ژن etr1-1 کاندید برتر جهت دست­ورزی ژنتیکی مسیر پیام‌رسانی علامت هورمون اتیلن در گل سرخ

فائزه خاتمی^۱*،فرزانه نجفی^۱، فتانه یاری^۲ ورمضانعلی خاوری­نژاد^۱

¹ ایران، تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی

²ایران،تهران، سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران،پژوهشکده کشاورزی

تاریخ دریافت: 1/2/۱۳۹۷              تاریخ پذیرش: 15/8/۱۳۹۷

چکیده

از عوامل اصلی محدود کننده ماندگاری در مرحله پس از برداشت می­توان به هورمون اتیلن اشاره نمود. لذا دست­ورزی ژنتیکی این هورمون مورد توجه بوده و در پژوهش حاضر، لاین­های تراریخته گل سرخ حاوی ژن جهش‌یافته etr1مورد ارزیابی قرارگرفتند. در ادامه بررسی­های تکمیلی مولکولی، فیزیولوژیک و مورفولوژیک در لاین­ها جهت انتخاب لاین ماندگار انجام شد. علاوه براین، پاسخ­های فیزیولوژیک لاین­های ماندگار و شاهد در تیمارهای جیبرلین (صفر وmg l^-1 ۸۰) و اتیلن (صفر و
l l^-1µ 1) مورد بررسی قرار گرفتند. بدین منظور ارزیابی­ها در دو مرحله تجاری غنچه و نیمه باز انجام گرفت. آزمایش­ها به­صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار اجرا شد. نتایج مطالعات مولکولی نشان دهنده انتقال موفقیت‌آمیز ژن هدف به لاین­ها بوده است. باتوجه به ماندگاری مطلوب، کندتر شدن روند شکوفایی و حفظ گلبرگ­ها به روی نهنج گل تا آخرین روز در مطالعات فیزیولوژیک و مورفولوژیک، لاین شش در بین هفت لاین تراریخته، به­عنوان لاین ماندگار انتخاب گردید. نتایج نشان داد که میزان تولید اتیلن به­طور چشمگیری در هر دو مرحله غنچه و نیمه باز در لاین ماندگار در مقایسه با لاین شاهد در هر دو تیمار اتیلن بیرونی و جیبرلین کاهش یافت. لازم به ذکر است که محتوای اتیلن درونی لاین ماندگار، در سه مرحله (غنچه، نیمه باز و مرحله معادل با نیمه باز لاین شاهد) مورد بررسی قرارگرفت. بنابراین به نظر می­رسد ژن etr1-1می‍تواند کاندید مناسبی، جهت به تأخیر انداختن فرایند پیری وابسته به اتیلن در گل­های حساس باشد.

واژه­های کلیدی: اتیلن بیرونی، اصلاح ژنتیکی، پیری گل، جیبرلین، گل سرخ شاخه بریده.

*نویسنده مسئول، تلفن: ۰۹۱۲۸۳۱۰۰۶۹، پست الکترونیکی:  std_khatami@khu.ac.ir

مقدمه

صنعت پرورش گل و گیاهان زینتی یکی از منابع پر درآمد غیرنفتی، با گردش مالی سالانه ده­ها میلیارد دلار می­باشد که امروزه سهم زیادی از تجارت را به خود اختصاص داده و کشور هلند، بزرگترین تولیدکننده تجاری گل و گیاهان زینتی در جهان، بیشترین سهم را در این عرصه دارا
می­باشد (۳و ۴). در حال حاضر سهم ایران در تولید جهانی گل ۲/۱ درصد برآورد شده و درآمد ارزی صادرات گل در ایران بین ۲۰ تا ۳۰ میلیون دلار در سال تخمین زده می­شود که درخور ظرفیت­های صادراتی و توانمندی­های تولید گیاهان زینتی در کشور نمی­باشد (۱۷). با در نظر گرفتن ارزش اقتصادی صنعت گل و گیاهان زینتی و رقابت شدید در این زمینه، لزوم تحقیقات بیشتر در بخش تولید محصولات جدید و همچنین بهبود کیفیت تولیدی آنها بیشتر از پیش اهمیت خواهد داشت. کیفیت گیاهان زینتی گلدار عموماً با میزان ماندگاری گل­های آنها رابطه مستقیم داشته و عامل اصلی در بررسی کیفی محصولات زینتی می­باشد (۱و ۹). طول عمر گل­های شاخه بریده توسط موارد متعددی کنترل می­گردد: مرگ برنامه­ریزی شده، پیری القا شده توسط اتیلن، دهیدراسیون و کمبود منابع غذایی که با دست ورزی هرکدام از این عوامل می­توان فرایند پیری را تا حدودی کنترل نمود و از این طریق ماندگاری گل‌ها را افزایش داد (۴و ۶). در بین انواع هورمون­های گیاهی، اتیلن مهمترین تنظیم کننده فرایند پیری در گیاه محسوب شده و به­عنوان هورمون محرک پیری در اکثر گیاهان زینتی شناخته می­شود. حساسیت گل­ها نسبت به اتیلن برای تولیدکنندگان صنعت گل مشکل مهمی محسوب می­شود. لذا شناخت واکنش­های بیوسنتزی اتیلن و دریافت آن توسط پذیرنده­ها جهت مقابله با اثرات منفی آن، می­تواند به افزایش طول عمر و کیفیت گیاهان زینتی کمک نماید (۲ و ۷).

