نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه علوم باغبانی دانشگاه محقق اردبیلی
2 عضو هیات علمی/ دانشگاه محقق اردبیلی
3 استادیار موسسه تحقیقات علوم باغبانی
چکیده
گیاه کرنبری با نام محلی قرهقاط و نام علمی (Vaccinium arctostaphylos L.) ازخانوادهی اریکاسه میباشد. میوه گیاه قرهقاط سته و کروی شکل بوده و به دلیل دارا بودن ترکیبات آنتوسیانینی، فلاونوئیدی، ضدسرطان و ضدمیکروبی از ارزش تجاری بالایی برخوردار است. این تحقیق به منظور بررسی روشهای ضدعفونی ریزنمونههای گیاه قرهقاط در قالب سه آزمایش مختلف صورت گرفت. در آزمایش اول ضدعفونی ریزنمونههای پنج اکوتیپ مختلف که شامل اکوتیپهای حوران، سوها، خلخال، لیسار و پرهسر مورد بررسی قرار گرفتند. در آزمایش دوم تأثیر تغییرpH محلول ضدعفونی و آزمایش سوم به بررسی تأثیر تتراسایکلین و نیترات نقره در ضدعفونی ریزنمونههای قرهقاط پرداخت. در آزمایش اول اکوتیپ لیسار بهعنوان بهترین اکوتیپ در ریزنمونههای سالم، در آزمایش دوم 9=pH بهترین عملکرد، و در آزمایش سوم نیترات نقره بیشترین میزان ریزنمونههای سالم را داشت. بطور کلی عوامل متعددی در ضدعفونی ریزنمونههای گیاهی تاثیر دارند. نتایج این آزمایشات نشان داد که در ضدعفونی ریزنمونههای گیاه قره قاط، نوع اکوتیپ، مواد ضدعفونی کننده و pH نقش اساسی را دارند.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
Investigation of different disinfection treatments on the explants of Cranberry (Vaccinium arctostaphylos L.)
نویسندگان [English]
1 Dept. of Horticulture, University of Mohaghegh Ardabili
2 Dept. of Horticulture, University of Mohaghegh Ardabili
3 Horticultural Sciences Research institute
چکیده [English]
Cranberry (V. arctostaphylos L.) which locally named Shihard is belonging to Ericaceae family. The fruit is spherical and spicy and it has high commercial value because of the presence of the anthocyanin, flavonoids, anticancer and antimicrobial compounds. This research was conducted to investigate the disinfection methods of Cranberry in three different tests. The first experiment was to evaluate the disinfection of the explant of five different ecotypes including; Horan, Soha, Khalkhal, Lisar and Paresar. The second experiment examines the effect of changing the pH of the disinfectant solution and the third experiment investigated the effects of tetracycline and silver nitrate on disinfection of cranberry explants. In the first experiment, the Lisar ecotype was considered as the best ecotype for healthy samples, in the second experiment, pH = 9 was the best, and in the third experiment, silver nitrate had the highest percentage of healthy sputum samples. In general, many factors effects on disinfection of explants. The results of these experiments showed that type of ecotype, disinfectant materials and pH effects on disinfection of cranberry explants.
کلیدواژهها [English]
بررسی تیمارهای مختلف ضدعفونی بر روی ریزنمونههای قرهقاط
بهناز رضازاده1، علیرضا قنبری1*، یونس پور بیرامیهیر1 و روحاله حق جویان2
1 ایران، اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم باغبانی
2 ایران، کرج، موسسه تحقیقات علوم باغبانی کرج
تاریخ دریافت: 7/7/97 تاریخ پذیرش:28/1/98
چکیده
گیاه کرنبری با نام محلی قرهقاط ازخانوادهی اریکاسه (یا تیره قرهقاط) میباشد. میوه گیاه قرهقاط سته و کروی شکل بوده و به دلیل دارا بودن ترکیبات آنتوسیانینی، فلاونوئیدی، ضدسرطان و ضد میکروبی از ارزش تجاری بالایی برخوردار است. این تحقیق به منظور بررسی روشهای ضدعفونی ریزنمونههای گیاه قرهقاط در قالب سه آزمایش مختلف صورت گرفت. در آزمایش اول ضدعفونی ریزنمونههای پنج اکوتیپ مختلف حوران، سوها، خلخال (استان اردبیل)، و لیسار و پرهسر (استان گیلان) طبق جدول 1 و آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح تصادفی مورد بررسی قرارگرفتند. در آزمایش دوم تأثیر تغییر pH محلول ضدعفونی شامل (5/6، 9، 5/11و14)، آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی و آزمایش سوم به بررسی تأثیر تتراسایکلین و نیترات نقره در ضدعفونی ریزنمونههای قرهقاط، نیتراتنقره 50 میلیگرم بر لیتر، تتراسایکلین 50 میلیگرم بر لیتر و ترکیبی از تتراسایکلین و نیتراتنقره هرکدام به غلظت 50 میلیگرم بر لیتر و آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. در آزمایش اول اکوتیپ لیسار بعنوان بهترین اکوتیپ در ریزنمونههای سالم، در آزمایش دوم 9=pH بهترین عملکرد در ریزنمونههای سالم، و در آزمایش سوم نیترات نقره بیشترین میزان ریزنمونههای سالم را داشت.
