناس فلورسنس می باشد (15). در یک پژوهش محمد و البیاتی (2009) کافئین طبیعی را از دو گیاه قهوه (Coffea Arabica) و چای سبز (Camellia Sinensis) جداسازی و خالص­سازی کرده و اثرات ضد­باکتریایی آن را در برابر شش باکتری بیماری­زا ارزیابی کردند. نتایج تأیید کننده اثرات ضد­باکتریایی کافئین مستخرج از هردو گیاه بود (12). بر مبنای قطر ناحیه­ی مهار، غلظت 20 میلی­مولار کافئین، اثر ضد­باکتریایی کافئین به طور معنی­داری از تیمارهای دیگر کمتر بوده می­توان نتیجه­گیری کرد کافئین اثر ضد­باکتریایی معنی­داری در این پژوهش نشان نداد. به نظر می­رسد روش ارزیابی اثرات ضد­باکتریایی در این پژوهش (روش چاهک و روش انتشار دیسک) متفاوت از روش استفاده در محیط کشت رامان ویسینی و همکاران (2003) باشد. استفاده از کافئین صنعتی نیز می­تواند علت تفاوت نتایج این پژوهش با نتایج  محمد و البیاتی (2009) باشد.

آنتی­اکسیدان‌­ها سبب کاهش التهاب و آسیب­‌های سلولی می‌­شوند. افزایش متابولیسم بدن، تحریک سیستم اعصاب مرکزی و افزایش میزان هوشیاری و آگاهی محیطی از مهم‌ترین آثار کافئین در جانوران است. اثرات لیپولیتیک (تجزیه کنندگی چربی) کافئین و گزانتین (دیگر ترکیب مشتق شده از چای و قهوه) به خوبی ثابت شده و کاملاً شناخته شده‌ است. به این ترتیب، مصرف زیاد گزانتین و کافئین ممکن است به از دست دادن وزن کمک کرده و کاهش وزن از طریق افزایش اکسیداسیون چربی و گرمازایی را در پی داشته باشد. کافئین از جذب مواد معدنی مخصوصاً آهن جلوگیری می‌کند (7). ویژگی آنتی­اکسیدانی کافئین قابل توجه است. این ویژگی با توجه به افزایش روز افزون استفاده از کافئین در فراورده­های غذایی می­تواند با اهمیت تلقی شود. گزارشی در ارتباط با اندازه گیری ویژگی آنتی اکسیدانی کافئین مشاهده نگردید.

نمودارهای شکل 5 نشان می­دهند کافئینmM20 هدایت الکتریکی محلول پیرامونی بذر و ریشه­چه گندم و جو را افزایش داده است. افزایش هدایت الکتریکی محیط پیرامونی بافت زنده می­تواند نتیجه نشت الکترولیت­ها باشد. نشت الکترولیت می­تواند تحت تأثیر بر هم خوردن تعادل تبادل یونی روی دهد. متابولیت­های ثانویه دارای اثر دگرآسیبی مانند کافئین ممکن است با اثر بر تمامیت غشاهای زیستی، نشت الکترولیت­ها و تغییر هدایت الکتریکی محیط پیرامونی را سبب شوند.

یکی از سازوکارهایی که سبب کاهش جوانه­زنی بذر می‌گردد، احتمالاً مربوط به کاهش فعالیت آنزیمهایی مانند آلفا آمیلاز است که در جوانه­زنی بذر نقش دارند. کاهش تقسیمات میتوز در مریستم ریشه، کاهش فعالیت آنزیمهای کاتالیز کننده فرایندهای حیاتی گیاه و اختلال در جذب یونهای معدنی که در حضور آللوکمیکالهایی مانند کافئین رخ می­دهد، سبب کاهش رشد گیاهچه می­شود. همچنین ممکن است یکی از مکانیسمهای بازدارندگی کافئین از طریق اثر مهاری بر بیان ژن آنزیم­هایی مانند آمیلازها باشد. نتایج نشان داد که غلظت­های مختلف کافئین­(۲۰، ۱۰، ۵ و ۵/۲ میلی­مولار) اثر کاهنده معنی­داری بر فعالیت آمیلازی دارند.

نتیجه گیری

نتایج این پژوهش نشان داد غلظت ۲/0 میلی­مولار کافئین همه شاخص­های رشد گندم، جو و کنجد را کاملاً متوقف می نماید. در این غلظت تفاوت معنی­داری در حساسیت گندم، جو و کنجد به کافئین مشاهده نمی­شود. در غلظت­های کمتر حساسیت و مقاومت این سه گونه به کافئین با هم تفاوت معنی­دار دارد. کافئین بیشترین تأثیر را بر سرعت جوانه زنی نشان می­دهد. در هر سه شاخص ( جوانه­زنی کل، سرعت جوانه­زنی و ضریب نسبی سرعت جوانه­زنی) اثرپذیری و حساسیت به کافئین در جو بیشتر ازگندم می­باشد. اثرات ضد­باکتریایی کافئین به طور معنی­داری از عصاره آبی برگ و ریشه فرولا اوپودا کمتر می­باشد. می­توان نتیجه­گیری کرد کافئین اثر ضد­باکتریایی معنی­داری نشان نداد. ویژگی آنتی­اکسیدانی کافئین قابل توجه است هرچند ویژگی آنتی­اکسیدانی ویتامین C به طور معنی­دار بیشتر از کافئین است. کافئینmM20 هدایت الکتریکی محلول پیرامونی بذر و ریشه­چه گندم و جو را افزایش داد. افزایش هدایت الکتریکی محیط پیرامونی بافت زنده می­تواند نتیجه نشت الکترولیت­ها باشد. نتایج به دست آمده نشان داد که کافئین فعالیت آمیلازی را به­طور معنی­داری کاهش می­دهد. برخی از ویژگی­های آللوپاتیک کافئین را می­توان به تأثیر منفی آن بر فعالیت آمیلازی، تمامیت غشاهای سلولی و تحریک نشت متابولیت در بافت­های زنده گیاهان رقیب نسبت داد. مطالعات آللوپاتی و ضد­میکروبی کافئین در زمینه کنترل علفهای هرز و آفات می­تواند نتایج کاربردی داشته باشد. نتایج آنتی­اکسیدانی و ضد­میکروبی کافئین نیز در درمان و داروسازی می­تواند مورد استفاده قرارگیرد. با بررسی اثر کافئین بر نشت الکترولیت، هدایت الکتریکی و فعالیت آمیلازی درک مکانیسم­های سلولی اثرات زیستی کافئین نیز بهبود خواهد یافت.