تاکنون مسیر بیوسنتزی اتیلن، چرخه یانگ، در گیاهان عالی به تفصیل بررسی شده است (۱۶). براساس این چرخه، اتیلن از اسید آمینه متیونین به کمک آنزیم­های
۱-آمینو سیکلو پروپان ۱-کربوکسیلیک اسید سنتاز و ACC اکسیداز سنتز می­گردد. پس از سنتز، مولکول گازی اتیلن توسط پذیرنده­های پروتئینی موجود در شبکه آندوپلاسمی سلول گیاهی دریافت می­گردد. بدین ترتیب رونویسی و ترجمه ژن­های پایین دست فعال می­گردند  (۴و ۵). در پی فعالیت این ژن­ها، پیری و مرگ سلول و اندام­های گیاهی مشاهده می­گردد (۱۰). به­طور خلاصه، پاسخ به اتیلن توسط یک خانواده پنج عضوی شامل
ETR1 (Ethylene Receptor1)، ERS1, ETR2 (Ethylene Response Sensor1) ، ERS2 و EIN4 (Ethylene Insensitive4) هدایت می­گردد (۱۰ و ۱۱). این پذیرنده­ها مشابه پذیرنده­های هیستیدین کینازی "دوجزئی" در پروکاریوت­ها می­باشند و از لحاظ ساختاری به دو زیر خانواده یک ETR1) و (ERS1  و دو ETR1) ، ERS1 و (EIN4 تقسیم می­گردند (۱۰ و ۱۱).  مطالعات ژنتیکی و بیوشیمیایی آشکار کرده است که پذیرنده­های اتیلن به­عنوان تنظیم­کننده­های منفی پاسخ به اتیلن عمل می­کنند و اتصال اتیلن به پذیرنده­ها سبب غیرفعال شدن آنها می­گردد (۵).

برای مثال تعدادی از گیاهان زینتی که حساس به اتیلن هستند و ازلحاظ اقتصادی نیز حائز اهمیت می­باشند عبارتند از: گل استکانی، برخی ارقام گل سرخ، کاکتوس عید پاک، گل اطلسی و گل میخک (۶ و ۱۷). با توجه به اهمیت روزافزون گل سرخ شاخه بریده، درک بهتر روابط بیولوژیکی پیچیده به منظور کاهش ضایعات در زنجیره تولید تا مصرف اهمیت به سزایی دارد. لذا اخیرا تمرکز بیشتر پژوهش ها در خصوص افزایش ماندگاری گل های شاخه بریده با استفاده از روش های نوین مهندسی ژنتیک است. دراین میان، نقش اتیلن در فرایند پیری گل­ها نیز از طریق تغییرات ژنتیکی در مسیر سیگنال­دهی اتیلن مورد بررسی قرارگرفته است. انتقال ژن جهش‌یافته گیرنده اتیلن etr1 از گیاه آرابیدوپسیس به اطلسی باعث کاهش حساسیت به اتیلن گردید و گیاهان تراریخته ماندگاری بیشتری را از خود نشان دادند. در رابطه با گیاه داوودی نیز انتقال ژن جهش‌یافته گیرنده اتیلن etr1-4 باعث کاهش حساسیت به اتیلن گردیده است (۱۲). به نظر می­رسد گیرنده­های اتیلن و ژن­های پایین دست مسیر انتقال سیگنال اتیلن نقش مهمی در پیشبرد فرایند پیری ایفا می­کنند. در گل سرخ، ارتباط مستقیمی بین پیری گل­ها با افزایش میزان بیانETR1-3  گزارش شده است و نشان می­دهد پیری گل می­تواند از طریق دریافت اتیلن خارجی توسط گیرنده­های اتیلن تسریع گردد (۹ و ۱۰).