واژه های کلیدی: آنتوسیانین،اکوتیپ، تتراسایکلین، فلاونوئید، نیترات نقره
* نویسنده مسئول، تلفن: 09122479233، پست الکترونیکی: ghanbari66@yahoo.com
مقدمه
آلودگیهای قارچی و باکتریایی در زمره شدیدترین آلودگیهای محیطکشت هستند و یک چالش اصلی برای انجام کشت درون شیشهای و تکثیر گیاهان به ویژه گیاهان چوبی با استفاده از کشت بافت و اندام میباشد. این موجودات به سرعت و زودتر از مواد گیاهی رشد یافته و شرایط تعریف شده محیط کشت را تغییر داده و باعث رشد ضعیف یا مرگ ریزنمونهها میشوند (18). با وجود گستردگی گونهها و پراکنش وسیع تیره قرهقاط و جنس وکسینیوم در جهان تنها گونه V. arctostaphylosv L از این جنس در ایران رویش دارند. گسترش طبیعی این گونه در دنیا محدود به مناطق خاص قفقاز و ایران بوده و این مناطق یکی از بهترین رویشگاههای آن بشمار میرود از جمله گونههای مهم این جنس میتوان به V. arctostaphylos اشاره کرد که دراکثرنواحی جنگلی آسیای صغیر، قفقاز و بخشیهایی از اروپا یافت میشود. خاستگاه اصلی V. arctostaphylos مربوط به راشستان جنگلهای شمال ایران میباشد که شامل اکوتیپهای قرهقاط اردبیلی و کلیبری میباشد. اکوتیپ اردبیلی آن در ارتفاعات استان اردبیل، تالش، اسالم و کلاردشت گسترش یافته است (1).
زمانی که از ریزنمونههای رشد یافته در شرایط طبیعی برای کشت درونشیشهای استفاده شود کنترل آلودگی آن بویژه آلودگیهای میکروبی داخلی اهمیت بسیاری پیدا میکند. بطوری که اگر برای مقابله با این بیماریها راهکارهای مناسبی بکار گرفته نشود، بصورت آلودگیهای قارچی و باکتریایی بروز پیدا کرده و کل ریزنمونهها را از بین میبرد (23). منشأ آلودگی میتواند سایر گیاهان و یا عوامل مربوط به شرایط محیطی باشد که بروز آن به نوع گونه، سن و منشأ ریزنمونه در شرایط آب و هوایی وابستگی زیادی دارد. از جمله مواردی که باعث کاهش میزان آلودگی ریزنمونههای رشد یافته در شرایط آب و هوایی میشود، انتخاب زمان مناسب برای تهیه ریزنمونه است که میتواند میزان آلودگی را 3 الی 15 درصد کاهش دهد که در مقیاس تجاری و علمی بسیار اهمیت دارد. هر چند استفاده از آنتی بیوتیکها و آنتی میکروبها در کنترل آلودگی گیاهان چوبی استفاده میشود ولی استفاده بیش از حد از آنتیبیوتیکها و آنتیمیکروبها برای جلوگیری از بیماری، منجر به کاهش رشد گیاه و تقویت اندامهای سخت درون گیاهی میشود (15). همچنین، یکی از مشکلاتی که در کشتدرونشیشهای گیاهان جنگلی بخصوص در گیاهان چوبی مشاهده میگردد عدم یکنواختی پاسخ به شرایط درونشیشهای نسبت به زمان برداشت ریزنمونه میباشد، که باتوجه به ساختار فیزیولوژیکی متفاوت در طی فصول مختلف سال این امر بدیهی است (5). در رابطه با استفاده از الکل 70 درصد عنوان شده است که باعث می شود لایه یمومی سطح کوتیکول حذف شده و محلول ضدعفونی کننده اصلی قدرت نفوذ و تأثیر بهتری بر بافت نمونهها داشته باشد (14). هیپوکلریتسدیم جزء مواد ضدعفونی کننده مؤثری است که در اکثر روشهای ضدعفونی مورد استفاده قرارگرفته است. استفاده از این ترکیب بدلیل سمیت کمتر در مقایسه با کلریدجیوه و نانو ذراتنقره از کارآیی بالایی برخوردار است و در غلظتهای مختلفی و در انواع آزمایشها مورد استفاده قرارگرفته است. مطالعات متعدد نشان داده است که این ترکیب کمترین تأثیر را روی رشد ریزنمونهها دارد. سمیت کمتر این ترکیب باعث گردیده که از آن برای ضدعفونی بذر نیز استفاده شود. بذرهای گیاه H. niger L پس از ضدعفونی با اتانول 96 درصد به مدت 30 ثانیه و سپس محلول هیپوکلریت سدیم حاوی v/v% 1) کلرفعال( به همراه دو قطره توئین 80 به مدت 5 دقیقه، با آب مقطراستریل شستشو داده شدند (2). در کشتبافت بسته به نوع ریزنمونه، چوبی یا علفی بودن ریزنمونه و زمان برداشت آنها از غلظتهای یک الی 5 درصد استفاده میشود (15). روشهای مختلف ضدعفونی و استفاده از آنتیبیوتیکها برای کنترل آلودگی در محیط درونشیشهای مورد استفاده و توصیه شده است، ولی برخی از اینها بهرهوری پایینی و برخی هم اثرات سمی زیادی روی ریزنمونهها دارند. ترکیب آنتیبیوتیک استرپتومایسین با تیامین و جنتامایسین در محیط کشت، مانع