نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران

2 استاد گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

3 دانش آموخته گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

4 استاد گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

چکیده

شوری یکی از عوامل اصلی محدود کننده تولید محصولات کشاورزی محسوب می‌شود. مطالعات مختلف نشان دهنده تغییر بیان ژن‌ها در نتیجه تغییرات فراژنتیکی تحت تنش‌های غیر زیستی است. در این مطالعه، از تکنیک CRED-RA برای بررسی تغییرات الگوی متیله شدن توالی‌های CCGG در ساقه و ریشه درقم جو Sahara3771 (متحمل به تنش شوری) و Clipper (حساس به تنش شوری) تحت دو تیمار صفر و 100 میلی مولار NaCl استفاده شد. نمونه‌های برگ و ریشه جهت استخراجDNA ، 24 ساعت، سه هفته و پنج هفته پس از اعمال شوری برداشت شد. تحت تیمار شوری در بخش هوایی Sahara3771 در مقایسه با تیمار شاهد، 2/26% جایگاه‌ها متیله و 86/15% آن‌ها متیل‌زدایی شدند. در ریشه آن نیز 74/7% و 38/9% از جایگاه‌ها به ترتیب افزایش و کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری در مقایسه با شاهد داشتند. در بخش هوایی Clipper 02/17% و 74/11% جایگاه‌ها تحت تیمار شوری به ترتیب افزایش و کاهش سطح متیله شدن در مقایسه با تیمار شاهد داشتند. در ریشه این ژنوتیپ نیز مقادیر افزایش و کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری به ترتیب 67/10% و 5/7% بود. در مجموع تعداد جایگاه‌های بدون تغییر در بخش هوایی بیشتر از ریشه بود. همچنین تعداد جایگاه بدون تغییر در بخش هوایی Clipper بیشتر از Sahara3771 بود. نتایج نشان دادند که تغییرات الگوی متیله شدن می‌تواند یکی از فاکتورهای کلیدی دخیل در تحمل بیشتر به شوری در جو باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

DNA methylation Pattern in shoot and root of barley under salinity stress

نویسندگان [English]

  • Sara Ghaffarian 1
  • Seyad Abolghasem Mohammadi 2
  • Samira Hamian 3
  • Mohammad Moghadam Vahed 4
  • Mahmoud Toorchi 4
  • Ali Bandehagh 4

1 Assistant Professor of Biology Department, Faculty of Natural Science, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz , Iran

2 Professor of Plant Breeding and Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Tabriz university, Tabriz, Iran

3 3. Graduated of Plant Breeding and Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Tabriz university, Tabriz, Iran

4 Professor of Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran

چکیده [English]

Salinity is one of the most crucial factors, which inhibits crop production. A large number of evidence reveal that epigenetic mechanisms modulate the gene expression in plants under abiotic stresses. Obviously, by understanding epigenetic regulation of plant growth and response to stresses, a heritable variation could be develop for crop breeding. In this study the DNA methylation alteration under salt stress analyzed in two barley cultivars differing in salt tolerance, namely Sahara3771 and Clipper. Coupled Restriction Enzyme Digestion-Random Amplification (CRED-RA) was utilized to detect CCGG sequence methylation alternation in shoot and root of the plants growing under o and 100 mM NaCl treatment. Leaf and root samples for DNA extraction were harvested 24 hours, 3 weeks, and 5 weeks after salt treatment. The results revealed that under salinity stress in shoot of Sahara3771 26.20% and 15.86% of sites were hypermethylated and demethylated respectively compared to control. Average number of hyper and demethylated sites in root of Sahara3771 were 74.7% and 38.9% respectively. In shoot of Clipper 17.02% of sites was hypermethylated and 11.74% of them demethylated. Average number of hyper and demethylated sites in root of Clipper were 67.10% and 5.7% respectively. Totally, number of methyl-changed sites in shoots was higher than roots in both genotype. In addition, number of methyl-unchanged sites in shoot of Sahara3771 was higher than Clipper. These results revealed that alteration of DNA methylation in plants could be a key factor in adaptation and toleration of plants to salinity.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Barley
  • salinity stress
  • Methylation pattern
  • CRED-RA

الگوی متیله شدن DNA در ریشه و ساقه جو تحت تنش شوری

سارا غفاریان1و2، سید ابوالقاسم محمدی2و3*، سمیرا هامیان2، محمد مقدم2و3، محمود تورچی2 و علی بنده­حق2

1 ایران، تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

2 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی

3 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، قطب علمی اصلاح مولکولی غلات

تاریخ دریافت: 08/02/97              تاریخ پذیرش: 14/11/97

چکیده

شوری یکی از عوامل اصلی محدود کننده تولید محصولات کشاورزی محسوب می­شود. مطالعات مختلف نشان دهنده تغییر بیان ژن­ها در نتیجه تغییرات فراژنتیکی تحت تنش­های غیر زیستی است. در این مطالعه، از تکنیک CRED-RA برای بررسی تغییرات الگوی متیله شدن توالی­های CCGG در ساقه و ریشه درقم جو Sahara3771 (متحمل به تنش شوری) و Clipper (حساس به تنش شوری) تحت دو تیمار صفر و 100 میلی مولار NaCl استفاده شد. نمونه­های برگ و ریشه جهت استخراجDNA ، 24 ساعت، سه هفته و پنج هفته پس از اعمال شوری برداشت شد. تحت تیمار شوری در بخش هوایی Sahara3771 در مقایسه با تیمار شاهد، 2/26% جایگاه­ها متیله و 86/15% آن­ها متیل­زدایی شدند. در ریشه آن نیز 74/7% و 38/9% از جایگاه­ها به ترتیب افزایش و کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری در مقایسه با شاهد داشتند. در بخش هوایی Clipper 02/17% و 74/11% جایگاه­ها تحت تیمار شوری به ترتیب افزایش و کاهش سطح متیله شدن در مقایسه با تیمار شاهد داشتند. در ریشه این ژنوتیپ نیز مقادیر افزایش و کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری به ترتیب 67/10% و 5/7% بود. در مجموع تعداد جایگاه­های بدون تغییر در بخش هوایی بیشتر از ریشه بود. همچنین تعداد جایگاه بدون تغییر در بخش هوایی Clipper بیشتر از Sahara3771 بود. نتایج نشان دادند که تغییرات الگوی متیله شدن می­تواند یکی از فاکتورهای کلیدی دخیل در تحمل بیشتر به شوری در جو باشد.

