تنوع فنوتیپی و ژنوتیپی جمعیت‌های ایرانی قارچ عامل خشکیدگی شمشاد خزری
 (Buxus hyrcana Pojark.)

سیده معصومه زمانی^1* و شیده موجرلو²

¹ ایران، تهران، آموزش و ترویج کشاورزی، سازمان تحقیقات، موسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور

² ایران، شاهرود، دانشگاه صنعتی شاهرود، دانشکده کشاورزی، گروه گیاه‌پزشکی و باغبانی

تاریخ دریافت: 01/08/1397          تاریخ پذیرش: 25/10/1397

چکیده

شمشاد خزری از معدود درختان پهن­برگ همیشه­سبز جنگل­های شمال البرز است که متأسفانه در فهرست گونه­های در معرض خطر قراردارد. همچنین، اخیراً اغلب رویشگاه‌های شمشاد در شمال کشور به بیماری بلایت و خشکیدگی ناشی از قارچ Cylindrocladium buxicola مبتلا شده­اند که خطر جدی برای بقا و تولید درختان شمشاد است. شناسایی ویژگی­های جمعیت­های این قارچ می‌تواند در گزینش استراتژی­های مدیریت آن ارزشمند باشد. دراین تحقیق باهدف افزایش اطلاعات در خصوص جمعیت­های ایرانی قارچ عامل بیماری، خصوصیات فنوتیپیِ جدایه‌های C. buxicola بدست آمده طی نمونه‌برداری تصادفی از رویشگاه­های شمشاد شمال کشور، ارزیابی و تنوع ژنتیکی این جدایه‌ها براساس نشانگر ژنومی rep، بررسی شد. با ارزیابی ویژگی­های مورفولوژیکی (شامل شکل و میزان رشد پرگنه، اندازه و شکل کنیدیوم، طول پایه، شکل و اندازه وزیکول انتهایی) در 52 جدایه بدست آمده، تطابق ریخت­شناسی تمام جدایه­ها با گونه Calonecteria pseudonaviculata تأیید گردید. بررسی شدت بیماری­زایی 21 جدایه منتخب قارچی نشان داد این جدایه­ها در گروه­های بیماری­زایی متفاوتی قرار دارند. آنالیز الگوهای باندی آغازگرهای ژنومی rep، نشان داد 21 جدایه­های منتخب بیش از 95 درصد تشابه ژنتیکی داشته و در این سطح از تشابه به چهار گروه تقسیم شدند. جدایه­های گروه­های مختلف ژنتیکی در هر سه استان وجود داشتند. تمام جدایه‌های مورد مطالعه با قبول میزان تغییرات طبیعی درون­گونه‌ای، متعلق به گونه اصلی C. pseudonaviculta بوده و خصوصیات اصلی و پایدار مورفو-فیزیولوژیک این‌گونه را داشتند. نظر به نرخ پایین تنوع میان جدایه­ها، به نظر می­رسد در کنترل این بیماری، استفاده از ارقام مقاوم مهمترین راهکار است.

واژه‌های کلیدی: بیماری‌زایی، ریخت‌شناسی، ژنتیک جمعیت و Cylindrocladium buxicola.

* نویسنده مسئول، تلفن:    5-۴۴۷۸۷۲۸۲- ۰۲۱، پست الکترونیکی: mzamani@rifr-ac.ir

مقدمه

در سال­های اخیر با پیشرفت علوم طبیعی، اهمیت تنوع زیستی در زمینه­های مختلف آشکار شده و اهداف مدیریت جنگل­ها به سمت افزایش تنوع زیستی متمرکز شده است.به‌طوری که امروزه حفظ تنوع زیستی از مهمترین مسائل در مدیریت پایدار جنگل­ها قلمداد می­گردد (21). اهمیت جنگل­های ناحیه رویشی هیرکانی ازنظر حفظ ذخائر ژنتیکی و وجود برخی از گونه­های گیاهی که منحصر به این منطقه می­باشند، همچنین نقش حیاتی آن در ابعاد مختلف اقتصادی، اجتماعی، تعادل محیط‌زیست، حفاظت و تثبیت اکوسیستم­ها، توجه مدیران را در سطح منطقه و ملی به خود جلب کرده است (13). از مسائل مهم و حاد آن جنگل­ها تخریب ناشی از عوامل انسانی و طبیعی می­باشد که در دهه اخیر، جنگل­های ناحیه هیرکانی را با وضعیت بحرانی مواجه ساخته است.

شمشاد خزری (Buxus hyrcana Pojark) از درختان همیشه سبز جنگل­های هیرکانی است که در فهرست گونه­های گیاهی درخطر انقراض اتحادیه بین­المللی حفظ طبیعت (IUCN) قرار دارد. این‌گونه بومی جنگل‌های ایران از حوالی دوره کرتاسه در دوران مزوزوئیک در جنوب دریای کاسپین تا ارتفاعی از نیم­رخ شمالی رشته‌کوه البرز ظاهر شده است و سابقه پیدایش آن به حدود 135 میلیون سال قبل می­رسد (13). این‌گونه به‌ دلیل اهمیتی که دارد ممنوع‌القطع است، اما در سال‌های اخیر سطح قابل‌توجهی از جنگل­های شمشاد دچار بیماری بلایت یا سوختگی شده است و این خشکیدگی در تمام مراحل زیستی این‌گونه از نهال تا درخت مسن به چشم می‌خورد. این در حالی است که به علت محدود بودن شمشادها چنانچه این‌گونه نابود شود، یکی از ذخایر گونه گیاهی باارزش ایران از بین خواهد رفت، از این‌رو چگونگی برون‌رفت از این مسئله دغدغه اصلی دست اندرکاران منابع طبیعی کشور می­باشد. عامل این بیماری به گونه­ای از قارچ Calonectria از خانواده آسکومیست­ها نسبت داده شده است (C. pseudonaviculatum: syn. Cylindrocladium pseudonaviculata, C. buxicola) که تک میزبانه و دارای چرخه‌های بیماری کوتاه و سریعی (کمتر از یک هفته) بوده و وقوع آن سبب ایجاد حالت سوختگی در برگ شمشاد، توسعه آن موجب خزان درخت و استمرار آن در چند سال متوالی منجر به خشکیدگی درخت خواهد شد (12).