از رشد باکتریهای داخلی ریزنمونههای مرکبات و دیگر درختان مثمر گزارش شده است (23). کنترل آلودگی باکتریایی در ریز نمونههای زیتون با استفاده از آنتیبیوتیک سفوتاکسیم بهمیزان 100 میلیگرم در لیتر میسر گردید (6). ضد عفونی ریزنمونههای ریزوم و نوک شاخساره گیاه موز برای کشت درونشیشهای توسط آنتیبیوتیک جنتامایسین، آلودگی باکتریایی درونی را حذف کرده، بهترین نتیجه با تیمار 160 میلیگرم در لیتر آنتیبیوتیک جنتامایسین در مدت یک ساعت و چهل دقیقه گزارش گردید (13). استفاده از کلرید جیوه با غلظت 1/0 درصد به همراه چند قطره تویین20 به مدت 4 دقیقه، به نتایج قابل توجهی در زمینهی ضدعفونی زغال اخته گونه ی Macrocarpa بدست آمد (12). سرشاخههای پایه رویشی پسته قزوینی (“Ghazvini” .P. vera, cv) قطعات ساقه دارای 2-1 جوانه حدود 2 سـاعت در زیرآب جاری شستـشو، سـپس بـا الکـل 96 درصد بـه مـدت 4-3 ثانیـه و کلریـد جیـوه 5 درصد به مـدت 4-3 دقیقـه ضـدعفونی و در نهایت 3 مرتبه با آب مقطـراسـتریل شستـشو شدند (7). نانو ذراتنقره مواد سمی هستند که از قابلیت بالایی برای از بین بردن میکروارگانیسمها، بعنوان مثال، قارچ و باکتریها برخوردار هستند. اثرات مضر نانو ذراتنقره در بیش از 600 میکروارگانیسم گزارش شده است. این قابلیت نانو ذراتنقره بعلت ذرات کوچک آزاد نقره میباشد. این ذرات کوچک پس نه تنها قادر به از بین بردن باکتریها و قارچها میباشند، بلکه ویروسها را نیز نابود میکنند (26). بنومیل در حالت محلول دو ترکیب مهم methyl-2-benzimidazolacarbanat و butyl isocyanate را تولید میکند که روی مسیر تنفسی و انرژیزایی سلولهای قارچ اثر میگذارد. استفاده از غلظتهای بالا برای ضدعفونی ریزنمونهها میتواند روی ریزنمونه نیز اثر منفی بگذارد (21). استفاده از پیش تیمار بنومیل به دلیل خاصیت سیستماتیکی امکان کاهش درصد آلودگی را داشته ولی این امر بستگی زیادی به غلظت بنومیل درون محیط کشت و مدت زمان غوطهوری ریزنمونهها در آن دارد به گونهای که در غلظت بالا و مدت زمان طولانیتر به همان نسبت که میزان آلودگی کاهش مییابد، میزان زندهمانی و رشد ریزنمونهها به تأخیر افتاده و یا از بین میرود (19). در این آزمایش برای اولین بار از نانونقره درجهت ضدعفونی یک گونه Vaccinium استفاده شده است و هیچگونه گزارش قبلی حتی روی گونههای مشابه نیز وجود ندارد. این تحقیق به منظور بررسی تأثیر روشهای مختلف ضدعفونی برای حذف آلودگیهای میکروبی در ارزیابی استقرار و پرآوری ریزشاخسارههای گیاه V. arctostaphylos. انجام گردید.
مواد و روشها
آزمایش اول: ضدعفونی ریزنمونهها با استفاده از هیپوکلریتسدیم، کلریدجیوه و نانو نقره
ریزنمونههای قرهقاط گونهی V. arctostaphylos تهیه شده، از پنج منطقه مختلف شامل سه منطقه سوها (اکوتیپ سوها)، خلخال (اکوتیپ خلخال) و حوران (اکوتیپ حوران) واقع در استان اردبیل و دو منطقه پرهسر (اکوتیپ پرهسر) و لیسار (اکوتیپ لیسار) واقع در استان گیلان جمعآوری شده و به آزمایشگاه کشتبافت گروه علوم باغبانی دانشگاه محقق اردبیلی انتقال یافت. از شاخههای جمعآوری شده، ریزنمونههای حاوی یک تا دو جوانه شامل جوانههای جانبی و انتهایی تهیه شد و بمدت یک ساعت در زیر آبجاری قرار گرفته و سپس ریزنمونهها تحت تیمارهای مختلف ضدعفونی به شرح جدول 1 قرار داده شدند. از محیطکشت پایهی WPM حاوی یک میلیگرمبر لیتر BAP همراه 1/0 میلیگرم بر لیتر IBA و 3 درصد ساکارز و 7/0 درصد آگار جهت کشت ریزنمونههای استریل شده استفاده گردید. pH محیط کشت روی 5/5 تنظیم و به مدت 20 دقیقه تحت دمای 121 درجه سانتیگراد اتوکلاو گردید. ریزنمونهها در شیشههای مربایی قابل اتوکلاو حاوی 25 سیسی محیط تهیه شده، کشت گردیدند بهطوریکه در هر شیشهی آزمایش چهار ریزنمونه قرار داده شد. ریزنمونهها بعد از کشت در محیط کشت مذکور در اتاق رشد تحت شرایط محیطی با دمای c°2±25 و 8/16ساعت تاریکی/روشنایی با لامپهای سرد- سفید (mol m-1S-1µ5/65) نگهداری شدند. شمارش تعداد ریزنمونههای سالم و آلوده پس از چهار هفته انجام گرفت. آزمایش به صورت فاکتوریل بر پایه طرح تصادفی با 4 تکرار انجام گرفت.