واژه های کلیدی: جو، تنش شوری، الگوی متیله شدن، CRED-RA

* نویسنده مسئول، تلفن:  09143114335  ، پست الکترونیکی: Mohammadi@tabrizu.ac.ir

مقدمه

 

جو از خانواده­ی Poaceae یکی از مهم­ترین غلات است که رتبه پنجم تولید ماده خشک در دنیا و رتبه­ی دوم سطح زیر کشت در ایران را دارد (4). جو به دلیل خصوصیات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و ژنتیکی مناسب به عنوان گیاه مدل در آزمایش­های مختلف استفاده می­شود (9).

شوری خاک از تنش­های مهم غیر زیستی بویژه در مناطق خشک و نیمه خشک است (27). بیش از شش درصد از کل زمین­های دنیا تحت تأثیر شوری قرار دارند. تنش اسمزی، سمیت یونی حاصل تجمع نمک­ و تنش ثانویه ناشی از شوری سه آسیب مهم وارده به گیاهان تحت تنش شوری هستند (26). برای تضمین عملکرد پایدار محصول و زیر کشت بردن زمین­هایی که به دلایل مختلف مثل شوری خاک قابل کشت نیستند، جهت تامین غذای مورد نیاز جمعیت رو به رشد جهان لازم است ارقامی با قدرت تحمل تنش­های محیطی تولید شوند. اولین قدم برای دستیابی به چنین هدفی درک کامل ساز و کارهای پاسخ گیاهان به تنش‌های غیر زیستی مانند شوری می‌باشد.

در نتیجه حضور نمک در غلظت­های بالا در حوزه ریشه تغییرات مورفولوژیکی، سلولی، بیوشیمیایی و مولکولی بسیاری در گیاه رخ می­دهد (18). مطالعات نشان داده است این تغییرات می­تواند ناشی از عوامل ژنتیکی، فراژنتیکی (Epigenetics factors) و محیطی باشد. هر تغییری که بدون تغییر در ساختار DNA منجر به تغییر در اثر ژن یا فنوتیپ شود یه تغییر فراژنتیک است (34). تغییرات فراژنتیکی می­توانند در طول زمان، در پاسخ به تنش­های زیستی و غیر زیستی (24) و بین افراد و جمعیت­ها متفاوت باشند (10). تغییر در بیان ژن، توانایی پاسخ سریع به محیط در حال تغییر و در نتیجه تطبیق فنوتیپ با شرایط محیطی جدید از نتایج تغییرات فراژنتیکی هستند (30).

تغییرات اپی­ژنتیک شامل متیله­شدن نوکلئوتیدها خصوصا سیتوزین و همچنین تغییرات هیستونی می­­باشد (1). متیله شدن DNA از مهم­ترین تغییرات فرا­ژنتیکی است که در آن یک گروه متیل (CH3-) از مولکول S-آدنوزیل متیونین با فعالیت آنزیم S-آدنوزیل متیل ترانسفراز به نوکلئوتیدها به ­ویژه سیتوزین در موقعیت شماره 5 آن انتقال می­یابد (8). متیله شدن سیتوزین معمولا بر روی کربن شماره 5 سیتوزینی که به دنبال آن یک گوانین قرار داشته باشد اتفاق می­افتد (توالی­های (CpG). این توالی­ها در ناحیه تنظیمی ژن­ها رایج­تر هستند (2). مولکول DNA علاوه بر نواحی مورد رونویسی در راه­اندازها نیز متیله می­شود. با متیله شدن DNA در ناحیه پروموتری ممکن است ژن به شکل غیرفعال شده درآید. بنابراین، کاهش در میزان متیله شدن اغلب منجر به افزایش در بیان ژن خواهد شد (5). اما مواردی خلاف این قاعده نیز گزارش شده است. در گیاهان بخش قابل توجهی از نوکلئوتیدهای متیله شده می­توانند بطور پایدار از والدین به نتاج منتقل شود (12). مثال­های بسیاری از اپی­الل­های متیله شده با فنوتیپ متمایز وجود دارد (13و 31).

متیل‌زدایی به دو روش فعال و غیر فعال روی می­دهد. متیل‌زدایی غیر فعال DNA ممکن است به دلیل محدود شدن متیله شدن جدید یا ناتوانی در حفظ ویژگی­های والدین بعد از همانندسازی DNA رخ دهد (14). متیل‌زدایی فعال با فعالیت ­گلیکوزیلازها با حذف گروه متیل از سیتوزین­ها اتفاق افتد (25). این امر ممکن است نقش مهمی در جلوگیری از شکل­گیری متیله شدن­های شدید پایدار در ژنوم­های گیاهی داشته باشد (28).

برای ارزیابی متیله شدن DNA روش­های مختلفی استفاده می­شود. یکی از ساده­ترین روش­ها، CRED-RA (Coupled Restriction Enzyme Digestion and Random Amplification)،  است که در آن DNA پس از تکثیر توسط آغازگرهای تصادفی، جداگانه توسط آنزیم­های HpaIIو MspI که دارای جایگاه شناسایی یکسان با حساسیت متفاوت به متیله شدن DNA هستند برش داده می­شود. چند شکلی بین محصولات برشی تفاوت در الگوی متیله شدن را نشان می­دهد (23). تکنیک CRED-RA به علت ساده، آسان و کم هزینه بودن نسبت به سایر روش­ها، برای بررسی اولیه متیله­شدنDNA  مناسب است (29). در این مطالعه الگوی متیله شدن DNA در ریشه و بخش هوایی ارقام جو  Sahara3771 و Clipper با حساسیت متفاوت به تنش شوری تحت تنش شوری با استفاده از روش CRED-RA مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