علاوه بر اتیلن گزارشات متنوعی در مورد نقش اسید آبسیزیک در فرایند پیری گل­ها و افزایش این هورمون به هنگام مسن شدن گلپوش­ها نیز در دست می­باشد. نتایج بسیاری از پژوهش­ها نشان داده است که کاربرد برون­زای اسید آبسیزیک، سبب افزایش تولید اسید آبسیزیک درونی در بسیاری از گل­های شاخه بریده و به دنبال آن پیری گردیده است (۱۰و ۱۵). همچنین مشاهده شده است پس از افزایش میزان اسید آبسیزیک درونی، میزان تولید اتیلن نیز افزایش یافته و بدین ترتیب کاربرد اسید آبسیزیک خارجی، میزان تولید اتیلن را به‌شدت افزایش داده است. دراین راستا گزارش شده است که کاربرد بازدارنده فعالیت اتیلن همچون تیوسولفات نقره از پیری تحریک شده توسط اسید آبسیزیک جلوگیری نموده است. این نتایج نشان
می­دهد تأثیر اسید آبسیزیک بر تنظیم فرایند پیری در بسیاری از گل­های شاخه بریده به­واسطه تأثیر غیرمستقیم آن برافزایش میزان تولید اتیلن می­باشد (۱۴و ۱۵). همچنین گزارش شده است که جیبرلین­ها نیز فرایند پیری را در بسیاری از گیاهان زینتی نظیر میخک، نرگس و گل سرخ به تعویق می­اندازند. در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی نظیر جوانه­زنی بذر­ها، مرگ برنامه­ریزی شده سلول­های لایه آلورون و بیوسنتز آنتوسیانین در گلبرگ گل اطلسی، جیبرلین­ها به‌عنوان آنتاگونیست طبیعی اسید آبسیزیک عمل می­کنند (۱۳). چنین به­نظر می­رسد که جیبرلین­ها از طریق خنثی نمودن فعالیت اسید آبسیزیک، پیری گل­ها را به تأخیر می­اندازند (۴و ۱۰). بااین‌حال شواهد اندکی مبنی بر ارتباط مستقیم جیبرلین­ها بر تنظیم فرایند پیری موجود است. اثرات سینرژیسم و آنتاگونیسم هورمون­ها در گیاهان می­توانند منجر به تغییرات شاخصی در فنوتیپ گیاهان شوند. باتوجه به تحقیقات صورت گرفته مشخص شده که از بین هورمون­های گیاهی، جیبرلین نسبت به اتیلن اثرات آنتاگونیستی داشته و لذا به­نظر می­رسد تغییر غلظت این
هورمون­ها به نفع بالاتر بردن غلظت جیبرلین در گیاه می­تواند منجر به افزایش طول عمر شود. لذا به­نظر می­رسد از یک سو می­توان با دست­ورزی ژنتیکی اتیلن و از دیگر سو با افزایش محتوای جیبرلین به بهبود ماندگاری در گل سرخ کمک نموده. باتوجه به پتانسیل مطلوب دست­ورزی ژنتیکی هورمون اتیلن در به تأخیر انداختن پیری، گزارش شده است که ژن موتانت etr1-1 با موفقیت به گل سرخ رقم Vendetta منتقل شده و مطالعات اولیه مولکولی تأییدی بر انتقال این ژن می­باشد. در ادامه به جهت تکمیل تحقیقات صورت گرفته و ارزیابی موفولوژیک و بیان ژن در گیاهان تراریخته گل سرخ، لاین­های مختلف این گل برای این پژوهش در نظر گرفته شد تا بتوان بهترین لاین تراریخته، دارای کلیه صفات مطلوب مورفولوژیک و فیزیولوژیک باتوجه به هدف به تأخیر انداختن پیری در این گل شناسایی و معرفی گردد. در عین حال نکته حائز اهمیت دیگر دراین تحقیق بررسی برخی صفات فیزیولوژیک بیان این ژن در گل­های سرخ شاخه بریده در پاسخ به تیمار اتیلن و جیبرلین بیرونی و مواجهه با آنتاگونیست طبیعی اتیلن، جیبرلین، بوده است. بنابراین، هدف از این پژوهش مطالعه برخی تغییرات بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی در هنگام پیری گل سرخ می­باشد تا در آینده بتوان با توجه به نوع علائم پیری، تیمارهای پس از برداشت مناسبی جهت افزایش ماندگاری این رقم از گل سرخ معرفی نمود.

مواد و روشها

مواد گیاهی: لاین­های تراریخته حاصل از گل سرخ شاخه بریده رقم "Vendetta" به شماره ثبت اختراع ۹۵۷۶۰ در مرحله غنچه تجاری با قطر تقریباً یکسان حدود 4­-­3 سانتی­متر از گلخانه تحت قرارداد از سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران تهیه شدند (شکل 1، الف). پس از انتقال به آزمایشگاه، برای یکسان کردن اندازه شاخه­ها مجدداً انتهای آنها در زیرآب باز برش شده، به­طوری که طول هر شاخه گل به 5/0 ± ۳۰ سانتی­متر رسید و همه برگ­ها بجز سه برگ بالایی حذف شدند. در تمام مدت آزمایش گل­ها در شرایط کنترل شده با دمای 2 ± 25 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی 5 ± 70 درصد و شرایط نوری ۱۵ میکرومول بر مترمربع بر ثانیه بااستفاده از لامپ­های مهتابی سفید و تنگستن، با دوره نوری ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی نگهداری شدند (شکل 1، ب). در ادامه باتوجه به نوع آزمایش­ها که در ذیل ذکر شده است، تیمارها اعمال و اندازه­گیری­ها انجام شد.

