نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران
2 استاد گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
3 دانش آموخته گروه بهنژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
4 استاد گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران
چکیده
شوری یکی از عوامل اصلی محدود کننده تولید محصولات کشاورزی محسوب میشود. مطالعات مختلف نشان دهنده تغییر بیان ژنها در نتیجه تغییرات فراژنتیکی تحت تنشهای غیر زیستی است. در این مطالعه، از تکنیک CRED-RA برای بررسی تغییرات الگوی متیله شدن توالیهای CCGG در ساقه و ریشه درقم جو Sahara3771 (متحمل به تنش شوری) و Clipper (حساس به تنش شوری) تحت دو تیمار صفر و 100 میلی مولار NaCl استفاده شد. نمونههای برگ و ریشه جهت استخراجDNA ، 24 ساعت، سه هفته و پنج هفته پس از اعمال شوری برداشت شد. تحت تیمار شوری در بخش هوایی Sahara3771 در مقایسه با تیمار شاهد، 2/26% جایگاهها متیله و 86/15% آنها متیلزدایی شدند. در ریشه آن نیز 74/7% و 38/9% از جایگاهها به ترتیب افزایش و کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری در مقایسه با شاهد داشتند. در بخش هوایی Clipper 02/17% و 74/11% جایگاهها تحت تیمار شوری به ترتیب افزایش و کاهش سطح متیله شدن در مقایسه با تیمار شاهد داشتند. در ریشه این ژنوتیپ نیز مقادیر افزایش و کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری به ترتیب 67/10% و 5/7% بود. در مجموع تعداد جایگاههای بدون تغییر در بخش هوایی بیشتر از ریشه بود. همچنین تعداد جایگاه بدون تغییر در بخش هوایی Clipper بیشتر از Sahara3771 بود. نتایج نشان دادند که تغییرات الگوی متیله شدن میتواند یکی از فاکتورهای کلیدی دخیل در تحمل بیشتر به شوری در جو باشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
DNA methylation Pattern in shoot and root of barley under salinity stress
نویسندگان [English]
1 Assistant Professor of Biology Department, Faculty of Natural Science, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz , Iran
2 Professor of Plant Breeding and Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Tabriz university, Tabriz, Iran
3 3. Graduated of Plant Breeding and Biotechnology Department, Faculty of Agriculture, Tabriz university, Tabriz, Iran
4 Professor of Department of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Tabriz, Tabriz, Iran
چکیده [English]
Salinity is one of the most crucial factors, which inhibits crop production. A large number of evidence reveal that epigenetic mechanisms modulate the gene expression in plants under abiotic stresses. Obviously, by understanding epigenetic regulation of plant growth and response to stresses, a heritable variation could be develop for crop breeding. In this study the DNA methylation alteration under salt stress analyzed in two barley cultivars differing in salt tolerance, namely Sahara3771 and Clipper. Coupled Restriction Enzyme Digestion-Random Amplification (CRED-RA) was utilized to detect CCGG sequence methylation alternation in shoot and root of the plants growing under o and 100 mM NaCl treatment. Leaf and root samples for DNA extraction were harvested 24 hours, 3 weeks, and 5 weeks after salt treatment. The results revealed that under salinity stress in shoot of Sahara3771 26.20% and 15.86% of sites were hypermethylated and demethylated respectively compared to control. Average number of hyper and demethylated sites in root of Sahara3771 were 74.7% and 38.9% respectively. In shoot of Clipper 17.02% of sites was hypermethylated and 11.74% of them demethylated. Average number of hyper and demethylated sites in root of Clipper were 67.10% and 5.7% respectively. Totally, number of methyl-changed sites in shoots was higher than roots in both genotype. In addition, number of methyl-unchanged sites in shoot of Sahara3771 was higher than Clipper. These results revealed that alteration of DNA methylation in plants could be a key factor in adaptation and toleration of plants to salinity.