این بیماری اولین بار در سال 1390 در شمشادستان­های جنگل­های آستارا مشاهده شد و از همان زمان به‌سرعت در سطح وسیعی از گستره پوشش درختان شمشاد در جنگل­های هیرکانی شیوع یافت (17و 18). بروز این بیماری و خطر انقراض گونه شمشاد ضرورت برنامه­ریزی و تدوین راهبردهای مناسب برای مبارزه با این بیماری را ایجاب می­کند، از طرفی مهمترین گام در مدیریت و کنترل یک بیماری‌ گیاهی، داشتن اطلاعات کافی از دامنه تغییرات طبیعی در خصوصیات ریخت‌شناسی، فیزیولوژیکی و بیماری‌زایی جمعیت‌های بیمارگر مربوطه است، چراکه این مسئله ما را در تنظیم استراتژی‌های کنترل کارآمدتر، توانا می‌سازد. بطور مثال زمانی که یک اپیدمی رخ می‌دهد، دانستن پاسخ این سؤالات که آیا اپیدمی درنتیجه مساعد شدن شرایط محیطی برای بیماری پیش‌آمده، یا به دلیل ایجاد موتاسیون در ژنتیک بیمارگر و به وجود آمدن یک جدایه جدید از بیمارگر که ویرولانس بیشتری دارد، رخ‌داده است، می‌تواند در اعمال مدیریت مؤثر بیماری نقش مهمی داشته باشد (15). بنابراین اگر استراتژی‌های کنترل بخواهند مؤثر واقع شوند می‌بایست به‌جای تمرکز روی حالت انفرادی و ویژه، جمعیت‌ها را هدف قرار دهند (16). از این‌رو در کشورهای مختلف جهان تحقیقات گسترده‌ای به‌منظور شناسایی جمعیت­های این قارچ انجام شده است (3، 4و 19). درحالیکه در ایران اطلاع دقیقی در خصوص تنوع جمعیت‌های این قارچ در دست نیست و بالا بردن اطلاعات در این زمینه مسلماً در اتخاذ روش‌های مؤثر کنترل و میزان موفقیت پس از اعمال این روش‌ها نقش خواهد داشت. از سوی دیگر در بیماری­شناسی گیاهی برای دستیابی به بهترین روش مدیریت یک بیماری، شناسایی فاکتورهایی که مهم­ترین نقش را در تکامل بیمارگر دارند و اینکه چگونه این نیروهای تکاملی برهم اثر متقابل دارند تا ترکیب ژنتیکی و پتانسیل تکاملی جمعیت‌های بیمارگر را رقم بزنند بسیار حائز اهمیت است (10)، بنابراین شناسایی ساختار فنوتیپی و ژنوتیپی جمعیت بیمارگرها اهمیت زیادی دارد. درمجموع، در یک‌گونه معین قارچی، جدایه­ها ممکن است اختصاصی میزبان و (یا) زیستگاه باشند یا ممکن است با منشأ جغرافیایی شناخته شوند. لذا تعیین نقش میزبان یا محیط‌زیست در هدایت سازگاری ژنتیکی جمعیت‌ها، برای شناسایی جدایه‌های بیمارگر در هر منطقه و به دنبال آن کنترل این جدایه در یک محیط‌زیست خاص، اهمیت به­سزایی پیدا می‌کند (16).

هدف این تحقیق شناسایی تنوع مورفولوﮊیکی، بیماری‌زایی و ژنتیکی جدایه­های C. pseudonaviculatum در ایران بود، تا به استناد آن بتوان در جهت مدیریت بهتر بیماری اقدام نمود. مسلماً مطالعه ساختار جمعیتی قارچ­های بیمارگر، نه‌تنها به اتخاذ استراتژی‌های مؤثر در کنترل می‌انجامد، بلکه در برنامه‌های تولید ارقام مقاوم و تعیین سیاست‌های قرنطینه‌ای مؤثر نیز نقش اساسی دارد.

مواد و روشها

1- نمونه‌برداری: طی سال‌های 1393-1396 ضمن بازدید از رویشگاه­های شمشاد در استان­های مازندران، گیلان و گلستان، نمونه‌های گیاهی (شامل سرشاخه‌ها، برگ­ها و یا گیاهچه­های در حال خشک شدن) مشکوک به آلودگی بلایت که دارای آثاری از قارچ و یا علائمی از این بیماری بودند (خشکیدگی، لکه برگی، بار قارچی و غیره)، بطور تصادفی از درختان شمشاد جمع‌آوری و پس از ثبت مشخصات گیاه بیمار، رویشگاه و تاریخ نمونه‌برداری، جهت جداسازی بیمارگر در شرایط خنک سریعاً به آزمایشگاه منتقل گردیدند (شکل 1).