آزمایش اول: تأیید مولکولی لاین­های تراریخته و بررسی فیزیولوژیک به­منظور انتخاب لاین ماندگار

تأیید مولکولی لاین­ها: بدین منظور، ابتدا استخراجDNA  طبق دستورالعمل کیت GABIT (Genetics and Agricultural Biotechnology Institute of Tabarestan) با شماره ثبت اختراع 8۷۸۴7 انجام گردید. بر این اساس ۱۰ میلی­گرم از بافت گلبرگ در هاون به کمک نیتروژن مایع کاملاً آسیاب شده و به تیوب­های استریل انتقال داده شد. سپس مطابق با پروتکل، فرایند استخراج DNA انجام گردید.

شکل ۱- الف) گل سرخ ترا ریخته شاخه بریده (Rosa hybrida L.)در مرحله غنچه تجاری، ب) در روز دهم انبارمانی در تیمار شاهد

به‌طور خلاصه، ابتدا بافر لیزکننده اضافه گردید. در ادامه نمونه­ها در دمای ۶۵ درجه سانتی­گراد انکوبه و سپس سانتریفیوژ گردیدند. پس از اتمام سانتریفیوژ محلول رویی به نانوستون منتقل شد، سپس در ادامه بافر اتصال اضافه و به‌شدت مخلوط شد تا به‌طور کامل نانو ذرات در محلول پخش شوند. سپس سانتریفیوژ انجام گردید و فاز رویی دور ریخته شد. در ادامه بافر شستشو به نانو ذرات اضافه و خوب مخلوط گردید. سپس بافر جداکننده به نانو ذرات اضافه گردید به­طوری که نانوستون در آن به­طور کامل معلق شده و سپس تیوب در دمای ۶۰ درجه سانتی­گراد انکوبه گردید. در ادامه با استفاده از یک آهن­ربای خارجی، نانوستون بی­حرکت می­گردد و فاز رویی که حاوی DNA  بود، جمع­آوری و به تیوب­های استریل جدید منتقل و در دمای ۸۰- درجه سانتی­گراد نگه­داری شدند. برای بررسی کیفیت DNA های استخراج شده، از ژل آگارز ۱ درصد و عکس­برداری در دستگاه ژل داک  (Gel doc 2000) استفاده شد. به­منظور تعیین کمیت، جذب‌های نوری ۲۶۰ به۲۸۰ و ۲۶۰ به ۲۳۰ نانومتر با غلظت نانوگرم در میکرولیتر توسط اسپکتروفتومترEppendorf BioPhotometer ®D30  قرائت گردید.  

سپس به­منظور بررسی و تأیید تراریختی، واکنش زنجیره­ای پلی­مراز برای تکثیر ژن­هایetr1-1  و nptII، انجام گردید. از نرم­افزارAlleleID  (ویرایش ۵/۷) جهت طراحی آغازگرهای مناسب رفت‌وبرگشت استفاده شد (جدول ۱). باکتری­های حاوی پلاسمید PBEO210 به‌عنوان کنترل مثبت و گل­های سرخ غیرتراریخته به‌عنوان کنترل منفی جهت استفاده در واکنش RT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفتند. شـرایط PCR شـامل 9۵ درجـه بـه­مـدت 2 دقیقـه، 94 درجه به­مدت ۳۰ ثانیه، ۵۹ و ۶/۵۷ درجه
به­ترتیب برای ژن­های  nptIIو etr1-1  به­مـدت 30 ثانیـه، 72 درجه به­مدت 30 ثانیه، 72 درجه به­مدت ۷ دقیقه در ۳۵ سـیکل بـود. برای بررسی تولیدات تکثیر شده از الکتروفـورز افقی (Bio-Rad) بـر روی ژل آگـارز 1 درصـد به­مدت یک ساعت با ولتاژ ثابت ۸۰ ولت استفاده شـد. سپس از ژل حاصل در حـــضور تـــابشUV  با استفاده دستگاه ژل داک عکس­برداری گردید.

جدول ۱- مشخصات پرایمرهای به­کار رفته برای تأیید تراریختی

تعیین لاین ماندگار: دراین راستا طول عمر گل­های شاخه بریده لاین­های تراریخته بدون اعمال هیچ­گونه تیمار پس از برداشت، مورد بررسی قرارگرفت. لاین ماندگار بر مبنای هدف دست­ورزی ژنتیکی انجام شده، لاینی است که ضمن حفظ کلیه صفات فیزیولوژیک و مورفولوژیک رقم اولیه طول عمر بیشتری داشته باشد.

طول عمر گل: عمر گلدانی از زمان برداشت گل تا ظهور یکی از علائم پیری در گل اعم از خمیدگی گردن، ریزش گلبرگ­ها، سیاه­شدگی و از دست دادن تورژسانس گلبرگ­ها با واحد روز بیان می­شود.

مراحل نموی و بررسی علائم پیری (ریزش، بدرنگی و خشک­شدگی گلبرگ) از دیگر صفات مورد ارزیابی در طول دوره ماندگاری گل­های شاخه بریده بودند.