مواد گیاهی مورد مطالعه شامل ارقام جو Clipper و Sahara3771 بود. Clipper یک رقم تجاری استرالیایی، بهاره، دو ردیفه و حساس به شوری و Sahara3771 بومی آفریقایی شمالی با منشا الجزایر، زمستانه، شش ردیفه و متحمل به شوری است. ارقام Sahara3771 و Clipper از دانشگاه استرالیای غربی تهیه شد. به ­منظور بررسی تغییرات متیله شدن DNA تحت تنش شوری، ارقام Sahara3771 و  Clipper به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه بلوک‌های کامل تصادفی در سه تکرار با دو سطح شاهد و شوری 100 میلی مولار NaCl در گلخانه کشت شدند. پس از استقرار گیاهچه‌ها، تنش شوری در مرحله سه برگچه­ای اعمال شد. بر اساس مطالعات انجام یافته این مرحله حساس­ترین مرحله رشدی جو به تنش شوری است (6). گلدان­ها در شرایط کاملا کنترل شده گلخانه تحت شرایط دمایی °C 28 در روز و °C18در شب، با فتوپریود 18ساعت روز به 6 ساعت شب و در رطوبت نسبی 70 درصد رشد داده شدند. نمونه برداری در سه مرحله 24 ساعت، سه هفته و پنج هفته پس از اعمال تنش انجام شد.

به منظور ارزیابی تغییرات متیله شدن DNA در ریشه و ساقه جو تحت تنش شوری از روش CRED-RA استفاده شد. استخراج DNA به روش لودهی و همکاران (19) انجام و کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با الکتروفورز ژل آگاروز 8/0 درصد و اسپکتروفتومتر تعیین گردید. به منظور بررسی تغییرات متیله شدن DNA، ابتدا واکنش زنجیره­ای پلی­مراز با استفاده از آغازگرهای تصادفی به طول 10 نوکلئوتید انجام شد. اجزای واکنش زنجیره­ای پلی­مراز در جدول 2 آورده شده است.

جدول 1- ترکیبات و غلظت اجزای تشکیل دهنده محلول هوگلند

ترکیبات مورد  استفاده

 

غلظت (g/l)

Kh2Po4

14/0

KNO3

51/0

Ca(NO3)2

21/1

MgSO4.7H2O

5/0

ZnSO4.7H2O

005/0

H3BO3

007/0

MnCl2.2H2O

002/0

CuSO4.5 H2O

001/0

H2MoO4

0006/0

Fe-EDTA

03/0

 

 

جدول 2- اجزای واکنش زنجیره­ای پلیمراز

اجزای واکنش

مقادیر (lµ)

Master Mix 2X (Amplicon)

4

آب دیونیزه استریل

4

آغازگر RAPD

1

DNA ژنومی (ng/µl25)

2

MgCl2

2/0

 

چرخه­های حرارتی شامل واسرشت سازی اولیه در دمای °C94 به مدت پنج دقیقه، 40 چرخه واسرشت سازی در دمای °C 94 به مدت یک دقیقه، اتصال آغازگرها در دمای اتصال اختصاصی آن­ها به مدت یک دقیقه و بسط در دمای °C 72  به مدت یک و نیم دقیقه و در نهایت یک چرخه بسط نهایی به مدت 10 دقیقه در دمای °C 72 بود. بعد از انجام واکنش زنجیره­ای پلی­مراز، 5 میکرولیتر از محصولات تکثیری جداگانه با هر یک از آنزیم­های برشی ایزوشیزومراز HpaIIو MspI به مدت 16 ساعت در دمای °C 37 تیمار شدند. برش محصولات PCR با استفاده از آنزیم­های ایزوشیزومراز HpaIIو MspI در حجم ۱۶ میکرولیتر و با اجزای جدول 3 انجام شد.

علاوه براین، پنج میکروگرم DNA ژنومی از هر رقم و سطح تنش و در هر مرحله به طور جداگانه با یک واحد از آنزیم­های برشی ایزوشیزومرازاز HpaII و MspI به طور جداگانه به مدت 16 ساعت در °C 37 تیمار داده شدند. برش DNA ژنومی به کمک دو آنزیم ایزوشیزومرازاز HpaII و MspI در حجم 20 میکرولیتر با اجزای جدول 4 انجام شد. بعد از تایید برش DNA توسط آنزیم­ها با استفاده از ژل آگارز، دو میکرولیتر از محصولات برشی DNA ژنومی به عنوان الگو در واکنش زنجیره­ای پلیمراز با استفاده از همان آغازگرهای تصادفی استفاده شد (جدول 2). در این بررسی از 10 آغازگر تصادفی استفاده شد که اسامی و توالی آن­ها در جدول 5 ذکر شده است. دمای اتصال اختصاصی آغازگرهای مورد استفاده °C34 بود.

جدول 3- اجزای واکنش برش محصولات PCR با استفاده از آنزیم­های HpaIIو MspI

اجزای واکنش

مقدار در هر نمونه (lµ)

آب دیونیزه استریل

9

محصولات PCR

5

بافر X) Tango 10)

1

هر کدام از آنزیم­های HpaII یا MspI

1

 

جدول 4- اجزای واکنش برش DNA ژنومی با استفاده دو آنزیم HpaII و MspI

اجزای واکنش

مقدار در هر نمونه (lµ)

هر نمونه (میکرولیتر)

آب دیونیزه استریل

16

DNA ژنومی

2

بافر X) Tango 10)

2

هر کدام از آنزیم­های HpaIIیا MspI

1

 

تفکیک محصولات تکثیری با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز یک درصد و آشکارسازی جایگاه­ها بر اساس رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید انجام شد. برای تعیین اندازه قطعات تکثیری از نشانگر وزن مولکولی با اندازه قطعات 3000 - 100 جفت باز (Fermentase, #SM0321) در سه قسمت ژل استفاده شد.