آزمایش دوم: تأثیرپیشتیمار با بنومیل و ضدعفونی با تغییر pH هیپوکلریتسدیم بر میزان آلودگی ریزنمونههای قرهقاط
ابتدا آزمایشی برای به دست آوردن مناسبترین pH برای هیپوکلریت سدیم طراحی گردید به این ترتیب که 4 سطح pH شامل (5/6، 9، 5/11و14) و هر سطح از pH در چهار تکرار همرا با تأثیر پیش تیمار ریزنمونهها با 3 گرم بر لیتر بنومیل به مدت 3 ساعت مورد ارزیابی قرارگرفت. تغییر pH با استفاده از اسید استیک و سدیم دو دسیل سولفات (Sodium dodecyl sulfate) صورت گرفت. نحوه ضدعفونی ریزنمونهها به شرح ذیل است.
ریزنمونههای قرهقاط بحالت معمول ابتدا با محلول ظرفشویی به مدت 30 دقیقه شستوشو داده شد و زیر آب جاری به مدت یک ساعت آبکشی شدند. سپس در محلول 3 گرم بر لیتر بنومیل به مدت 3 ساعت غوطهور شدند. بعد از آن ریزنمونهها با اتانول 70 درصد به مدت 50 ثانیه و هیپوکلریتسدیم با pH (5/6، 9، 5/11و14) و حاوی 20Tween به مدت 15 دقیقه، تیمار شد. پس از سه بار آبکشی ریز نمونهها با آب مقطر استریل روی محیطکشت 1/2 MS در ترکیب با 1 میلیگرم بر لیتر BA همراه با 2/0 میلی گرم بر لیتر IAA که از طریق اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد و فشار یک اتمسفر بمدت 15 دقیقه ضدعفونی شده بودند قرارگرفت.
باتوجه به نتایج حاصل از این آزمایش، که برای بررسی نحوه ضدعفونی ریزنمونهها در مرحله استقرار استفاده گردید بعد از این مرحله باتوجه به نتایج این آزمایش اولیه آزمایشی دیگر طراحی شد با هدف حفظ ریزنمونههای مادری و تنها از سطح (9pH=) برای بدست آوردن ریزنمونه برای مرحله پرآوری استفاده شد.
آزمایش اولیه بررسی 4 سطح pH در قالب طرح کاملاً تصادفی با چهار تکرار (پنج ریزنمونه در هر تکرار) انجام گرفت. تعداد ریزنمونههای با آلودگی قارچی و باکتریایی و تعداد ریزنمونههای زنده و رشد کرده حدود 28 روز پس از کشت باتوجه به آلودگیهای مشخص شده که در تصاویر مربوط به این تیمار نیز مشخص میباشد ثبت گردید.
آزمایش سوم: تأثیر نیتراتنقره و تتراسایکلین بعنوان پیش تیمار و روش استریل در ضدعفونی ریزنمونههای قرهقاط
در ابتدا به منظور تشخیص عوامل آلودگی نمونههایی به آزمایشگاه گروه گیاهپزشکی انتقال داده شد با توجه به نتایج آزمونهای تشخیصی (با استفاده از میکروسکوپ )، با توجه به علائم در زیر میکروسکوپ، باکتری تشخیص داده شد و بعد بصورت کشتباکتری ریزنمونهها و استفاده از دیسکهای آنتی باکتریال مختلف که شامل جنتامایسین، استرپتومایسین، کوآموکسیکلاو، تتراسایکلین، سفالکسین و پنیسیلین صورت گرفت. بدین ترتیب که ابتدا ریزنمونه آلوده در زیر هود میکروبیولوژی خرد شده و در داخل ظروف پتری سترون ستریل به همراه آب مقطر اتوکلاو شده به مدت یک ساعت قرارگرفت سپس با استفاده از لوپ از این سوسپانسیون درون محیطکشت باکتری (Nutrient Agar) کشت داده شد باکتری رشد یافته در این محیط بعد از 4 روز به محیطکشت (Nutrient Agar) و بصورت خالص سازی انتقال داده شد. سپس مرحله افزودن دیسکهای آنتی باکتریال بعد از 4 روز صورت گرفت. بعد از یک هفته چرخه رشدی باکتری در ظروف پتری حاوی تتراسایکلین متوقف گردید (شکل 1).