قطر گل: قطر یا درشتی گل یکی از صفات تعیین­کننده کیفیت ظاهری گل است که با عمر پس از برداشت گل نیز مرتبط است. ارزیابی قطر گل توسط کولیس دیجیتال مورد ارزیابی قرارگرفت.

تعیین نسبت روابط آبی در گل: بدین منظور از گلبرگ­ها، دیسک­هایی با اندازه یکسان تهیه شد و میزان وزن‌تر و خشک دیسک­های گلبرگی با استفاده از ترازوی Sartorius analytic A200S ساخت کشور آلمان به فاصله زمانی دو روز در میان در طول دوره ماندگاری گل­های شاخه بریده یادداشت‌برداری شد. به­منظور اندازه‍گیری وزن خشک، نمونه­ها به­مدت ۲ ســاعت در دمای ۸۰ درجه­ی سانتی­گراد در آون قرار داده شدند تا زمانی­که تغییر وزنی مشاهده نشد.

شکل ۲- لاین­های گل سرخ تراریخته و شاهد. به­منظور بررسی طول عمر، شاخه­های گل با 200 میلی­گرم در لیتر ۸-هیدروکسی کوئینولین سولفات همراه با ساکارز ۴ درصد تیمار شدند. L1، لاین شاهد، L2-L8، به­ترتیب لاین­های تراریخته می­باشند

میزان وزن‌تر و خشک شاخه­ها در روز پایانی طول عمر گل محاسبه گردید. به­منظور اندازه­گیری وزن خشک، نمونه­ها به­مدت ۲۴ ســاعت در دمای ۸۰ درجه­ی سانتی‍گراد در آون قرار داده شدند. در ادامه محتوای آب در هر دو اندازه­گیری براساس وزن‌تر اولیه (FW) و وزن خشک (DW) برحسب درصد تعیین گردید (9).

[(FW – DW) / FW × 100]  = درصد محتوای آب

در ادامه صفت افت وزن ساقه بر مبنای وزن‌تر اولیه، ارزیابی شد.

آزمایش دوم: سنجش محتوای اتیلن درونی تحت شرایط

اتمسفر تعدیل یافته مجهول: بدین منظور گل­های شاخه بریده در داخل بطری­های پلاستیکی به حجم ۱۰۰ میلی‌لیتر تحت تیمارهای جیبرلین (صفر وmg l^-1 ۸۰) یا اتیلن (صفر وl l^-1µ 1) قرارگرفتند. لازم به ذکر است که محلول نگه­دارنده پایه، آب مقطر در نظر گرفته شده است. سپس گل­ها درون کیسه­های پلی­اتیلنی باضخامت 60 میکرومتر که نفوذپذیری آنها نسبت به اکسیژن و بخارآب به­ترتیب   cm³.m^-2.day^-1.atm^-1۷۸۰۰ و g. m^-2.day^-1.atm^-1 ۱۸ در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد می­باشند، بسته­بندی شدند. تیمار جیبرلین به­صورت محلول نگه­دارنده مورد استفاده قرار گرفت و برای اعمال تیمار اتیلن از تزریق گاز خالص به داخل کیسه­ها توسط سرنگ بهره گرفته شد.
گل­های شاخه بریده به­مدت ۲۴ ساعت در بسته­بندی­ها نگه­داری شده، سپس گل­ها از بسته خارج شدند و برای اندازه­گیری محتوای اتیلن درونی در دو مرحله نموی غنچه و نیمه باز، گل­ها به­مدت 2 ساعت درون کیسه­های
پلی­اتیلنی با شرایط سابق قرارگرفتند و از هوای داخل بسته نمونه­گیری شد. لازم به ذکر است به منظور بررسی دقیق­تر هم‌زمان با مرحله نموی نیمه باز در لاین شاهد، محتوای اتیلن درونی بسته­های حاوی لاین ماندگار که همچنان در مرحله غنچه تجاری بودند، نمونه‌برداری شدند. لذا برای لاین تراریخته 3 مرحله اندازه­گیری لحاظ شد. نمونه­ها درون لوله­های ونوجکت خلأ در دمای 4 درجه سانتی­گراد تا زمان اندازه­گیری، نگه­داری شدند. در ادامه با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC) مدل Agilent 6890N مجهز به آشکارگر FID و ستون موئین (طول ۵۰ متر، قطر ۵۳/۰ میلی­متر) میزان اتیلن اندازه­گیری شد. باتوجه به تنظیمات دستگاه از دمای بخش تزریق، ستون و آشکارگر به­ترتیب ۱۸۰، ۲۰۰ و ۲۵۰ درجه­ی سانتی­گراد و گاز هلیم به‌عنوان گاز حامل با سرعت ۵/۶ میلی‌لیتر بر دقیقه استفاده گردید. محاسبه میزان اتیلن با استفاده از فرمول زیر انجام گرفت:

بـه­منظـور تهیـه نمـودار کالیبراسـیون و معادلـه خـط مربوطـه، غلظت­های 1/0، ۱، ۱0، ۲0 و ۳۰ میکرولیتر در لیتر اتـیلن بـه دسـتگاه کروموتوگرافی گازی تزریق گردید و سپس با استفاده از مساحت سطح زیر منحنی استاندارد نمودار کالیبراسیون مربوطه رسـم و معادله خط حاصله
به دست آمد (شکل ۴).