شکل 1- جمع‌آوری سرشاخه‌های دارای علائم آلودگی (خشکیدگی، لکه برگی، بار قارچی) Cylindrocladium buxicola از درختان شمشاد

2- جداسازی بیمارگر: برای جداسازی بیمارگر از بافت­های گیاهی، ابتدا سرشاخه‌ها به قطعات حدوداً ده سانتی‌متری تقسیم و سپس به مدت یک ساعت تحت جریان آب معمولی پیش‌سترون‌سازی شدند. پس از این مرحله‌، سرشاخه‌ها به قطعات حدوداً 3 تا 4 سانتی‌متری که حاوی برگ­های دارای علائم بودند برش داده شده و به اتاقک کشت استریل منتقل شدند. در اتاقک کشت نمونه‌ها در محلول سترون کننده ﻫﻴﭙﻮﻛﻠﺮﻳﺖ ﺳﺪﻳﻢ یک درصد ضدعفونی و از این قطعات نمونه‌هایی شامل برگ و قطعات ساقه از حدفاصل بافت آلوده و سالم جدا و در محیط سیب‌زمینی-‌دکستروز-‌آگار (PDA) کشت گردید. ظروف پتری در دمای 25 -23 درجه سانتی­گراد تا زمان ایجاد و رشد کلنی قارچی نگهداری شدند. سپس از نوک ریسه واقع در حاشیه رشد قارچ برداشته و به محیط PDA منتقل شد. روش دیگر جداسازی قارچ، قرار دادن برگ­ها و ساقه­های آلوده در دسیکاتور مرطوب در دمای 25 -23 درجه سانتی­گراد به­منظور القاء اسپورزایی قارچ بود. برای این منظور ابتدا نسوج آلوده برگ و سرشاخه­ها تفکیک و پس از ضدعفونی با محلول هیپوکلریت سدیم (یک درصد) روی کاغذ صافی سترون درون ظروف پتری در داخل دسیکاتور قرارداده شدند. در مواردی که قارچ روی بافت تولید لایه اسپوری (متشکل از میسلیوم و اسپورهای قارچ) نموده بود، جداسازی قارچ با کشیدن یک لوپ به این لایه و انتقال آن به محیط PDA صورت گرفت (شکل 2).

ایزوله­های قارچی بدست آمده، با توجه به خصوصیات ماکروسکوپی (ریخت‌شناسی، الگوی رویشی و رنگ پرگنه) و میکروسکوپی (خصوصیات کنیدیوم­ها) و مطابقت این ویژگی­های ریخت‌شناسی با منابع موجود (4، 5و 6) و نیز با عنایت به توصیف مجدد گونه توسط هنریکات و کالهام (11) شناسایی شده و با روش تک اسپور نمودن روی محیط سیب‌زمینی- هویج- آگار خالص­سازی شدند.

شکل 2- خلاصه اقدامات انجام شده جهت جداسازی قارچ Cylindrocladium buxicola از درختان شمشاد

3- بررسی خصوصیات مورفولوژیک و فیزیولوژیک جدایه‌های قارچ Cylindrocladium buxicola

3- 1- بررسی سازگاری جنسی و اندام­های زایشی جنسی: به‌منظور مشخص شدن هموتال بودن احتمالی جدایه‌ها، هریک از جدایه‌ها به‌تنهایی و در سه تکرار در پتری حاوی محیط سیب‌زمینی- دکستروز- آگار و نیز سیب‌زمینی- هویج- آگار کشت و بعد از دو هفته نگهداری در دمای 22 درجه سانتی­گراد، بطور هفتگی در زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی X20 بررسی شدند. این نگهداری و مونیتورینگ تا 3 ماه ادامه یافت. برای بررسی سازگاری جنسی و تولید احتمالی اندام زایشی جنسی پریتسیوم در این جدایه­ها، از کشت متقابل آنها استفاده شد. بدین ترتیب که برای هر جدایه، برش‌هایی به قطر پنج میلی‌متر از حاشیه کشت آن جدایه به همراه قطعه‌ای پنج میلی‌متری از هریک از دیگر جدایه در یک پتری حاوی محیط کشت سیب‌زمینی دکستروز آگار یا سیب‌زمینی هویج آگار به فاصله سه سانتی­متر از هم قرارداده و سپس در دمای 22 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. از زمانی که حاشیه دو کلنی به یکدیگر رسید، احتمال وجود اندام‌های زایشی جنسی در زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی X20 بررسی شد و این نگهداری و مونیتورینگ تا 3 ماه ادامه یافت (11).

3- 2- بررسی ویژگی­های ریخت‌شناسی اندام­های زایشی غیرجنسی: به‌منظور بررسی ساختارهای غیرجنسی در هریک از جدایه­های قارچی از سه پتری مجزای آن جدایه سوسپانسیون اسپور تهیه شد (9) و مورد بررسی قرار گرفت. پس از تهیه اسلایدهای مناسب، برای هر جدایه شکل کنیدیوم، نحوه تشکیل آن، طول و پهنای کنیدی و اندازه و شکل پایه به‌طور تصادفی در 30 عدد از این اندام‌ها برای هر جدایه، اندازه­گیری و میانگین اندازه­ها محاسبه گردید. برای مشاهده و ثبت الگو، رنگ و ظاهر پرگنه قارچی از محیط کشت عصاره مالت آگار (MEA) استفاده شد (9و 11).

3- 3- نرخ رشد خطی قارچ­ها در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: ابتدا از هریک از جدایه­های قارچی محیط کشت هفت‌روزه بر پایه محیط PDA در دمای 20 درجه سانتی­گراد تهیه شد. برای تعیین نرخ رشد قارچ­ها قرص آگار پنج میلی‌متری از حاشیه پرگنه در حال رشد جدایه­ها به مرکز پتری دیش­های محتوی محیط PDA (حدود 20 میلی‌لیتر محیط کشت در ظروف پتری نه سانتیمتری) انتقال داده شد. سپس محیط کشت­های تلقیح شده در انکوباتور 25 درجه سانتی­گراد به مدت هفت روز نگهداری شدند. برای هر جدایه سه تکرار در نظر گرفته شد. دو قطر عمود بر هم پرگنه هریک از قارچ­ها در هر تکرار اندازه­گیری و میانگین­ها برای هر جدایه محاسبه شد. برای محاسبه نرخ رشد میسلیوم، اندازه قطر دیسک­های اولیه که روی محیط­های کشت قرار داده شده بودند از اندازه قطر پرگنه کم شد.