با استفاده از روش CRED-RA بر مبنای آنزیم­های ایزوشیزومرازاز HpaIIو MspI، چهار نوع الگوی نواری چند شکل علاوه بر جایگاه­های تک شکل حاصل شد (جدول 6). وجود نوار در تکثیر با استفاده از DNA ژنومی و نیز DNA ژنومی برش یافته با استفاده از هر دو آنزیم برشی، نشان دهنده متیله شدن سیتوزین اول جایگاه تشخیص آنزیم در هر دو رشته است و در این حالت هیچ کدام از آنزیم­ها قادر به برش DNA در جایگاه برش نمی­باشند (الگوی متیله شدن نوع چهارم). تکثیر نوار با استفاده از DNA ژنومی و DNA برش یافته با آنزیم MspIو عدم تکثیر با استفاده از DNA برش یافته با آنزیم HpaIIنشان دهنده الگوی متیله شدن نوع دوم و تکثیر با استفاده از DNA ژنومی و DNA برش یافته با آنزیم HpaII و عدم تکثیر با استفاده از DNA برش یافته با آنزیم MspI نشان دهنده الگوی متیله شدن نوع سوم در جایگاه تشخیص آنزیم است. تکثیر فقط با استفاده از DNA‌ ژنومی، بیانگر آن است که یا در قطعه تکثیری جایگاه تشخیص آنزیم وجود ندارد و یا جایگاه تشخیص آنزیم متیله نشده و یا فقط سیتوزین دوم در یک رشته متیله شده است. بنابراین، هردو آنزیم جایگاه تشخیص را شناسایی و DNA را برش دادند (نوع اول). برای اطمینان از وجود و عدم وجود جایگاه تشخیص آنزیم در قطعه تکثیری با DNA ژنومی، قطعات تکثیری نیز با آنزیم­های HpaII و MspIبرش داده شدند. اگر قطعات تکثیری با آنزیم­ها برش داده شوند، جایگاه تشخیص وجود دارد ولی عدم برش قطعه تکثیری با آنزیم­ها نشانگر عدم وجود جایگاه تشخیص آنزیم در قطعه تکثیری می­باشد.

جدول 5- مشخصات آغازگرهای تصادفی مورد استفاده در روش CRED-RA

نام آغازگر

توالی آغازگر

MT5

CTCACCGTCC

MT21

CCCGCCGTTG

MT25

CCGTCTCTTT

428

GGCTGCGGTA

454

GCTTACGGCA

465

GGTCAGGGCT

541

GCCCCTTTAC

630

CACTTAACCG

663

CGTATAGCCG

698

CTAGACGTTG

 

جدول 6- واکنش­ آنزیم­های HpaIIو MspIبه متیله شدن سیتوزین در جایگاه تشخیص آنزیم

نوع

الگوی متیله شدن

Msp I

HpaII

اول

CCGG

GGCC

CCGG

GGCC

فعال

فعال

دوم

 

CCGG

GGCC

غیرفعال

فعال

سوم

 

CCGG

GGCC

فعال

غیر فعال

چهارم

 

CCGG

GGCC

غیر فعال

غیر فعال

نتایج

محصولات برش DNA استخراج شده از برگ و ریشه ارقام Sahara3771 و Clipper تحت تیمارهای شاهد و 100  میلی مولار NaCl، توسط آنزیم­های HpaIIو MspI توسط 10 آغازگر تصادفی به طول 10 نوکلوتید در واکنش زنجیره­ای پلی­مراز تکثیر شدند و انواع مختلفی از تغییرات الگوی متیله شدن مشاهده شد (شکل 1). الگوی متیله شدن DNA ارقام Sahara3771 و Clipper در سه مرحله رشدی نشان دهنده افزایش میزان متیله شدن و متیل­زدایی تحت تیمارهای شوری 100 میلی مولار NaCl در مقایسه با تیمار شاهد بود. متوسط تعداد جایگاه­های تغییرنیافته در بخش هوایی Sahara3771 و Clipper به ترتیب 93/57 و 41/72 بود. تعداد جایگاه­های تغییرنیافته در ریشه Sahara3771 86/82 % و در ریشه Clipper 95/55 % بود. جدول­های 7 و 8 تعداد جایگاه­های بدون تغییر در وضعیت متیله شدن، متیله شده و متیل­زدایی شده در جایگاه برش را به ترتیب در بخش هوایی و ریشه Sahara3771 و Clipper تحت تنش شوری در مقایسه با تیمار شاهد در زمان­های مختلف نمونه­برداری نشان می­دهند.

Sahara3771-سه هفته

الگوی نوع چهارم

Clipper-4 ساعت

الگوی نوع سوم

الگوی نوع دوم

الگوی نوع اول

تنش

شاهد 

تنش

شاهد 

تنش

شاهد 

Sahara3771-24 ساعت

در بخش هوایی Sahara3771 و تحت تنش شوری در مقایسه با تیمار شاهد به­طور متوسط 2/26 % جایگاه­ها افزایش و 86/15 % جایگاه­ها کاهش سطح متیله شدن نشان دادند و در هر سه مرحله نمونه برداری تحت تنش شوری درصد جایگاه­های متیله شده بیشتر از جایگاه­های متیل زدایی شده بود. اما 24 ساعت پس از اعمال شوری، در مقایسه با تیمار شاهد در ریشه این رقم تعداد جایگاه­های متیله شده و سه هفته بعد از آن تعداد جایگاه­های متیل زدایی شده درصد بیشتری از تغییرات متیله شدنی را تشکیل می­دادند. در پنج هفته پس از اعمال شوری درصد جایگاه­های متیله و متیل زدایی شده مقادیر مشابهی را تشکیل می­دادند. در مجموع بیشترین میزان تغییرات متیله شدنی در مقایسه با شاهد در مرحله 24ساعت پس از اعمال شوری حاصل شد. در بخش هوایی Sahara3771 بیشترین و کمترین تغییرات متیله شدن DNA در بخش هوایی Sahara3771 تحت تنش شوری در مقایسه با تیمار شاهد به ترتیب 24 ساعت و پنج هفته پس از اعمال شوری مشاهده شد.