تأثیر پیش تیمار نیتراتنقره 50 میلیگرم در لیتر، تتراسایکلین 50 میلیگرم بر لیتر و ترکیبی از تتراسایکلین و نیتراتنقره هر کدام به غلظت 50 میلیگرم بر لیتر بمدت 24ساعت و ریز نمونههای شاهد به همین مدت و در آب خالی مورد ارزیابی قرارگرفت. در این روش میزان سوختگی در ریزنمونه نسبت به زمانی که از این ترکیبات به صورت مستقیم در ضدعفونی ریزنمونهها استفاده می شد به طور چشمگیری کاهش یافت. نحوه ضدعفونی ریزنمونهها به شرح زیر است: ابتدا ریزنمونهها درون آب دیونیزه با قیچی باغبانی برش داده شد و درون ترکیب تتراسایکلین، نیتراتنقره و ترکیب تتراسایکلین و نیتراتنقره به مدت 24 ساعت قرارگرفت. ریزنمونهها بمدت 30 دقیقه با محلول ظرفشویی شستوشو داده شد. سپس بمدت یک ساعت زیر آب آبکشی شدند. در مرحله بعد ریزنمونههای هر تیمار در محلول 5/1گرم بر لیتر بنومیل بمدت 30 دقیقه غوطهور شدند. بعد از این مرحله ریزنمونهها با اتانول 70 درصد به مدت 50 ثانیه استریل شده و یک بار بمدت یک دقیقه آبکشی گردید و سپس با هیپوکلریت سدیم 5/2 درصد حاوی Tween20 درصد بهمدت 15 دقیقه، تیمار شده و پس از سه بار آبکشی با آب مقطر استریل روی محیطکشت قرارگرفتند. آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با 8 تکرار (5 ریزنمونه در هر تکرار) در تیمار انجام گرفت. تعداد ریزنمونههای دارای آلودگی قارچی و باکتریایی و تعداد ریزنمونههای رشد کرده حدود 28 روز پس از کشت ثبت گردید.
نتایج
آزمایش اول
نتایج حاصل از تجزیه واریانس دادهها (جدول 2) نشان داد که اختلاف معنیداری بین اکوتیپها از نظر درصد ریزنمونه های سالم، آلوده و سوخته وجود دارد. همچنین نتایج مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون دانکن نشان داد که درصد ریزنمونههای سالم در اکوتیپ لیسار بیشترین میزان بود و بعد از آن اکوتیپ خلخال، حوران، سوها و پره سر قرار داشتند.
همچنین براساس نتایج حاصل از تجزیه واریانس، در سطح احتمال 1 درصد اختلاف معنیداری بین تیمارهای ضدعفونی مشاهده گردید. بطوریکه آزمون مقایسه میانگین دانکن نشان داد تیمار T7 (الکل 70 درصد + نانونقره 100 میلیگرم بر لیتر) با 60 درصد ریز نمونه سالم عملکرد بهتری در مقایسه با سایر تیمارها داشتد. در این آزمایش نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد تیمارT5 (الکل 70 درصد + کلرید جیوه 2/0درصد + هیپوکلریت 20 درصد حجمی) بیشترین میزان آلودگی 5/12 درصد و تیمار T6 (الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ نانونقره 100 میلیگرم در لیتر) بیشترین میزان ریزنمونههای سوخته با 75/48 درصد را داشتند.
آزمایش دوم
نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 3) نشان داد که اختلاف معنیداری در سطح احتمال 1 درصد بین تیمارهای مختلف (سطح pH) در ضدعفونی ریز نمونههای قرهقاط وجود دارد بطوری که (جدول 4) تیمار pH2 (9pH=) با 80 درصد ریز نمونه سالم بهترین عملکرد را در ریزنمونههای سالم، تیمار pH4 (14=pH) بعنوان شاهد با 45 درصد ریزنمونه آلوده بیشترین میزان ریزنمونهها با آلودگی باکتری را دارا بودند و تیمار (5/6=pH) با 75 درصد ریزنمونه سوخته بیشترین درصد ریزنمونههای سوخته را داشتند در آلودگی قارچی تفاوت معنیداری در بین تیمارها مشاهده نشد.
آزمایش سوم
نتایج حاصل از تجزیه واریانس (جدول 5) نشان داد که اختلاف معنیداری در بین تیمارهای مختلف (نیتراتنقره، تتراسایکلین و تتراسایکلین + نیتراتنقره) وجود دارد بطوریکه بیشترین تعداد ریز نمونههای سالم مربوط به تیمار نیتراتنقره و بیشترین تعداد ریزنمونههای دارای آلودگی باکتریایی مربوط به شاهد بود و تیمار (تتراسایکلین + نیتراتنقره) دارای بیشترین آلودگی قارچی در ریزنمونهها بود.