تجزیه‌ و تحلیل آماری: داده­های حاصل توسط نرم­افزار SAS (ویرایش 1/9) بر اساس واریانس ANOVA ) یک­طرفه) در قالب طرح کاملاً تصادفی مورد تجزیه قرارگرفتند و همچنین مقایسه میانگین با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن انجام شد. قابل ذکر است کلیه آزمایش­ها در سه تکرار انجام و نتایج با استفاده از نرم­افزار Excel رسم گردید.

نتایج

نتایج آزمایش اول: تأیید مولکولی لاین­ها: واکنش زنجیره­ای پلی­مراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن etr1-1 و nptII به­ترتیب منجر به تکثیر قطعه­ای به طول تقریبی ۷۸۸ و bp ۵۱۵ گردید که وجود باندهای درخشان، حاکی از تراریخته شدن نمونه­های گیاهی می­باشد (شکل ۵ الف و ب). در این گیاهچه­ها، تکثیر نوار  bp ۷۸۸ صورت گرفت که با نوار تکثیر شده با آگروباکتریوم حامل پلاسمید PBEO210 حاوی ژن  etr1-1 به­عنوان شاهد مثبت مطابقت داشت. در گیاهان شاهد هیچ­گونه باندی تکثیر نشد که نشان­دهنده عدم حضور تراژن در ژنوم این گیاهان بود.

طول عمر گل: نتایج تجزیه واریانس داده­های حاصل از طرح کاملاً تصادفی، نشان داد که طول عمر پس از برداشت گل در لاین­های مختلف تفاوت معنی­داری در سطح یک درصد داشتند (جدول ۲)، به­طوری که در طی 15 روز مشاهده بصری گل­ها در دمای اتاق (°C 5 ± 25)، لاین ۶ بیشترین ماندگاری را با میانگین 33/۱۴ روز و لاین ۱ کمترین ماندگاری را با میانگین 66/۸ روز داشت (شکل ۶).

پیری گل­های شاخه بریده با پژمردگی، ریزش و تغییر رنگ گلبرگ­ها همراه بود. این علائم در لاین­های مختلف در مدت 15 روز مشاهده به­صورت متفاوت بروز نمود و از این لحاظ اختلاف معنی­داری در سطح یک درصد بین لاین­ها مشاهده گردید. در عین حال شدت بروز بدرنگی و در ادامه خشکی گلبرگ در بین لاین­های تراریخته متفاوت بود (جدول2). باتوجه به مشاهدات علائم پیری در
لاین­های مورد بررسی مشخص شد که این علائم در لاین شاهد به­صورت ریزش گلبرگ­ها بروز کرده و در لاین­های تراریخته به­صورت بدرنگی و تغییر رنگ در گلبرگ­ها و خشکی تدریجی از لبه آنها مشاهده گردید. اگرچه این در حالی است که روز پایانی اندازه­گیری­ها بر اساس پایان طول عمر تجاری گل در تمامی لاین­ها بوده و لاین ماندگار(L6)  بدون رخداد هیچ‌یک از علائم ریزش یا بدرنگی و خشکی تدریجی، به­طور ناگهانی خشک شد و به­نظر می­رسد در صورت فراهم بودن سایر شرایط مطلوب برای ماندگاری گل اعم از دمای کمتر و رطوبت بهتر یا شرایط بهینه محلول نگه­دارنده این گل می­توانسته طول عمر بیشتری نیز داشته باشد (شکل ۷).

نتایج به­دست آمده از تجزیه واریانس داده­های مربوط به مراحل نموی گل نشان داد که اختلاف معنی­داری در سطح یک درصد بین لاین­های مختلف و زمان وجود دارد، در این بررسی لاین، عامل اول طرح فاکتوریل (در قالب طرح کاملاً تصادفی) در نظر گرفته شد و مدت زمان‌بر اساس روز عامل دوم بود و اثر متقابل لاین­های مختلف و روزهای مورد بررسی تفاوتی را نشان ندادند (جدول ۳). شکل ۸ (ب) بیانگر این مطلب می‌باشد که اغلب لاین­های تراریخته، مراحل نموی شکوفایی را به‌خوبی طی کرده و حتی برخی از لاین­ها قادر بوده­اند در طی مدت زمان طول عمر تجاری خود، بدون نشان دادن علائم پیری به­طور کامل شکوفا شوند. این در حالی است که لاین شاهد قادر به طی مرحله کامل شکوفایی در مدت زمان ماندگاری خود نبوده و پس از گذر از مرحله نیمه باز وارد فاز پیری شده و علائم پیری را به‌صورت ریزش گلبرگ نشان داد که این خود دلیلی بر کامل نشدن مرحله باز شدن گل و شکوفایی کامل می­باشد. در تضاد با اغلب لاین­های تراریخته، مشاهده شد که لاین 6 در مرحله نموی غنچه تجاری مانده و روند شکوفایی طبیعی را طی نکرده است (شکل ۸، الف).