 

 

1000 bp

800 bp

600 bp

400 bp

200 bp

 100 bp

شکل1- الگوی نواری ریشه Sahara3771 وClipper  تحت دو تیمار صفر و 100 میلی مولار NaCl بر مبنای آغازگر شماره 625

 

 

 

در بخش هوایی Clipper تحت تنش شوری و در مقایسه با تیمار شاهد به­طور متوسط 02/17 % جایگاه­ها افزایش و 74/11 % آنها کاهش در سطح  متیله شدن نشان دادند. همانند آنچه در Sahara3771 مشاهده شد تحت تیمار شوری تعداد جایگاه­های دارای افزایش متیله شدن بیشتر از جایگاه متیل زدایی شده بود. بیشترین تغییرات متیله شدنی در بخش هوایی Clipper پنج هفته پس از اعمال شوری مشاهده شد. 24 ساعت و پنج هفته پس از اعمال شوری در بخش هوایی Clipper تعداد جایگاه­های متیله شده بیشتر از تعداد جایگاه­های متیل زدایی شده بود. در مرحله نمونه برداری سه هفته پس از اعمال شوری جایگاه­های متیله شده و دی متیله مقادیر مشابه­ای داشتند. پنج هفته پس از اعمال تیمار شوری در بخش هوایی Clipper حساس به شوری در مقایسه با Sahara3771 متحمل به شوری تغییرات متیله شدنی بیشتری در مقایسه با مرحله 24 ساعت مشاهده شد.

مطالعه وضعیت متیله شدنی ریشه نشان دهنده تعداد بیشتر جایگاه­های بدون تغییر در پاسخ به تنش شوری در مقایسه با بخش هوایی بود. به نظر می­رسد با اینکه ریشه اولین اندام دریافت کننده تنش شوری است تغییر وضعیت متیله شدنی در پاسخ به آن عموما در بخش هوایی رخ می­دهد. متوسط تعداد جایگاه­های دارای افزایش و کاهش سطح متیله شدن در ریشه Sahara3771 به ترتیب 74/7 % و 38/9 % بود. در Sahara3771 متحمل به شوری 24 ساعت پس از اعمال تنش متیله شدن و سه هفته پس از تیمار متیل زدایی مقادیر بیشتری از تغییرات متیله شدنی را به خود اختصاص دادند. پنج هفته پس از اعمال شوری این دو گروه تغییرات متیله شدنی مقادیر مشابهی داشتند.

مطالعه الگوی متیله شدن در ریشه Clipper نشان داد 67/10 % جایگاه­ها دارای افزایش و 5/7 % آن­ها دارای کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری در مقایسه با شاهد بودند. در Clipper حساس به شوری 24 ساعت پس از اعمال تیمار شوری همانند Sahara3771، تعداد جایگاه­های متیله شده بیشتر از تعداد جایگاه­های ­متیله زادیی شده بود. سه و پنج هفته پس از اعمال شوری این دو گروه تغییرات در وضعیت متیله شدن مقادیر مشابهی داشتند. تحت تنش شوری درصد جایگاه­های بدون تغییر الگوی متیله شدن در ریشه Sahara3771 متحمل به شوری بیشتر از بخش هوایی آن بود. درصد جایگاه­های فاقد تغییر در الگوی متیله شدنی در مراحل 24 ساعت و سه هفته پس از اعمال شوری و در ریشه و بخش هوایی Clipper حساس به شوری مقادیر نزدیکی داشتند اما در مرحله پنج هفته  پس از اعمال تنش تعداد جایگاه­های بدون تغییر در الگوی متیله شدنی در ریشه بطور قابل توجهی بیشتر از بخش هوایی بود. در مجموع تعداد جایگاه­های بدون تغییر در بخش هوایی Clipper بیشتر از Sahara3771 بود. وقوع تغییرات متیله شدنی می­تواند یکی از فاکتورهای دخیل در تحمل بیشتر این رقم به شوری در مقایسه با Clipper باشد.

همچنین میزان متیلاسیون جایگاه­ها در بخش هوایی و ریشه در نمونه­های شاهد بین زمان­های 24 ساعت، سه هفته و 5 هفته مقایسه شد. نتایج در جدول 9 نشان داده شده است. بر این اساس در مرحله 3 هفته در مقایسه با 24 ساعت تعداد جایگاه­های بدون تغییر ساقه در هر دوژنوتیپ Sahara3771 و Clipper بیشتر از ریشه بود. در مقایسه مرحله 3 هفته و 5 هفته با 24 ساعت در هر دو ژنوتیپ تعداد جایگاه­های دارای افزایش سطح متیلاسیون در ریشه بیشتر از ساقه بود. تعداد جایگاه دارای افزایش سطح متیلاسیون در مرحله 3 هفته بیشتر از 5 هفته بود.

بحث و نتیجه گیری

تنش­های محیطی می­توانند موجب تغییر در الگوی متیله شدن DNA گیاهان شوند. گونه­های فعال اکسیژن که در نتیجه تنش شوری تولید می­شوند، اثرهای مخربی بر روی مولکول­هایی نظیر پروتئین­ها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئوئیک دارند (21).

 

جدول 9- تغییرات الگوی متیله شدن بخش هوایی و ریشه Sahara3771 و Clipper در نمونه­های شاهد بین زمان­های 3 هفته در مقایسه با 24 ساعت، 5 هفته در مقایسه با 24 ساعت و  3 هفته در مقایسه با 5 هفته

 3هفته در مقایسه با 5 هفته

5 هفته در مقایسه با 24 ساعت

3 هفته در مقایسه با 24 ساعت

 

 

کاهش سطح متیله شدن

افزایش سطح متیله شدن

بدون تغییر

کاهش سطح متیله شدن

افزایش سطح متیله شدن

بدون تغییر

کاهش سطح متیله شدن

افزایش سطح متیله شدن

بدون تغییر

 

 

29

21

93

22

32

91

13

26

106

Sahara3771

ساقه

21

22

102

30

27

88

13

9

123

Clipper

36

28

76

22

66

52

8

51

81

Sahara3771

ریشه

16

29

94

15

62

60

15

102

72

Clipper

 

 