جدول 1- تیمارهای مورد استفاده در ضدعفونی ریزنمونههای قرهقاط در پنج منطقه مختلف (حوران، سوها، خلخال، لیسار و پرهسر)
کدتیمار |
موادضدعفونی کننده |
T1 |
الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+هیپوکلریت 5/1 درصد + نانونقره 100 میلیگرم در لیتر |
T2 |
الکل 70 درصد +هیپوکلریت 5/1 درصد + نانونقره 100 میلی گرم در لیتر |
T3 |
الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ هیپوکلریت 5/1 درصد + نانونقره 100 میلیگرم در لیتر |
T4 |
الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ هیپوکلریت 5/1 درصد + نانونقره 100 میلیگرم در لیتر |
T5 |
الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ هیپوکلریت5/1 درصد |
T6 |
الکل 70 درصد +کلرید جیوه 2/0 درصد+ نانونقره 100 میلیگرم در لیتر |
T7 |
الکل 70 درصد + نانونقره 100 میلیگرم در لیتر |
جدول 2-تجزیه واریانس تیمارها و مناطق مختلف بر ریزنمونههای قرهقاط
میانگین مربعات |
|
|||
سوخته |
آلوده |
سالم |
درجهآزادی |
منابع تغییرات |
**89/1200 |
*64/419 |
**60/2361 |
4 |
محیط |
*13/796 |
ns96/191 |
*92/633 |
6 |
تیمار |
**95/1489 |
ns64/169 |
**91/1431 |
24 |
تیمار×محیط |
75/324 |
36/120 |
61/257 |
105 |
خطا |
*، **، ns معنی دار در سطح احتمال 5 درصد، 1 درصد و غیرمعنی دار
جدول 3-تجزیه واریانس اثر pHهای مختلف در ضد عفونی قرهقاط
میانگین مربعات |
|
||||
سوخته |
قارچ |
باکتری |
سالم |
درجهآزادی |
منابع تغییرات |
**5225 |
ns66/166 |
**33/1958 |
**33/2558 |
3 |
تیمار |
33/58 |
33/83 |
75 |
225 |
12 |
خطا |
*، **، ns معنی دار در سطح احتمال 5 درصد، 1 درصد و غیر معنی دار
جدول 4- مقایسه میانگین تأثیر سطوح مختلف pH محلول ضدعفونی در شاخص های تیمار ضد عفونی قرهقاط
تیمار |
سالم |
باکتری |
سوخته |
PH1 |
20c |
5b |
75a |
PH2 |
80a |
0b |
10b |
PH3 |
55b |
35a |
0b |
PH4 |
40bc |
45a |
0b |
اعداد با حروف مشترک در هر ستون دارای اختلاف معنیدار (05/0P<) نمیباشند
جدول5- تجزیه واریانس اثر تیمارهای (نیتراتنقره، تتراسایکلین و تتراسایکلین + نیتراتنقره) در ضد عفونی گیاه قرهقاط
میانگین مربعات |
|
|
||
سوخته |
آلوده |
سالم |
درجه آزادی |
منابع تغییرات |
*43/945 |
4745/83** |
**33/8283 |
35 |
تیمار |
07/216 |
133/92 |
85/267 |
28 |
خطا |
*، **، ns معنیدار در سطح احتمال 5 درصد، 1 درصد و غیرمعنیدار
|
||||||
|
||||||
|
||||||
شکل1- کشت باکتری: الف) باکتری در مرحله کشت ب) باکتری در مرحله خالص سازی پ) باکتری در مرحله اضافه کردن دیسک آنتی باکتریال
بحث و نتیجه گیری
باتوجه به نتایج آزمایش اول از بین پنج اکوتیپ مورد بررسی لیسار بهترین عملکرد را از نظر ریزنمونههای سالم داشت. که ممکن است بهدلیل کمتر آلوده بودن منطقه نمونهگیری باشد (شکل 2). از عوامل مؤثر در آلودگی ریزنمونهها منشأ ریزنمونه، روش جمعآوری ریزنمونهها ، نوع بافت و مورفولوژی ریزنمونهها میباشد. همچنین در بین تیمارهای ضدعفونی تیمارT7 (الکل 70 درصد + نانونقره 100 میلیگرم بر لیتر) بهترین عملکرد را در میزان ریز نمونههای سالم داشت که ممکن است بخاطر اثرات مخرب کمتر ناشی از استفاده از نانو نقره بر روی جوانهها در مقایسه با کاربرد کلرید جیوه و هیپوکلریت سدیم باشد (شکل های 3 و 4).
شکل 2- مقایسه میانگین اثر متقابل مناطق (حوران، سوها، خلخال، لیسار و پرهسر) و تیمار بر ریزنمونههای سالم گیاه قرهقاط
شکل3- مقایسه میانگین اثر متقابل مناطق (حوران، سوها، خلخال، لیسار و پرهسر) و تیمار بر ریزنمونههای سوخته گیاه قرهقاط
شکل 4- مقایسه میانگین اثر مناطق (حوران، سوها، خلخال، لیسار و پرهسر) بر ریزنمونههای آلوده گیاه قرهقاط
|
|
|
شکل 5-تأثیرpHهای مختلف هیپوکلریت سدیم بر روی درصدآلودگی و درصد قهوهای شدگی و درصد رشد ریزنمونههای قرهقاط در کشت درونشیشهای، الف: 5/6=pH ب: 14=pH پ: 9=pH
شکل6- تأثیر تیمارهای (نیترات نقره و تتراسایکلین) در ضد عفونی ریز نمونههای گیاه قرهقاط
|
|
|
ا
شکل7- تأثیر تیمارهای (نیترات نقره و تتراسایکلین) در ضد عفونی ریز نمونههای گیاه قرهقاط
تحت چنین شرایطی باید به دنبال مادهای گشت که علاوه بر تأثیر مناسب روی آلودگی ریزنمونهها، مخاطرات کمتری هم برای انسان و هم برای محیطزیست داشته باشد. کمترین مقدار آلودگی در ریزنمونههای استریل شدهی قرهقاط بمیزان 43 درصد در تیمار کلرید جیوه 03/0 درصد بمدت دو دقیقه، اتانول 70 درصد به مدت دو دقیقه و هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد کلر فعال به مدت 15 دقیقه و 3 بار شستشو با آب مقطر بدست آمد (3). در مطالعه انجام گرفته روی گونه R. nigrum شستشوی ریزنمونهها در آب جاری بمدت 5/1 تا 2 ساعت و قرار دادن در الکل 70 درصد بهمدت یک دقیقه و سفیدکننده 10 درصد بمدت 10 دقیقه و در نهایت سه مرتبه شستشو در آب مقطر استریل بعنوان تیمار ضدعفونی مناسب برای این گونه معرفی شد (25). در مورد قرهقاط قرمز حذف برگهای توسعه یافته و فروبردن در محلول تازه کلرید جیوه 15/0 درصد بمدت یک دقیقه که چند قطره محلول Tween 20 افزوده شده را بعنوان تیمار ضد عفونی مناسب معرفی کردند (27). در گونه magellanicumR.. نیز استفاده از هیپوکلریت سدیم یک درصد کلر فعال که تنها 12 درصد آلودگی داشتند و 70 درصد ریزنمونهها زنده ماندند (10).