کلیدواژهها [English]
الگوی متیله شدن DNA در ریشه و ساقه جو تحت تنش شوری
سارا غفاریان1و2، سید ابوالقاسم محمدی2و3*، سمیرا هامیان2، محمد مقدم2و3، محمود تورچی2 و علی بندهحق2
1 ایران، تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
2 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه به نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی
3 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، قطب علمی اصلاح مولکولی غلات
تاریخ دریافت: 08/02/97 تاریخ پذیرش: 14/11/97
چکیده
شوری یکی از عوامل اصلی محدود کننده تولید محصولات کشاورزی محسوب میشود. مطالعات مختلف نشان دهنده تغییر بیان ژنها در نتیجه تغییرات فراژنتیکی تحت تنشهای غیر زیستی است. در این مطالعه، از تکنیک CRED-RA برای بررسی تغییرات الگوی متیله شدن توالیهای CCGG در ساقه و ریشه درقم جو Sahara3771 (متحمل به تنش شوری) و Clipper (حساس به تنش شوری) تحت دو تیمار صفر و 100 میلی مولار NaCl استفاده شد. نمونههای برگ و ریشه جهت استخراجDNA ، 24 ساعت، سه هفته و پنج هفته پس از اعمال شوری برداشت شد. تحت تیمار شوری در بخش هوایی Sahara3771 در مقایسه با تیمار شاهد، 2/26% جایگاهها متیله و 86/15% آنها متیلزدایی شدند. در ریشه آن نیز 74/7% و 38/9% از جایگاهها به ترتیب افزایش و کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری در مقایسه با شاهد داشتند. در بخش هوایی Clipper 02/17% و 74/11% جایگاهها تحت تیمار شوری به ترتیب افزایش و کاهش سطح متیله شدن در مقایسه با تیمار شاهد داشتند. در ریشه این ژنوتیپ نیز مقادیر افزایش و کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری به ترتیب 67/10% و 5/7% بود. در مجموع تعداد جایگاههای بدون تغییر در بخش هوایی بیشتر از ریشه بود. همچنین تعداد جایگاه بدون تغییر در بخش هوایی Clipper بیشتر از Sahara3771 بود. نتایج نشان دادند که تغییرات الگوی متیله شدن میتواند یکی از فاکتورهای کلیدی دخیل در تحمل بیشتر به شوری در جو باشد.
واژه های کلیدی: جو، تنش شوری، الگوی متیله شدن، CRED-RA
* نویسنده مسئول، تلفن: 09143114335 ، پست الکترونیکی: Mohammadi@tabrizu.ac.ir
مقدمه
جو از خانوادهی Poaceae یکی از مهمترین غلات است که رتبه پنجم تولید ماده خشک در دنیا و رتبهی دوم سطح زیر کشت در ایران را دارد (4). جو به دلیل خصوصیات مورفولوژیک، فیزیولوژیک و ژنتیکی مناسب به عنوان گیاه مدل در آزمایشهای مختلف استفاده میشود (9).
شوری خاک از تنشهای مهم غیر زیستی بویژه در مناطق خشک و نیمه خشک است (27). بیش از شش درصد از کل زمینهای دنیا تحت تأثیر شوری قرار دارند. تنش اسمزی، سمیت یونی حاصل تجمع نمک و تنش ثانویه ناشی از شوری سه آسیب مهم وارده به گیاهان تحت تنش شوری هستند (26). برای تضمین عملکرد پایدار محصول و زیر کشت بردن زمینهایی که به دلایل مختلف مثل شوری خاک قابل کشت نیستند، جهت تامین غذای مورد نیاز جمعیت رو به رشد جهان لازم است ارقامی با قدرت تحمل تنشهای محیطی تولید شوند. اولین قدم برای دستیابی به چنین هدفی درک کامل ساز و کارهای پاسخ گیاهان به تنشهای غیر زیستی مانند شوری میباشد.
در نتیجه حضور نمک در غلظتهای بالا در حوزه ریشه تغییرات مورفولوژیکی، سلولی، بیوشیمیایی و مولکولی بسیاری در گیاه رخ میدهد (18). مطالعات نشان داده است این تغییرات میتواند ناشی از عوامل ژنتیکی، فراژنتیکی (Epigenetics factors) و محیطی باشد. هر تغییری که بدون تغییر در ساختار DNA منجر به تغییر در اثر ژن یا فنوتیپ شود یه تغییر فراژنتیک است (34). تغییرات فراژنتیکی میتوانند در طول زمان، در پاسخ به تنشهای زیستی و غیر زیستی (24) و بین افراد و جمعیتها متفاوت باشند (10). تغییر در بیان ژن، توانایی پاسخ سریع به محیط در حال تغییر و در نتیجه تطبیق فنوتیپ با شرایط محیطی جدید از نتایج تغییرات فراژنتیکی هستند (30).