خسارت ناشی از تنش اکسیداتیو بر DNA می­تواند الگوی متیله شدن آن را تحت تاثیر قرار دهد و گزارشات متعددی از آسیب DNA در نتیجه شوری وجود دارد. برای مثال ROS های حاصل از تنش مستقیما بر الگوی متیله شدن تاثیر میگذارند (16). تغییرات متیله شدن DNA تحت تنش شوری شامل کاهش و افزایش سطح متیله شدن ژن­ها است. اما در مجموع تعداد جایگاه­های متیله شده ژنوم تحت این تنش بیشتر از جایگاه­های متیل زدایی شده است (7). متیله شدن نوکلئوتیدهای سیتوزین اصولا با خاموشی ژن همراه است (22). اما مواردی مبنی بر نقض این قاعده موجود هستند. برای مثال بیان ژن FLC که یکی از ژن­های عامل بازدارندگی گلدهی می­باشد با کاهش سطح متیله شدن آن بازداشته شده و منجر به گلدهی زودهنگام می­شود. این امر در ارتباط با کاهش سطح متیله شدن هیستون­های H3 و کاهش سطح متیله و استیله شدن هیستون­های H4 و نه DNA است (11).  می­توان نتیجه گرفت همیشه متیله شدن به معنی خاموشی ژن نیست.

گیاهان سطوح نسبتا بالایی از 5-متیل سیتوزین دارند (8). این مقدار از 25-6 درصد کل سیتوزین­ها را بسته به گونه دربرمی­گیرد (29). تکنیک CRED-RA برای بررسی تغییرات الگوی متیله شدن در توالی­های CCGG مورد استفاده قرار می­گیرد. در هر سه مرحله نمونه برداری تعداد جایگاه­های بدون تغییر در ریشه Sahara3771 بیشتر از بخش هوایی بود. در Clipper هم در هر سه مرحله نمونه برداری تعداد جایگاه­های بدون تغییر در ریشه بیشتر از بخش هوایی بود. اما در Clipper حساس به شوری اختلاف تعداد جایگاه­های بدون تغییر بین ریشه و ساقه  کمتر از Sahara3771 بود. همچنین نتایج حاصل از این مطالعه نشان دهنده تعداد بیشتر جایگاه­های متیله و متیل زدایی شده بخش هوایی Sahara3771 در پاسخ به تنش شوری در مقایسه با Clipper حساس به شوری بود. به نظر می­رسد یکی از فاکتورهای دخیل در تحمل بیشتر Sahara3771 به شوری توانایی پاسخ به تنش در نتیجه تغییر الگوی متیله شدن است. سازگاری سریع به شوری حاصل تنظیم بیان ژن به واسطه متیله شدن سیتوزین است (20). ژائو و همکاران (35) تغییرات الگوی متیله شدن سیتوزین را در پنبه تحت تنش شوری با روش MSAP بررسی کردند. بر این اساس تعداد جایگاه­های سیتوزین متیله و متیل زدایی شده در لاین­های متحمل بیشتر از لاین­های حساس بود. زونگ و همکاران (36) نیز نشان دادند که در شرایط شوری سطح متیله شدن توالی‌های CCGG در رقم متحمل گندم بیشتر از رقم حساس است.

با وجود اختلاف قابل توجه تعداد جایگاه­های دارای تغییر الگوی متیله شدن در بخش هوایی بین Sahara3771 و Clipper، مطالعه حاضر نشان دهنده نبود تفاوت چشم­گیر بین دو ژنوتیپ از نظر تعداد جایگاه دارای تغییر در الگوی متیله شدن در ریشه بود. با توجه به نتایج بالا و تحمل بیشتر Sahara3771 به شوری احتمالا نقش ساقه در تحمل شوری بیشتر از ریشه است. بنابراین تمرکز بر صفات و ژن­های ریشه در بهبود تحمل به شوری نتایج بهتری به دنبال خواهد داشت. مقایسه الگوی نواری MSAP در ریشه و بخش هوایی چهار ژنوتیپ برنج تحت شرایط عادی و تنش شوری نشان دهنده درصد بیشتر جایگاه­های متیله و متیل‌زدایی شده تحت تنش شوری در ساقه در مقایسه ریشه بود (15). 

تعداد جایگاه­های متیله شده تحت تنش شوری در ساقه Sahara3771 بیشتر از ریشه بود. در هر دو اندام حداکثر تعداد جایگاه متیله شده در مقایسه با شاهد 24 ساعت پس از اعمال شوری مشاهده شد. اما در Clipper حساس به شوری تعداد جایگاه­های متیله شده تحت تنش در ریشه بیشتر از ساقه بود. بیشترین تعداد جایگاه­های متیله شده در ریشه و ساقه Clipper به ترتیب 24 ساعت و پنج هفته پس از اعمال شوری مشاهده شد. در مطالعه وانگ و همکاران (33) متیله شدن سیتوزین­ها با سازگاری به خشکی پیوستگی نشان داد. خشکی هم‌چنین منجر به متیله شدن شدید سیتوزین (CCGG) در ژنوم نخود شد (17). مطالعه ارتورک و همکاران (3) بر روی تغییرات متیله شدن DNA در ذرت تحت غلظت­های صفر، پنج، 10، 20 و 40 میلی­مولار بٌر با استفاده از روش CRED-R نشان دهنده افزایش میزان متیله شدن DNA تحت تیمارهای بٌر در مقایسه با شاهد بود.

شواهد زیادی نشان دهنده نقش متیلاسیون DNA در تنظیم بیان­ ژن­ها در طول رشد و نمو گیاهان است (4، 24، 39). همچنین بسیاری از مطالعات نشان داده­اند DNA گیاهان در بافت­های بزرگسال در مقایسه با بافت­های جوان در سطوح بالاتری متیله شده است (10، 15، 28، 44، 45، 48). اما برخی گزارش­ها حاکی از سطوح پایین­تر متیلاسیون را در گیاهان بزرگسال در مقایسه با گیاهان جوان بوده است (1، 13، 31، 32، 34). گو و همکاران  (2011) و یوآن و همکاران (2014) گزارش کردند که با افزایش سن گیاه مجموع DNA متیله شده گیاهان بامبو بطور قابل توجهی افزایش پیدا کرد. مجموع شواهد بیان کننده این مطلب است که وضعیت متیلاسیون DNA ژنومی در طول افزایش سن گیاه  و پیری متفاوت باشد که منجر به تغییرات در بیان ژن­های مرتبط با سن گیاه شود. سطح و الگوی متیلاسیون سیتوزین توسط  دو سیستم متیلاسیون و متیل زدایی تعیین می­شوند.