3-4- بررسی توانایی رشد قارچ در دمای بالاتر از 25 درجه سانتی­گراد: برای تعیین توانایی و نرخ رشد قارچ در دمای بالاتر از 25 درجه سانتی‌گراد، قرص آگار به قطر پنج میلی­متر از حاشیه پرگنه فعال قارچ (تهیه‌شده مطابق بند 3- 3) در محیط کشت سیب‌زمینی- دکستروز- آگار (حدود 20 میلی‌لیتر محیط کشت در ظروف پتری نه سانتیمتری) در سه تکرار کشت و پتری‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 25 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. سپس رشد شعاعی پرگنه هر جدایه در این 24 ساعت با کشیدن یک دایره در پشت پتری علامت‌گذاری و کشت‌ها به دمای 26-34 درجه سانتی­گراد به فاصله 2 درجه سانتی­گراد در سه تکرار منتقل گردیدند. بعد از ده روز، رشد شعاعی پرگنه هر جدایه با کشیدن دایره دیگری در پشت پتری مشخص و دمای حداکثر برای رشد قارچ تعیین گردید.

3- 5- دمای غیرفعال شدن کنیدیوم جدایه­ها: جهت تعیین دمای غیرفعال شدن کنیدیوم­های قارچ در دمای بالاتر از 25 درجه سانتی­گراد، قرص آگار به قطر پنج میلی­متر از حاشیه پرگنه فعال قارچ (تهیه شده مطابق بند 3- 3) در محیط سیب‌زمینی- هویج- آگار در سه تکرار کشت و پتری‌ها به مدت 10 روز در دمای 25 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. بعد از ده روز، ظروف تحت نور آزمایشگاه به مدت دو تا سه روز قرارگرفتند. به این پتری‌ها آب مقطر استریل اضافه گردید و درون یخچالی تحت دمای 10 درجه سانتی­گراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شدند، سپس پتری­ها در دمای 25 درجه سانتی­گراد به مدت 30 دقیقه نگهداری شدند تا کنیدی­ها از کنیدی­برها آزادسازی شوند. سپس سوسپانسیون­های بدست آمده در غلظت 10⁴×1 اسپور در میلی‌لیتر تنظیم و به دمای 26-34 درجه سانتی­گراد بافاصله 2 درجه سانتی­گراد در سه تکرار منتقل گردیدند. پس از 24 ساعت ده قطره از این سوسپانسیون حاوی اسپور در سطح پتری حاوی آب- آگار دو درصد پخش شد. پتری­ها به مدت 24 ساعت در دمای 25 درجه سانتی­گراد نگهداری گردیدند. سپس پتری‌ها در زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی X10 بررسی شد و وجود تک اسپورهای جوانه‌زده مورد ارزیابی قرارگرفت (8).

3- 6- تعیین تنوع بیماری‌زایی جدایه‌های قارچ Cylindrocladium buxicola: پس از بررسی و اندازه‌گیری ابعاد ساختارهای رویشی و زایشی برای هر جدایه، متنوع‌ترین جدایه‌ها انتخاب و برای بررسی تنوع بیماری­زایی و نیز تولید توده میسلیومی، استخراج DNA و سپس مطالعات مولکولی استفاده شدند.

برای ارزیابی ویژگی­های بیماری­زایی جدایه‌ها، روش شیشکوف و همکاران (2014) مورد استفاده قرارگرفت. جهت تهیه مایه تلقیح قارچ، از کشت هریک از جدایه­ها در محیط آب آگار 2 درصد به همراه برگ میخک و قرار دادن کشت­ها در تناوب 12 ساعت تاریکی/ روشنایی تحت نور نزدیک فرابنفش جهت اسپورزایی استفاده شد. پس از 14 روز اسپورهای ایجاد شده با استفاده از آب مقطر استریل (به همراه 1/0 درصد تویین 20) از ظروف پتری جمع­آوری و در غلظت 10³×2 اسپور در میلی­لیتر تنظیم شدند. مایه‌زنی با روش فروبردن سرشاخه­های بریده شده (دارای 10 تا 12 برگ) از نهال‌های شمشاد سالم در ارلن حاوی 500 میلی­لیتر سوسپانسیون اسپور به مدت 5 ثانیه انجام شد. سپس شاخه­های تلقیح شده در فالکون­های 50 میلی­لیتری پر شده با آب قرار داده شدند. در هر فالکون سه‌شاخه و برای هر جدایه 3 فالکون (به‌عنوان 3 تکرار) تهیه شد که مجموعاً درون گلدانی قرار داده شده و به‌منظور ممانعت از تأثیر سایر جدایه­های قارچی و نیز تأمین رطوبت بهینه جهت جوانه‌زنی اسپور، توسط پوشش نایلونی محصور گردید. در گلدان شاهد، سرشاخه‌ها به‌جای سوسپانسیون اسپور در آب مقطر استریل فروبرده شدند. نگهداری گلدان­ها در ژرمیناتور با رطوبت 90 درصد و دمای 25 درجه سانتی­گراد و دوره نوری 16 ساعت نور (5000 -3000 لوکس) و 8 ساعت تاریکی صورت گرفت (شکل 3).