تغییرات اپیژنتیک شامل متیلهشدن نوکلئوتیدها خصوصا سیتوزین و همچنین تغییرات هیستونی میباشد (1). متیله شدن DNA از مهمترین تغییرات فراژنتیکی است که در آن یک گروه متیل (CH3-) از مولکول S-آدنوزیل متیونین با فعالیت آنزیم S-آدنوزیل متیل ترانسفراز به نوکلئوتیدها به ویژه سیتوزین در موقعیت شماره 5 آن انتقال مییابد (8). متیله شدن سیتوزین معمولا بر روی کربن شماره 5 سیتوزینی که به دنبال آن یک گوانین قرار داشته باشد اتفاق میافتد (توالیهای (CpG). این توالیها در ناحیه تنظیمی ژنها رایجتر هستند (2). مولکول DNA علاوه بر نواحی مورد رونویسی در راهاندازها نیز متیله میشود. با متیله شدن DNA در ناحیه پروموتری ممکن است ژن به شکل غیرفعال شده درآید. بنابراین، کاهش در میزان متیله شدن اغلب منجر به افزایش در بیان ژن خواهد شد (5). اما مواردی خلاف این قاعده نیز گزارش شده است. در گیاهان بخش قابل توجهی از نوکلئوتیدهای متیله شده میتوانند بطور پایدار از والدین به نتاج منتقل شود (12). مثالهای بسیاری از اپیاللهای متیله شده با فنوتیپ متمایز وجود دارد (13و 31).
متیلزدایی به دو روش فعال و غیر فعال روی میدهد. متیلزدایی غیر فعال DNA ممکن است به دلیل محدود شدن متیله شدن جدید یا ناتوانی در حفظ ویژگیهای والدین بعد از همانندسازی DNA رخ دهد (14). متیلزدایی فعال با فعالیت گلیکوزیلازها با حذف گروه متیل از سیتوزینها اتفاق افتد (25). این امر ممکن است نقش مهمی در جلوگیری از شکلگیری متیله شدنهای شدید پایدار در ژنومهای گیاهی داشته باشد (28).
برای ارزیابی متیله شدن DNA روشهای مختلفی استفاده میشود. یکی از سادهترین روشها، CRED-RA (Coupled Restriction Enzyme Digestion and Random Amplification)، است که در آن DNA پس از تکثیر توسط آغازگرهای تصادفی، جداگانه توسط آنزیمهای HpaIIو MspI که دارای جایگاه شناسایی یکسان با حساسیت متفاوت به متیله شدن DNA هستند برش داده میشود. چند شکلی بین محصولات برشی تفاوت در الگوی متیله شدن را نشان میدهد (23). تکنیک CRED-RA به علت ساده، آسان و کم هزینه بودن نسبت به سایر روشها، برای بررسی اولیه متیلهشدنDNA مناسب است (29). در این مطالعه الگوی متیله شدن DNA در ریشه و بخش هوایی ارقام جو Sahara3771 و Clipper با حساسیت متفاوت به تنش شوری تحت تنش شوری با استفاده از روش CRED-RA مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
مواد گیاهی مورد مطالعه شامل ارقام جو Clipper و Sahara3771 بود. Clipper یک رقم تجاری استرالیایی، بهاره، دو ردیفه و حساس به شوری و Sahara3771 بومی آفریقایی شمالی با منشا الجزایر، زمستانه، شش ردیفه و متحمل به شوری است. ارقام Sahara3771 و Clipper از دانشگاه استرالیای غربی تهیه شد. به منظور بررسی تغییرات متیله شدن DNA تحت تنش شوری، ارقام Sahara3771 و Clipper به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه بلوکهای کامل تصادفی در سه تکرار با دو سطح شاهد و شوری 100 میلی مولار NaCl در گلخانه کشت شدند. پس از استقرار گیاهچهها، تنش شوری در مرحله سه برگچهای اعمال شد. بر اساس مطالعات انجام یافته این مرحله حساسترین مرحله رشدی جو به تنش شوری است (6). گلدانها در شرایط کاملا کنترل شده گلخانه تحت شرایط دمایی °C 28 در روز و °C18در شب، با فتوپریود 18ساعت روز به 6 ساعت شب و در رطوبت نسبی 70 درصد رشد داده شدند. نمونه برداری در سه مرحله 24 ساعت، سه هفته و پنج هفته پس از اعمال تنش انجام شد.
به منظور ارزیابی تغییرات متیله شدن DNA در ریشه و ساقه جو تحت تنش شوری از روش CRED-RA استفاده شد. استخراج DNA به روش لودهی و همکاران (19) انجام و کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با الکتروفورز ژل آگاروز 8/0 درصد و اسپکتروفتومتر تعیین گردید. به منظور بررسی تغییرات متیله شدن DNA، ابتدا واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای تصادفی به طول 10 نوکلئوتید انجام شد. اجزای واکنش زنجیرهای پلیمراز در جدول 2 آورده شده است.