سپاسگزاری

از قطب علمی اصلاح مولکولی غلات دانشگاه تبریز برای فراهم کردن هزینه و امکانات آزمایشگاهی این تحقیق قدردانی می­شود.

1-      Baurens, F.C., Nicolleau, J., Legavre, T., Verdeil, J.L., Monteuuis, O. 2004. Genomic DNA methylation of juvenile and mature Acacia mangium micropropagated in vitro with reference to leaf morphology as a phase change marker. Tree Physiol., 24: 401-407.

2-      Berger, S.L., Kouzarides, T., Shiekhattar, R. and Shilatifard, A. 2009. An operational definition of epigenetics. Genes Dev., 23: 781-783.

3-      Bossdorf, O., Richards, C.L. and Pigliucci, M. 2008. Epigenetics for ecologists. Ecol. Letters, 11: 106-115.

4-      Ding, H., Gao, J., Qin, C., Ma, H., Huang, H., Song, P., Luo, X., Lin, H., Shen, Y., Pan, G., Zhang, Z. 2014. The dynamics of DNA methylation in maize roots under Pb stress. - Int. J. mol. Sci., 15: 23537-23554.

5-      Erturk, F.A., Guleray, A., Gokce, N., Esra, A. and Burcu, S. 2013. Epigenetic effects of boron (b) pollution on Zea mays seedling. J. Selcuk Uni. Nat. Appl. Sci. 2: 757-762.

6-      FAO. 2014. Faostat. FAO, Rome. www.faostat.fao.org.

7-      Finnegan, E.J., Genger, R.K., Peacock, W.J. and Dennis, E.S. 1998. DNA methylation in plants. Ann.Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 49: 223-247. 

8-      Greenway, H. 1965. Plant response to saline substrates. Growth and ion uptake throughout plant development in two varieties of Hordeum vulgare. Aust. J. Biol. Sci., 18: 763-779.

9-      Guangyuan, L., Xiaoming, W., Biyun, C., Gao, G. and Kun, X. 2007. Evaluation of genetic and epigenetic modification in rape-seed (Brassica napus) induced by salt stress. J. Integr. Plant Biol., 49: 1599-1607.

10-   Guo, G.P., Gu, X.P., Yuan, J.L., Wu, X.L.  2011. Research on the features of DNA methylation in leaves of different chronological ages of Phyllostachys heterocycla var. pubescens based on the method of MSAP. Hereditas, 33: 794-800.

11-   Hafiz, I.A., Abbasi, N.A., Hussain, A., Waheed A. and Naqvi. S.M.S. 2006. The methylation sensitive amplification polymorphism in juvenile and adult phase crab apple (Malus micromalus). Pak. J. Bot., 38: 1149-1157.

12-   Harlan, J.R. and Zohary, D. 1966. Distribution of wild wheats and barley. Science, 153: 1074-1080.

13-   Hasbún, R., Valledor, L., Berdasco, M., Santamaria, E., Cañal, M.J., Rodriguez, R., Rios, D., Sánchez, M. 2005. In vitro proliferation and genome DNA methylation in adult chestnuts. Acta Horticult., 693: 333-340.

14-   Herrera, C.M. and Bazaga, P. 2010. Epigenetic differentiation and relationship to adaptive genetic divergence in discrete populations of the violet Viola cazorlensis. New Phytol., 187: 867–876.

15-   Huang, L.C., Hsiao, L.J., Pu, S.Y., Kuo, C.I., Huang, B.L., Tseng, T.C., Huang, H.J., Chen, Y.T. 2012. DNA methylation and genome rearrangement characteristics of phase change in cultured shoots of Sequoia sempervirens. Physiol. Plant., 145: 360-368.

16-   Jean Finnegan, E., Kovac, K.A., Jaligot, E., Sheldon, C.C., James Peacock, W. and Dennis, E.S. 2005. The downregulation of FLOWERING LOCUS C (FLC) expression in plants with low levels of DNA methylation and by vernalization occurs by distinct mechanisms. Plant J., 44: 420-432.

17-   Johannes, F., Porcher, E., Teixeira, F.K., Saliba-Colombani, V., Simon, M., Agier, N., Bulski, A., Albuisson, J., Heredia, F., Audigier, P. Bouchez, D., Dillmann, C., Guerche, P., Hospital, F. and Colot, V. 2009. Assessing the impact of transgenerational epigenetic variation on complex traits. Plos Genet., 5: 1-11.

18-   Kalisz, S. and Purugganan, M.D. 2004. Epialleles via DNA methylation: consequences for plant evolution. Trends Ecol. Evol., 19: 309-314.

19-   Kankel, M.W., Ramsey, D.E., Stokes, T.L., Flowers, S.K., Haag, J.R., Jeddeloh, J.A., Riddle, N.C., Verbsky, M.L. and Richards, E.J. 2003. Arabidopsis MET1 cytosine methyltransferase mutants. Genetics, 163: 1109-1122.

20-   Karan, R., DeLeon, T., Biradar, H. and Subudhi, P.K. 2012. Salt stress induced variation in DNA methylation pattern and its influence on gene expression in contrasting rice genotypes. PLoS ONE, 7: 1-10.

21-   Katsuhara, M. and Kawasaki, T. 1996. Salt stress induced nuclear and DNA degradation in meristematic cells of barley. Plant Cell Physiol., 37: 169-173.

22-   Labra, M., Ghiani, A., Citterio, S., Sgorbati, S., Sala, F., Tannini, C., Ruffini-Castiglione, M. and Bracale, M. 2002. Analysis of cytosine methylation pattern in response to water deficit in pea root tips. Plant Biol., 4: 694-699.

23-   Lima, M.D.B. and Bull, L.T. 2008. Produção de cebola em solo salinizado. Revista Brasileira de Engenharia Agrícola e Ambiental 12: 231-235.

24-   Liu, J.Z., Feng, L.L., Li, J.M., He, Z.H. 2015. Genetic and epigenetic control of plant heat responses. Front. Plant Sci., 6: 1-21.