ضدعفونی ریزنمونههای گیاه Citrus grandis با استفاده از کلرید جیوه 1/0، 2/0، 3/0 و 4/0 درصد بمدت 3 الی 10 دقیقه 100 درصد ریزنمونهها آلودگی قارچی را مشاهده گردید (22). ولی در این آزمایش وقتی از کلریدجیوه استفاده گردید درصد آلودگی کمتری را نسبت به آزمایش راستگو مشاهده نمودیم که این امر نشان میدهد نوع ژنوتیپ هم روی درصد نمونههای سالم تأثیر بهسزایی دارد. کلرید جیوه به طور گسترده برای کنترل آلودگی گیاهان چوبی استفاده شده است ولی این ماده بسیار سمی بوده و باید با دقت بالایی مورد استفاده قرارگیرد. چنین مواد شیمیایی نهتنها برای ریزنمونه بیش از حد سمی است برای محیطزیست نیز مخاطره آمیز است (17).
در آزمایش دوم به بررسی تأثیر تغییرpH محلول ضدعفونی پرداخته شد به طور کلی تنظیم pH هیپوکلریتسدیم برای افزایش کارآیی ضدعفونی و کنترل آلودگی ریزنمونههای قرهقاط در شرایط درونشیشهای تأثیر معنیداری داشت. بطوریکه استفاده از هیپوکلریتسدیم 5/2 درصد بدون تنظیم pH (14pH=) حتی به مدت 15 دقیقه قادر به کنترل مؤثر آلودگی ریزنمونههای قرهقاط نبود و در تیمار هیپوکلریتسدیم همراه با چند قطره Tween20 بدون تنظیم pH بمدت 15 دقیقه بیشترین درصد آلودگی باکتریایی و قارچی بدست آمد. کمترین درصد آلودگی قارچی مربوط به تیمار ضدعفونی هیپوکلریتسدیم با 5/6pH= بود ولی از لحاظ درصد قهوهایشدگی و سوختگی بیشترین درصد ریزنمونهها را در برگرفت. از نظر درصد رشد ریزنمونهها بهترین عملکرد در ریزنمونههای سالم در ریزنمونههای مربوط به تیمار pH (9pH= ) بدست آمده و با تغییر pH هیپوکلریتسدیم (9 و 5/11pH=) درصد آلودگی نسبت به هیپوکلریتسدیم بدون تنظیم pH (14pH=) کاهش نشان داد (شکل 5). اثر تغییر pH محلول استریل کننده (هیپوکلریتسدیم) با غلظتهای مختلف و مدت زمان متفاوت بر کنترل آلودگی درونی ریزنمونههای بافت گره Eupatorium odoratum بررسی گردید و نشان داده شد که پس از ضدعفونی سطحی ریزنمونههای گره با هیپوکلریتسدیم 5% با 7pH= میزان آلودگی تا 84 درصد در مقایسه با عدم تنظیم pH کاهش یافته است در آزمایش بعدی روی گره گیاه Andrographis paniculata با استفاده از هیپوکلریتسدیم 10 و 20% بمدت 20 دقیقه در 7 و5/12pH= نیز بیان کردند که در 7pH= درصد آلودگی قارچی در مقایسه با 5/12pH= کمتر است (19) که این نتایج با یافتههای پژوهش حاضر مطابقت دارد. به نظر میرسد که در اثر کاهش میزان pH هیپوکلریتسدیم، یونهای OCl- فعال بیشتری از ترکیبONaCl، آزاد شده و روی ساختار پمپهای انتقال الکترون و سایر اندامکهای حیاتی اثر میگذارد (15). بنابراین با کاهشpH هیپوکلریتسدیم به 5/6pH=، میزان یونهای فعال بسیار زیاد بوده و در نتیجه علاوه بر، از بین بردن آلودگی سطحی و درونی ریزنمونهها به خود سلولهای ریزنمونه نیز آسیب جبران ناپذیری وارد کرده و آنها را نیز از بین میبرد. بطوریکه بخش عمدهای از ریزنمونههای قرهقاط در تیمار ضدعفونی هیپوکلریتسدیم 5/2 درصد با 5/6pH= قهوهای شده و از بین رفتند. ولی به نظر میرسد که محلول هیپوکلریتسدیم با 9pH= تعادل مناسبی از نظر یونهای فعال –Ocl ایجاد شده که علاوهبر کنترل مؤثر آلودگی قارچی و باکتریایی ریزنمونههای قرهقاط، زندهمانی و رشد آنها را هم در مقایسه با هیپوکلریتسدیم بدون تنظیم pH کاهش نداده است.