قطر گل: نتایج به­دست آمده از تجزیه واریانس داده­های مربوط به قطر گل همچون داده­های مربوط به مراحل نموی گل قابل تفسیر می­باشد و نشان داده شد که اختلاف معنی­داری در سطح یک درصد بین لاین­های مختلف و زمان وجود دارد، در حالی­که اثر متقابل لاین­های مختلف و زمان تفاوتی را نشان ندادند (جدول۳).

شکل ۳- نحوه نمونه­گیری اتیلن پس از ۲ ساعت و انتقال به ونوجکت­های خلأ، به­ترتیب مراحل انجام شده (الف، ب و ج)

جدول ۲- نتایج تجزیه واریانس داده­های طول عمر پس از برداشت لاین­های گل سرخ شاخه بریده

^*، ^**و ^ns به­ترتیب نشان­دهنده معنی­دار بودن اختلاف در سطح پنج، یک درصد و عدم معنی­داری می­باشد

شکل ۶- طول عمر پس از برداشت. L1، لاین شاهد، L2-L8، به­ترتیب لاین­های تراریخته می­باشند (حروف غیرمشترک معرف تفاوت معنی­دار در سطح پنج درصد و خطوط عمودی نشان­دهنده خطای استاندارد از میانگین (۴=n) است)

شکل ۷- بروز علائم پیری، L1، لاین شاهد، L2-L8، به­ترتیب لاین­های تراریخته می­باشند، اعداد صفر، ۱، ۲ و ۳ در محور عمودی به­ترتیب مقیاس عددی برای تعریف صفات کیفی: خشکی ناگهانی، ریزش، بدرنگی و بدرنگی و خشکی می­باشند

جدول ۳- نتایج تجزیه واریانس داده­های قطر گل در لاین­های گل سرخ شاخه بریده

^*، ^**و ^ns به­ترتیب نشان­دهنده معنی­دار بودن اختلاف در سطح پنج، یک درصد و عدم معنی­داری می­باشد.

شکل ۸- الف) میانگین مراحل نموی گل­ها در لاین­های مختلف، ب) مراحل نموی گل­ها تا روز هشتم پس از برداشت، L1، لاین شاهد، L2-L8،
به­ترتیب لاین­های تراریخته می­باشند (حروف غیرمشترک معرف تفاوت معنی­دار در سطح پنج درصد و خطوط عمودی نشان­دهنده خطای استاندارد از میانگین (۴=n) است)

باتوجه به مقایسه میانگین­ها، گل­ها در روز هفتم پس از برداشت دارای بیشترین قطر بوده و تغییرات قطر تا روز پایانی اندازه­گیری ثابت بوده است. این در حالی است که شروع شکوفایی گل­ها در کلیه لاین­ها تقریباً از روز چهارم رخ داده و در روز هفتم به اوج خود رسیده است. (شکل ۹، الف). همچنیـــن، کمترین میزان قطر گل در لاین ۶ مشاهده گردید (شکل ۹، ب).

تعیین نسبت روابط آبی در گل: نتایج جدول ۴ در مورد صفت وزن‌تر و خشک شاخه­های گل سرخ لاین­های مختلف، در مرحله نهایی نمو گل، بیانگر عدم وجود اختلاف معنی­دار بین لاین­هاست. همچنین نتایج این جدول نشان می­دهد که افت وزن شاخه بر مبنای وزن‌تر اولیه آنها در سطح احتمال پنج درصد معنی­دار گردید و به­نظر می­رسد تنها بین دو لاین تراریخته 7 و 8 از جهت افت وزن نسبت به مرحله اولیه غنچه تفاوت وجود دارد، اگرچه در مقایسه با سایر لاین­ها و حتی لاین شاهد این افت وزن در مورد لاین 7 و همین­طور لاین 8 معنی­دار نیست (شکل ۱۰).

شکل ۹- الف) میانگین قطر گل­ها تا روز هشتم پس از برداشت، ب) قطر گل­ها در مدت ۸ روز در لاین­های مختلف. L1، لاین شاهد، L2-L8، به­ترتیب لاین­های تراریخته می­باشند (حروف غیرمشترک معرف تفاوت معنی­دار در سطح پنج درصد و خطوط عمودی نشان­دهنده خطای استاندارد از میانگین (۴=n) است)

جدول ۴- نتایج تجزیه واریانس داده­های وزن‌تر و خشک شاخه­ها در مرحله نهایی نمو در لاین­های گل سرخ شاخه بریده

           ^*  ، ^**و ^ns به­ترتیب نشان­هنده معنی­دار بودن اختلاف در سطح پنج، یک درصد و عدم معنی­داری می­باشد.