25-   Lodhi, M.A., Guang-Ning, Y., Weeden, F.N. and Reisch, B.I. 1994. A simple and effiient method for DNA extraction from grapevine cultivars and Vitis species. Plant Mol. Biol. Rep., 12: 6-13.

26-   Lukens, L.N. and Zhan, S.H. 2007. The plant genome’s methylation status and response to stress: Implications for plant improvement. Curr. Opin. Plant Biol., 10: 317-322.

27-   Mahajan, S. and Tuteja, N. 2005. Cold, salinity and drought stresses: an overview. Arch. Biochem. Biophys., 444: 139-158.

28-   Mankessi, F., Saya, A.R., Favreau, B., Doulbeau, S., Conéjéro, G., Lartaud, M., Verdeil, J.L., Monteuuis, O. 2011. Variations of DNA methylation in Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis shoot tips and apical meristems of different physiological ages. Physiol. Plant, 143: 178-187.

29-   Martienssen, R.A. and Colt, V. 2001. DNA methylation and epigenetic inheritance in plants and filamentous fungi. Science, 293: 1070-1074.

30-   McClelland, M., Nelson, M. and Raschke, E. 1994. Effect of site-specific modification on restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases. Nucleic Acids Res., 22: 3640-3659.

31-   Meng, F.R., Li, Y.C., Yin, J., Liu, H., Chen, X.J., Ni, Z.F., Sun, Q.X. 2012. Analysis of DNA methylation during the germination of wheat seeds. Biol. Plant, 56: 269-275.

32-   Michalak, M., Plitta-Michalak, B.P., Naskret-Barciszewska, M., Barciszewski, J., Bujarska-Borkowska, B., Chmielarz, P. 2015. Global 5-methylcytosine alterations in DNA during ageing of Quercus robur seeds. Ann. Bot., 116: 369-376.

33-   Molinier, J., Ries, G., Zipfel, C. and Hohn, B. 2006. Transgeneration memory of stress in plants. Nature, 442: 1046-1049.

34-   Monteuuis, O., Baurens, F.C., Goh, D.K.S., Quimado, M., Doulbeau, S., Verdeil, J.L. 2009. DNA methylation in Acacia mangium in vitro and ex vitro buds, in relation to their within-shoot position, age and leaf morphology of the shoots. - Silvae Genet., 58: 287-292.

35-   Morales-Ruiz, T., Ortega-Galisteo, A.P., Ponferrada-Marin, M.I., Martinez-Macias, M.I., Ariza, R.R. and Roldan-Arjona, T. 2006. Demeter and Repressor of silencing 1 encode 5-methylcytosine DNA glycosylases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103: 6853-6858.

36-   Munns, R. and Tester, M. 2008. Mechanisms of salinity tolerance. Plant Biol. J., 59: 651-681.

37-   Parvaiz, A. and Satyawati, S. 2008. Salt stress and phyto biochemical responses of plants. Plant Soil, 54: 89-99.

38-   Penterman, J., Zilberman, D., Huh, J.H., Ballinger, T., Henikoff, S. and Fischer, R.L. 2007. DNA demethylation in the Arabidopsis genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104: 6752-6757.

39-   Plitta, B.P., Michalak, M., Bujarska-Borkowska, B., Barciszewska, M.Z., Barciszewski, J., Chmielarz, P. 2014. Effect of desiccation on the dynamics of genome-wide DNA methylation in orthodox seeds of Acer platanoides L. Plant Physiol. Biochem., 85: 71-77.

40-   Prakash, A.P. and Kumar, P.P. 1997. Inhibition of shoot induction by 5- azacytidine and 5-aza-2-deoxycytidine in Petunia involves hypomethylation. Plant Cell Rep., 16: 719-724.

41-   Rando O.J. and Verstrepen, K.J. 2007. Timescales of Genetic and Epigenetic Inheritance. Cell, 128: 655-668.

42-   Richards, E.J. 2006. Inherited epigenetic variation–revisiting soft inheritance. Nat. Rev. Genet., 7: 395-401.

43-   Steward, N., Ito, M., Yamachuchi, Y., Koizumi, N. and Sano, H. 2002. Periodic DNA methylation in maize nucleosomes and demethylation by environmental stress. J. Biol. Chem., 277: 37741-37746.

44-   Sun, L.F., Liu, T.J., Shan, X.H., Su, S.-Z., Li, S.P., Yuan, Y.P., Zhang, J. 2015. Analysis of DNA cytosine methylation patterns in maize hybrids and their parents. Biol. Plant., 59: 266-272.

45-   Valledor, L., Meijón, M., Hasbún, R., Cañal, M.J., Rodríguez, R. 2010. Variations in DNA methylation, acetylated histone H4, and methylated histone H3 during Pinus radiata needle maturation in relation to the loss of in vitro organogenic capability. J. Plant Physiol., 167: 351-357.

46-   Wang X, Li Y, Ji W, Bai X, Cai H, Zhu D, Sun XL, Chen LJ, Zhu YM. 2011. A novel Glycine soja tonoplast intrinsic protein gene responds to abiotic stress and depresses salt and dehydration tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. J. Plant Physiol., 168: 1241-1248.

47-   Whitelaw, N.C. and Whitelaw, E.2006. How lifetimes shape epigenotype within and across generations. Hum. Mol. Genet., 15: 131-137.

48-   Yuan, J.L., Sun, H.M., Guo, G.P., Yue, J.J., Gu, X.P. 2014. Correlation between DNA methylation and chronological age of moso bamboo (Phyllostachys heterocycla var. pubescens). Bot. Stud., 55: 1-7.

49-   Zhao, Y.L., Yu, S.X., Ye, W.W., Wang, H.M., Wang, J.J. and Fang, B.X. 2010. Study on DNA cytosine methylation of cotton (Gossypium hirsutum L.) genome and its implication for salt tolerance. Agr. Sci. China, 9: 783-791.

50-   Zhong, L., Yan-hao Xu, Y.H. and Wang, J.B. 2009. DNA-methylation changes induced by salt stress in wheat Triticum aestivum. Afr. J. Biotechnol., 8: 6201-6207.