در آزمایش سوم نیز به بررسی تأثیر نیترات نقره و تتراسایکلین در ضدعفونی ریز نمونههای قره قاط پرداخته شد (شکل 6). با استفاده از نانونقره در ضدعفونی گیاه فندق نشان داده شد که تیمار نانو ذرات در کنترل آلودگیهای ریزنمونههای فندق مؤثر بود اما غلظتهای بالا باعث صدمات شدید به ریزنمونه میشود (4). تیمار مختلف نانو ذرات نقره بیشترین تأثیر را در کنترل آلودگی باکتریایی و قارچی گیاه فندق داشتند. بهترین تیمار برای حذف آلودگی باکتریایی در این گیاه غلظت 100 میلیگرم در لیتر به مدت 120 دقیقه بود. بطوری که درصد آلودگی قارچی و باکتریایی 33/83 درصد کاهش یافت و 66/66 درصد ریزنمونهها رشد کرده و شاخه تولید کردند (9). اثرات نانوذراتنقره را بر کنترل آلودگی داخلی سنبلالطیب (Valeriana afficinalis L.) نشان داده شد این محققان بهترین تیمار برای رفع آلودگی سطحی ریزنمونه سنبلالطیب در محلول 100 میلیگرمبرلیتر نانو ذراتنقره به مدت 60 دقیقه را گزارش نمودند. فروبردن ریزنمونه زیتون در نانو ذراتنقره پس از استریل سطحی نیز نشان داده که نانو ذراتنقره در کنترل آلودگی باکتریایی و قارچی بسیار مؤثر است. با اینحال، این روش قابل اجرا برای ریزنمونههای زیتون به دلیل صدمات شدید نیست (24). از لحاظ پایین بودن درصد سوختگی و آلودگی ریزنمونهها با حمام آنتیبیوتیک تتراسایکلین در غلظتهای 500 میلیگرم در لیتر بهمدت چهار ساعت و 100میلی گرم در لیتر بمدت یک و چهار ساعت در گیاه انگور بدست آمد (8). در این آزمایش بیشترین ریزنمونههای سالم مربوط به تیمار نیترات نقره بود. مکانیسم عمل ذرات نانونقره در از بین بردن میکروارگانیسمها به وضوح شناخته نشده است. با این حال نشان داده شده است یونهای مثبت نقره آزاد به آرامی میتواند ساختار سلولی میکروارگانیسم ها را از بین برد. (16). اثرات Ag++ روی میکرو ارگانیسمها ممکن است بدلیل فعالیت در بخش Chemosmotic باشد. این محققان نشان دادند که یونهای Ag++ از طریق تحت تأثیر قرار دادن فسفو لیپیدها، غشا سلولی میکروارگانیسمها را نابود میکنند. علاوه براین، یون های Ag++ممکن است، جایگزین گروه گوگرد (SH-) در غشای سلول شده وسلولهای میکروارگانیسمها را نابود کند (11). موقع استفاده از نانو نقره سطح تماس با میکروبها بهمقدار زیادی افزایش یافته در نتیجه اثرات ضدمیکروبی آن تقویت میشود، اگر چه نحوه عمل نانو نقره روی میکروبها بخوبی مشخص نشده ولی فرضیههایی مبنی بر لیز شدن سلول و همچنین مهار رشد میکروبها توسط نانو نقره پیشنهاد شده است (20).
نتیجه کلی
به دلیل این که ریزنمونههای قرهقاط از محیط بیرونی و جنگلی جمعآوری شدند و از آن جهت که ریزنمونههای مورد نظر از درصد آلودگی بالایی در محیطکشت برخوردار بودند. بنابراین اولویت اول این آزمایش استفاده از روشهای مختلف ضدعفونی جهت از بین بردن بیماریهای درونی بخصوص باکتریها بود تا ریزنمونههایی با کمترین درصد آلودگی و با بیشترین درصد زندهمانی و بیشترین پتانسیل رشد و در نهایت استقرار مطلوب به دست آید. بهترین پاسخ از نظر درصد آلودگی کمتر و درصد زندهمانی و رشد بیشتر مربوط به تیمار ضدعفونی ریزنمونهای با الکل 70 درصد+ نانوسیلور 100 میلیگرم بر لیتر بدست آمد. تنظیم pH هیپوکلریتسدیم راهکار مناسبی برای رفع آلودگی ریزنمونههای قرهقاط جهت کشت درون شیشهای بود. بدین صورت که تغییر pH هیپوکلریت سدیم از14 به 9، درصد آلودگی را بسیار کاهش داد (صفر درصد) اما درصد زندهمانی را در 5/6pH= نیز بسیار کاهش داد در 14pH= عملکرد بسیار ضعیفی از نظر رفع آلودگی درونی و زندهمانی ریزنمونه مشاهده شد. استفاده از تیمار نیتراتنقره، تتراسایکلین و نیتراتنقره+تتراسایکلین برای ضد عفونی ریزنمونههای قرهقاط بهعنوان بهترین تیمار ارزیابی شد بهنحوی که میزان آلودگی باکتری با استفاده از نیتراتنقره به صفر کاهش یافت.
سپاسگزاری
بدینوسیله نویسندگان مراتب تشکر و امتنان خود را از زحمات و تلاش انجام شده توسط مهندس حمیدرضا حیدری را در طی اجرای پروژه ابراز میدارند.