شکل ۱۰- افت وزن شاخه­ها بر مبنای وزن‌تر اولیه آنها.L1، لاین شاهد، L2-L8، به­ترتیب لاین­های تراریخته می­باشند (حروف غیرمشترک معرف تفاوت معنی­دار در سطح پنج درصد و خطوط عمودی نشان­دهنده خطای استاندارد از میانگین (۴=n) است)

جدول ۵- نتایج تجزیه واریانس داده­های محتوای نسبی آب دیسک گلبرگ در لاین­های گل سرخ شاخه بریده

^*، ^**و ^ns به­ترتیب نشان­دهنده معنی­دار بودن اختلاف در سطح پنج، یک درصد و عدم معنی­داری می­باشد.

نتایج داده­های مربوط به محتوای نسبی آب دیسک گلبرگ (جدول ۵) بیانگر عدم وجود اختلاف معنی­دار در سطح لاین­ها، زمان و همچنین اثر متقابل لاین و زمان می­باشد. طبق نتایج جدول ۶، محتوای نسبی آب شاخه­ها برحسب درصد بین لاین­ها، در مرحله نهایی نمو اختلاف
معنی­داری در سطح یک درصد دارند. به­طوری که لاین ۶ دارای بالاترین محتوای نسبی آب (64/88 درصد) نسبت

به سایر لاین­ها می­باشد (شکل ۱۱). طبق شکل ۱۱ لاین­ ۶ با لاین­های ۳، ۴، ۷ و شاهد تفاوت معنی­داری دارد. همچنین بین لاین­های ۶، ۲، ۵و ۸ تفاوت آماری
معنی­داری مشاهده نشد.

جدول ۶- نتایج تجزیه واریانس داده­های محتوای نسبی آب شاخه در لاین­های گل سرخ شاخه بریده

^*، ^**و ^ns به­ترتیب نشان­دهنده معنی­دار بودن اختلاف در سطح پنج، یک درصد و عدم معنی­داری می­­باشد

شکل ۱۱- درصد محتوای نسبی آب شاخه­ها در لاین­های مختلف. L1، لاین شاهد، L2-L8، به­ترتیب لاین­های تراریخته می­باشند (حروف غیرمشترک معرف تفاوت معنی­دار در سطح پنج درصد و خطوط عمودی نشان­دهنده خطای استاندارد از میانگین (۴=n) است)

نتایج آزمایش دوم:

محتوای اتیلن درونی: نتایج جدول ۷ بیانگر تفاوت معنی­دار در محتوای اتیلن درونی بین اثرات متقابل سه‌گانه لاین، تیمار و زمان می­باشد. همچنین شکل ۱۲ نشان می‍دهد که محتوای اتیلن درونی در لاین شاهد در تیمار با یک میکرولیتر در لیتر اتیلن (l l^-1µ 1) در مرحله نیمه باز بیشترین مقدار و در لاین ماندگار در مرحله غنچه تجاری در تیمار با جیبرلین (mg l^-1 ۸۰) کمترین مقدار است. نتایج شکل ۱۲ نشان می­دهد که تیمار اتیلن در تمامی مراحل نموی چه در لاین ماندگار و چه در لاین شاهد باعث افزایش و کاربرد جیبرلین سبب کاهش محتوای اتیلن درونی می­گردد (شکل 12). همچنین نتایج ارائه شده در شکل ۱۲ گویای تأثیر معنی­دار جیبرلین و اتیلن به­ترتیب در کاهش و افزایش غلظت اتیلن درونی در گل­های شاخه بریده (لاین شاهد و ماندگار) می­باشد. مطابق با شکل ۱۲ محتوای اتیلن درونی در گل­هایی که درون کیسه­های پلی‌اتیلنی بدون تزریق گاز اتیلن تحت شرایط اتمسفر تعدیل یافته مجهول (صفر l l^-1µ) قرارگرفتند، در مقایسه با گیاهانی که تنها در آب مقطر قرارداشتند (صفر mg l^-1)، در تمامی مراحل نمو بیشتر بود. علاوه براین، محتوای اتیلن درونی در مرحله نیمه باز در لاین شاهد در سایر تیمارها نسبت به مرحله معادل با نیمه باز و نیمه باز در لاین ماندگار افزایش قابل ملاحظه­ای را نشان می­دهد.

جدول ۷- نتایج تجزیه واریانس داده­های محتوای اتیلن درونی در لاین­های گل سرخ شاخه بریده

^*، ^**و ^ns به­ترتیب نشان دهنده معنی­دار بودن اختلاف در سطح پنج، یک درصد و عدم معنی­داری می­باشد.

شکل ۱۲- محتوای اتیلن درونی در لاین­های مختلف (حروف غیرمشترک معرف تفاوت معنی­دار در سطح پنج درصد و خطوط عمودی نشان­دهنده خطای استاندارد از میانگین (۴=n) است)