شکل 3- مایه‌زنی نهال­های شمشاد با جدایه­های Cylindrocladium buxicola

ارزیابی شدت بیماری روی سرشاخه­ها، 7 و 11 روز پس از تلقیح مورد ارزیابی قرارگرفت. 7 روز پس از تلقیح تعداد لکه­ها در هر برگ شمارش شد. در روز 11 پس از تلقیح تعداد برگ­های آلوده و تعداد برگ­های ریزش یافته مورد ارزیابی قرارگرفت. همچنین تعداد لکه‌های در هر ساقه نیز محاسبه گردید (10).

4- تعیین تنوع ژنتیکی جدایه‌های قارچ Cylindrocladium buxicola: برای تکثیر میسلیوم جدایه‌ها، پس از خالص‌سازی آنها توسط روش تک اسپور از کشت در محیط مایع V8 استفاده شد. کشت‌ها به مدت 10 روز در دمای 25 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. سپس با استفاده از سانتریفوژ با دور 3000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه، محیط مایع از میسلیوم خالص هر جدایه جداسازی و DNA کل قارچ توسط محلول CTAB (Cethyl Three methyl Amonium Bromide) استخراج شد (9).

برای اطمینان از موفقیت استخراج DNA و بررسی کمیت و کیفیت  DNAاستحصالی پنج میکرولیتر از محلول DNA با یک میکرولیتر بافر رنگ X6(6X Loading buffer)  مخلوط و از ژل آگارز یک و نیم درصد عبور داده شد. جهت تعیین غلظت DNA استخراج شده، از دستگاه بیوفتومتر استفاده گردید.

تعیین تنوع ژنتیکی جدایه‌های C. buxicola براساس انگشت‌نگاری DNA توسط نشانگر rep و با استفاده از آغازگرهای ERIC و REP صورت گرفت. توالی این آغازگرها به‌قرار زیر است:

ERIC2 Forward:

5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′

ERIC1R Reverse:

5′-ATGTAAGCTCCTGGGGTTCAC-3′

REP2-I Forward:

5′-ICGICTTATCIGGCCTAC-3′

REP1R-I Reverse:

5′-IIICGICGICATCIGGC-3′

مقادیر حجمی مواد به‌کاررفته در یک واکنش PCR و نیز چرخه حرارتی برای واکنش PCR بر اساس روش کریمی و همکاران (2009) (14) تنظیم گردید.

مشاهده محصول PCR توسط الکتروفورز با ژل آگارز 5/1% صورت گرفت. عمل PCR حداقل سه بار برای هر جدایه تکرار گردید و فقط قطعاتی از DNA که باند خوبی از آنها روی ژل دیده می‌شد، مورد ارزیابی قرارگرفتند.

به‌منظور رتبه‌بندی داده‌های حاصل از الکتروفورز و تجزیه خوشه‌ای آن‌ها (Cluster analysis)، ابتدا وزن باندها با استفاده از نرم‌افزار Photo-capt و براساس وزن باندهای نشانگر تعیین شد، از ماتریس داده‌ها که براساس باندهای مشترک روی ژل از صفر و یک تشکیل شده بود، برای ایجاد ماتریس شباهت بین جدایه‌ها براساس ضریب تشابه جاکارد (Jaccard’s coefficient) استفاده شد. براساس ماتریس شباهت، تجزیه خوشه‌ای به روش UPGMA در نرم‌افزار MVSP انجام و دندروگرام رسم گردید.

نتایج

1- جداسازی بیمارگر: از مجموع 310 نمونه گیاهی جمع‌آوری شده از رویشگاههای شمشاد در مناطق مختلف کشور مجموعاً 52 جدایه از C. buxicola به دست آمد که اطلاعات این جدایه‌ها در جدول 1 آمده است.

جدول 1- مشخصات جدایه‌های Cylindrocladium buxicola جمع‌آوری شده از مناطق مختلف ایران

2- بررسی خصوصیات ریخت­شناسی و فیزیولوژیک جدایه‌های قارچ Cylindrocladium buxicola

2- 1- بررسی سازگاری جنسی و اندام­های زایشی جنسی: پس از کشت متقابل 52 جدایه قارچ C. buxicola و بررسی سازگاری جنسی و تولید احتمالی اندام زایشی جنسی پریتسیوم در آنها، مشخص شد در هیچ‌یک از جدایه‌ها پریتسیوم تشکیل نگردید. براساس این نتایج مشخص شد تمام جدایه‌های این قارچ هتروتال بوده و همگی به یک نوع تیپ آمیزشی تعلق دارند.

2- 2- بررسی ویژگی‌های ریخت‌شناسی اندام­های زایشی غیرجنسی: رنگ پرگنه جدایه­ها روی محیط MEA در هفته اول رشد اغلب در مرکز متمایل به قهوه­ای بوده و در اطراف توسط ریسه­های سفید تا کرم‌رنگ احاطه شده بود، اما به‌تدریج با افزایش سن کشت­ها تفاوتی­هایی در رنگ و الگوی رشد پرگنه در میان جدایه­ها ایجاد شد. بطوریکه برخی جدایه­ها پرگنه منظم و برخی پرگنه نامنظمی داشتند، رنگ پرگنه نیز میان جدایه­ها متفاوت بود و در طیفی از قهوه­ای تیره تا قهوه­ای روشن و حتی کرم‌رنگ قرار داشت (شکل 4).

شکل 4- پرگنه تعدادی از جدایه­های Cylindrocladium buxicola در محیط عصاره مالت آگار (MEA)

جدایه­های ایرانی قارچ C. buxicola در محیط کشت جامد قادر به تولید مقدار فراوانی کنیدی غیرجنسی بودند که ویژگی­های ریخت‌شناسی کنیدی­ها، کنیدی­برها و پایه تفاوت چندانی میان جدایه ها نداشت. جدایه­های بدست آمده از این قارچ دارای کنیدیوم­های شفاف و بی­رنگ، راست، استوانه­ای شکل، در دو انتها گرد و دارای یک دیواره عرضی بودند. میانگین ابعاد کنیدیوم 51–69× 5/3–5/5 میکرومتر بود. پایه که رشته­ای عقیم و فاقد اندام زایشی است، طویل با میانگین طول 151–101 میکرومتر بود و در انتهای آن وزیکول بیضی‌شکل با میانگین عرض 9/8-4/6 میکرومتر تشکیل گردید (شکل 5).

شکل 5- اسپورهای Cylindrocladium buxicola؛ الف: تشکیل اسپور در محیط کشت جامد، ب: تشکیل اسپورودوخیوم روی ساقه شمشاد آلوده به بلایت در دسیکاتور مرطوب، پ: پایه و وزیکل، ت: کنیدیوم و کنیدی­بر، ث: کنیدیوم

2- 3- نرخ رشد خطی قارچ­ها در دمای 25 درجه سانتی­گراد: همانند آنچه در مورد الگو و رنگ پرگنه در جدایه­های ایرانی C. buxicola مشاهده شد، سرعت رشد پرگنه­های قارچی نیز در میان جدایه­ها متفاوت بود. اما درمجموع نرخ رشد پرگنه در تمام جدایه­ها سرعت پایینی داشت، بطوریکه بعد از 7 روز رشد روی محیط PDA در دمای 25 درجه سانتی­گراد میانگین قطر پرگنه از حداقل 1/1 سانتی­متر تا حداکثر 2 سانتی­متر متغیر بود.

2- 4- بررسی توانایی رشد قارچ در دمای بالاتر از 25 درجه سانتی­گراد: براساس این آزمون مشخص شد که مطابق آنچه سایر محققین در مورد دیگر جدایه­های قارچ C. buxicola مشاهده نموده­اند در مورد جدایه­های ایرانی این قارچ نیز دمای 25 درجه سانتی­گراد، ‌دمای بهینه رشد می­باشد، چراکه با افزایش دما میزان رشد پرگنه قارچی کاهش یافت. در نهایت هیچ‌یک از جدایه‌ها در دمای 30 درجه سانتی­گراد و بالاتر قادر به رشد نبودند.

2- 5- دمای غیرفعال شدن کنیدیوم جدایه­ها: دمای غیرفعال شدن کنیدیوم جدایه­ها 30-28 درجه سانتی­گراد تعیین گردید و با افزایش دما نرخ اسپورزایی و نیز جوانه‌زنی اسپورها به‌سرعت کاهش یافت، بطوریکه در تعداد زیادی از جدایه­ها در دمای 28 سانتی­گراد و در تعداد کمتری از آنها در دمای 30 درجه سانتی­گراد اسپور جوانه‌زده‌ای مشاهده نشد.

2- 6- تعیین تنوع بیماری‌زایی جدایه‌های قارچ Cylindrocladium buxicola: برای انجام این آزمون 21 جدایه که بیشترین تنوع را در ویژگی‌های ریخت­شناسی داشتند انتخاب و به کار گرفته شدند. پس از انجام آزمون­های مربوط به تنوع بیماری‌زایی مشخص گردید که تمامی جدایه­ها قادرند دامنه­ای از علائم مربوط به بیماری بلایت شمشاد شامل لکه برگی، لکه­های سیگاری شکل بر روی ساقه و همچنین ریزش برگ­ها را نشان دهند (شکل 6).

شکل 6- برخی علائم آلودگی در سرشاخه­های شمشاد در نتیجه مایه‌زنی با اسپورهای Cylindrocladium buxicola

جدایه ها ازنظر شدت بیماری­زایی روی سرشاخه­های بریده شده شمشاد دارای اختلاف بودند، به نحوی که تعداد لکه­ها، تعداد برگ­های آلوده و تعداد برگ­های ریزش یافته در میان جدایه­ها متفاوت بود و بر این اساس جدایه­ها در سطوح مختلفی قرارداشتند، اما ارتباطی میان مناطق جمع­آوری جدایه­ها و شدت بیماری­زایی جدایه­های آن منطقه وجود نداشت (جدول 2).

جدول 2- مشخصات بیماری‌زایی جدایه‌های منتخب Cylindrocladium buxicola

3- تعیین تنوع ژنتیکی جدایه‌های قارچ Cylindrocladium buxicola: در این آزمون 21 جدایه که بیشترین تنوع را در ویژگی‌های مورفولوژیک داشتند انتخاب و به همراه یک جدایه فوزاریوم به‌عنوان Outgrop (11) برای مطالعات مولکولی به کار گرفته شدند. پس از استخراجDNA  و تکثیر آن توسط آغازگرهای rep، مشخص شد آغازگرهای انتخاب‌شده، به‌تنهایی قادر به تفکیک جدایه­ها از یکدیگر به‌صورت ژنوتیپ‌های متفاوت نیستند و هریک از آنها به‌تنهایی تشابه بسیار بالایی را میان جدایه­ها به نمایش گذاشتند (شکل 7). از این­رو مجموع داده‌های این آغازگرها باهم رتبه‌بندی شد تا بتوانند تنوع ژنتیکی جمعیت را نشان دهند.

بااستفاده از مجموع این دو آغازگر مجموعاً 35 باند بدست آمد که توانست چندشکلی DNA این 21 جدایه را در سطح 95 درصد تشابه نشان دهد. دندروگرام حاصل از این 35 باند که براساس ضریب جاکارد به دست آمد، در سطح تشابه 95 درصد جدایه‌ها را به چهار گروه تقسیم نمود (شکل 8). در هر گروه تنوعی از جدایه­ها از استان مازندران، گیلان و گلستان جای گرفته و شباهت‌های 95 تا 99 درصد را نشان دادند (شکل 8).

شکل 7- یک نمونه از الگوهای باندی محصولات PCR جدایه­های منتخب Cylindrocladium buxicola توسط آغازگر REP (بالا) و ERIC (پایین). اعداد در حاشیه شکل بیان‌کننده اندازه (جفت باز=bp) قطعات DNA تکثیرشده براساس نشانگر ژنومی 1000 جفت بازی هستند. حروف کوچک در بالای شکل، مشخصات جدایه‌ها می‌باشند

شکل 8- دندروگرام ترسیم‌شده براساس روش UPGMA برای 21 جدایه منتخب Cylindrocladium buxicola؛ با استفاده از مجموع آغازگرهای REP و ERIC. حروف کوچک در حاشیه شکل بیان‌کننده مشخصات جدایه‌ها می‌باشند

بحث و نتیجه‌گیری

توده­های شمشاد یکی از کم­نظیرترین توده­های جنگلی در ناحیه اروپا-سیبری است که در گذشته به‌صورت نوار تقریباً پیوسته از آستارا تا شرق کردکوی به‌صورت زیراشکوب درختان بلوط، ممرز، افرا، نمدار و راش به‌خصوص در جنگل­های جلگه- کوهپایه­ای گسترده بودند، اما امروزه به‌صورت قطعات پراکنده­ای مشاهده می­شود (1) که از دلایل آن بیماری بلایت و خشکیدگی ناشی از قارچ Cylindrocladium buxicola می­باشد که خطر جدی برای بقا و تولید درختان شمشاد و اخیراً اغلب رویشگاه‌های شمشاد در شمال کشور به این قارچ مبتلا شده­اند. پژوهش­ها نشان می­دهد حفاظت به‌عنوان یک فاکتور مهم نقش تعیین کننده در غنا و تنوع زیستی پوشش گیاهی دارد (2). از سوی دیگر مهمترین گام در مدیریت یک بیماری‌ گیاهی، داشتن اطلاعات کافی از دامنه تغییرات طبیعی در خصوصیات ریخت‌شناسی، فیزیولوژیکی و بیماری‌زایی جمعیت‌های بیمارگر مربوطه است و درواقع شناسایی ویژگی­های جمعیت­های قارچ می‌تواند در گزینش استراتژی­های مدیریت آن ارزشمند باشد.

دراین تحقیق پس از جمع­آوری مجموعاً 310 نمونه گیاهی شمشاد از مناطق مختلف کشور مجموعاً 52 جدایه از قارچ C. buxicola، پس از شناسایی آنها با عنایت به کلیدهای تشخیص گونه (5، 6و 7) و نیز توصیف مجدد گونه توسط هنریکات و کالهام (9) به دست آمد.

بررسی سازگاری جنسی و تولید اندام­های زایشی جنسی این جدایه­ها نشان داد هیچ‌یک از جدایه‌ها در شرایط ذکرشده قادر به تولید پریتسیوم نبوده‌اند، براساس این آزمون مشخص گردید که تمام جدایه‌های ایرانی بدست آمده از این قارچ هتروتال و متعلق به یک نوع تیپ آمیزشی می­باشند. این نتیجه با گزارشات دیگر محققین روی جدایه­های دیگری از این قارچ مطابقت داشت (9و 11). در توصیف مجدد این‌گونه که اخیراً صورت گرفته (9) نیز ذکرشده که تاکنون پریتسیوم، تنها در معدودی از جدایه‌ها گزارش شده است.

دراین تحقیق، بررسی ویژگی­های ریخت‌شناسی پرگنه جدایه­های ایرانی قارچ C. buxicola، نشان داد محیط MEA برای مطالعه و مشخص نمودن تفاوت میان جدایه­ها ازنظر رنگ و شکل پرگنه بسیار مناسب است و در این محیط با افزایش سن کشت، در رنگ و الگوی رشد پرگنه در میان جدایه­ها تفاوت‌هایی وجود دارد. این یافته مطابق با گزارش هنریکات و کالهام (11) می­باشد.

به‌کارگیری روش گسکیر و همکاران (9) برای تولید کنیدی­های غیرجنسی قارچ موجب تشکیل مقدار فراوانی اسپور در هریک از جدایه‌ها در محیط کشت جامد شد (شکل 5، الف). اما برخلاف تفاوت زیاد در الگو و رنگ پرگنه میان جدایه­ها، ویژگی­های ریخت­شناسی کنیدیوم، کنیدی­بر و پایه تفاوت معنی­داری میان جدایه­ها نداشت. میانگین ابعاد کنیدیوم 51–69 × 5/3–5/5 میکرومتر بود، پایه با میانگین طول 151–101 میکرومتر و در انتهای آن وزیکول بیضی‌شکل با میانگین عرض 9/8-4/6 میکرومتر تشکیل شد. میانگین‌های حاصل از اندازه‌گیری ابعاد این اندام­ها برای جدایه‌های ایرانی این قارچ با کلید شناسایی هنریکات و کالهام (11) و نیز نتایج مطالعات گسکیر و همکاران (9) مطابقت داشت.

پس از ارزیابی نرخ رشد خطی قارچ­ها در دمای 25 درجه سانتی­گراد مشخص شد همانند الگو و رنگ پرگنه در جدایه­های ایرانی C. buxicola، سرعت رشد پرگنه­های قارچی نیز در میان جدایه­ها متفاوت است. میانگین قطر پرگنه در این دما بین 1/1 تا 2 سانتی‌متر بود و این نرخ با گزارش گسکیر و همکاران (9) مطابقت داشت.

پس از بررسی نرخ رشد روزانه جدایه‌ها در دمای بالاتر از 25 درجه سانتی­گراد مشخص گردید که بین افزایش دما با میزان رشد پرگنه قارچی در تمامی جدایه‌های ایرانی این قارچ ارتباط معکوس وجود دارد، بطوریکه با افزایش دما میزان رشد پرگنه قارچی کاهش می­یابد. از خصوصیات مهم جدایه‌های C. buxicola رشد حداکثری آنها در دمای 25 درجه سانتی­گراد و عدم توانایی آنها برای رشد در دماهای بالاتر از 30 درجه سانتی­گراد می‌باشد (4، 9و 11). در گزارش هنریکات و کالهام (11) آمده است که تمام جدایه‌های مورد بررسی آنها رشد نسبتاً خوبی در دمای 25 درجه سانتی‌گراد داشتند. همچنین کروز (4) در کتاب خود به رشد نسبتاً خوب گونه C. buxicola در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و عدم رشد آنها در دماهای بالاتر از 30 درجه سانتی­گراد به‌عنوان یکی از ویژگی­هایی متمایزکننده این‌گونه اشاره‌کرده است.

همچنین در آزمون ارزیابی دمای غیرفعال شدن کنیدیوم، دمای غیرفعال شدن کنیدیوم جدایه­ها 28 تا 30 درجه سانتی­گراد تعیین شد. بدین ترتیب مطابق با گزارش گسکیر و همکاران (9) اسپورزایی جدایه­های ایرانی قارچ
C. buxicola بسیار وابسته به دما می­باشد و با افزایش دما نرخ اسپورزایی و نیز جوانه‌زنی اسپورها به‌سرعت کاهش می­یابد.

با اندازه‌گیری ابعاد ساختارهای رویشی و زایشی در 52 جدایه‌ی بدست آمده از C. buxicola، 28 جدایه که بیشترین تنوع را در ویژگی‌های مورفولوژیک داشتند انتخاب و برای ارزیابی بیماری‌زایی و سپس مطالعات مولکولی به کار گرفته شدند.

بامطالعه تنوع بیماری­زایی در 21 جدایه منتخب قارچ C. buxicola مشخص گردید که بین این جدایه­ها، سطح بالایی از تنوع در علائم مربوط به بیماری بلایت شمشاد وجود دارد. اما این تنوع هیچ همبستگی با مناطق جمع‌آوری جدایه‌ها نداشت؛ بطوریکه جدایه­های با شدت بیماری‌زایی بالا در میان جدایه­های بدست آمده از هر سه استان شمالی کشور قابل مشاهده بود.

در تحقیق حاضر آنالیز خوشه‌ای الگوهای باندی حاصل از هریک از آغازگرهای rep به‌تنهایی قادر به تفکیک جدایه­ها از یکدیگر به‌صورت ژنوتیپ‌های متفاوت نبود و هریک از آغازگرها به‌تنهایی تشابه بسیار بالایی را میان جدایه­ها نشان دادند. در حالیکه اضافه نمودن الگوهای باندی حاصل از آغازگر REP به الگوهای باندی آغازگر ERIC و تجزیه‌وتحلیل 35 الگوی باندی حاصله از این آغازگرها توانست تنوع ژنتیکی 21 جدایه منتخب را نشان دهد. این ترکیب از آغازگرها جدایه‌ها را در سطح تشابه 95 درصد به چهار گروه ژنتیکی مجزا تقسیم نمود و در هر گروه تنوعی از جدایه­ها از استان مازندران، گیلان و گلستان جای گرفتند. این مشابهت بالای اثرانگشت DNA در بین جدایه­ها از مناطق مختلف جغرافیایی، نشان‌دهنده وجود تعداد معدودی کلون اولیه C. pseudonaviculata در ایران بوده و درواقع نشان‌دهنده پیوند اپیدمیولوژیکی بالقوه و گسترش جمعیت کنونی از یک (یا حداکثر تعداد اندکی) کلون بیمارگر اولیه می­باشد. جمع­بندی آنکه در این پژوهش تعیین تنوع موجود در جمعیت­های ایرانی قارچ Cylindrocladium buxicola به روش کلاسیک و به کمک نشانگرهای مولکولی دقیق (نشانگرهای rep) برای اولین بار در کشور صورت گرفت. براساس نتایج، تنوع بالایی چه ازنظر ریخت­شناسی و چه ازنظر ژنتیکی بین جمعیت‌های ایرانی این قارچ وجود نداشت. همچنین ارتباطی بین اختلافات ریخت­شناسی با اختلافات ژنتیکی مورد بررسی یافت نشد و جدایه‌هایی با ساختارهای زایشی و نیازهای دمایی مختلف دارای تشابه بالایی در الگوهای DNA خود بودند یا بالعکس. اما تنوع بیماری­زایی بین جدایه‌های مربوط به مناطق جغرافیایی مختلف و نیز جدایه‌های مربوط به هر استان، در اتخاذ راهکار مناسب برای مبارزه با این بیمارگر باید در نظر گرفته شود. بطور مثال در انتخاب ارقام مقاوم به این‌گونه قارچی مقاومت گیاهان یک منطقه باید در برابر جدایه‌های بیمارگر همان منطقه بررسی شوند.

براساس مجموع نتایج مطالعات ریخت­شناسی و مولکولی مشخص شد تمام جدایه‌های بدست آمده از استان­های شمالی کشور خصوصیات تیپ اصلی گونه Calonectria pseudonaviculta (9) را داشتند. بدین ترتیب جمعیت C. pseudonaviculta موجود در کشور برخلاف آنچه که در برخی مناطق دنیا گزارش شده است، قابل‌تفکیک به گروه­های متمایز تاکسونومیک (گونه‌های مختلف، زیرگونه و یا واریته) نمی‌باشد. نظر به نرخ پایین تنوع میان جدایه­ها، به نظر می­رسد در کنترل این بیماری، استفاده از ارقام مقاوم مهمترین راهکار است.