جدول 1- ترکیبات و غلظت اجزای تشکیل دهنده محلول هوگلند
ترکیبات مورد استفاده
|
غلظت (g/l) |
Kh2Po4 |
14/0 |
KNO3 |
51/0 |
Ca(NO3)2 |
21/1 |
MgSO4.7H2O |
5/0 |
ZnSO4.7H2O |
005/0 |
H3BO3 |
007/0 |
MnCl2.2H2O |
002/0 |
CuSO4.5 H2O |
001/0 |
H2MoO4 |
0006/0 |
Fe-EDTA |
03/0 |
جدول 2- اجزای واکنش زنجیرهای پلیمراز
اجزای واکنش |
مقادیر (lµ) |
Master Mix 2X (Amplicon) |
4 |
آب دیونیزه استریل |
4 |
آغازگر RAPD |
1 |
DNA ژنومی (ng/µl25) |
2 |
MgCl2 |
2/0 |
چرخههای حرارتی شامل واسرشت سازی اولیه در دمای °C94 به مدت پنج دقیقه، 40 چرخه واسرشت سازی در دمای °C 94 به مدت یک دقیقه، اتصال آغازگرها در دمای اتصال اختصاصی آنها به مدت یک دقیقه و بسط در دمای °C 72 به مدت یک و نیم دقیقه و در نهایت یک چرخه بسط نهایی به مدت 10 دقیقه در دمای °C 72 بود. بعد از انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز، 5 میکرولیتر از محصولات تکثیری جداگانه با هر یک از آنزیمهای برشی ایزوشیزومراز HpaIIو MspI به مدت 16 ساعت در دمای °C 37 تیمار شدند. برش محصولات PCR با استفاده از آنزیمهای ایزوشیزومراز HpaIIو MspI در حجم ۱۶ میکرولیتر و با اجزای جدول 3 انجام شد.
علاوه براین، پنج میکروگرم DNA ژنومی از هر رقم و سطح تنش و در هر مرحله به طور جداگانه با یک واحد از آنزیمهای برشی ایزوشیزومرازاز HpaII و MspI به طور جداگانه به مدت 16 ساعت در °C 37 تیمار داده شدند. برش DNA ژنومی به کمک دو آنزیم ایزوشیزومرازاز HpaII و MspI در حجم 20 میکرولیتر با اجزای جدول 4 انجام شد. بعد از تایید برش DNA توسط آنزیمها با استفاده از ژل آگارز، دو میکرولیتر از محصولات برشی DNA ژنومی به عنوان الگو در واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده از همان آغازگرهای تصادفی استفاده شد (جدول 2). در این بررسی از 10 آغازگر تصادفی استفاده شد که اسامی و توالی آنها در جدول 5 ذکر شده است. دمای اتصال اختصاصی آغازگرهای مورد استفاده °C34 بود.
جدول 3- اجزای واکنش برش محصولات PCR با استفاده از آنزیمهای HpaIIو MspI
اجزای واکنش |
مقدار در هر نمونه (lµ) |
آب دیونیزه استریل |
9 |
محصولات PCR |
5 |
بافر X) Tango 10) |
1 |
هر کدام از آنزیمهای HpaII یا MspI |
1 |
جدول 4- اجزای واکنش برش DNA ژنومی با استفاده دو آنزیم HpaII و MspI
اجزای واکنش |
مقدار در هر نمونه (lµ) هر نمونه (میکرولیتر) |
آب دیونیزه استریل |
16 |
DNA ژنومی |
2 |
بافر X) Tango 10) |
2 |
هر کدام از آنزیمهای HpaIIیا MspI |
1 |
تفکیک محصولات تکثیری با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز یک درصد و آشکارسازی جایگاهها بر اساس رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید انجام شد. برای تعیین اندازه قطعات تکثیری از نشانگر وزن مولکولی با اندازه قطعات 3000 - 100 جفت باز (Fermentase, #SM0321) در سه قسمت ژل استفاده شد.
با استفاده از روش CRED-RA بر مبنای آنزیمهای ایزوشیزومرازاز HpaIIو MspI، چهار نوع الگوی نواری چند شکل علاوه بر جایگاههای تک شکل حاصل شد (جدول 6). وجود نوار در تکثیر با استفاده از DNA ژنومی و نیز DNA ژنومی برش یافته با استفاده از هر دو آنزیم برشی، نشان دهنده متیله شدن سیتوزین اول جایگاه تشخیص آنزیم در هر دو رشته است و در این حالت هیچ کدام از آنزیمها قادر به برش DNA در جایگاه برش نمیباشند (الگوی متیله شدن نوع چهارم). تکثیر نوار با استفاده از DNA ژنومی و DNA برش یافته با آنزیم MspIو عدم تکثیر با استفاده از DNA برش یافته با آنزیم HpaIIنشان دهنده الگوی متیله شدن نوع دوم و تکثیر با استفاده از DNA ژنومی و DNA برش یافته با آنزیم HpaII و عدم تکثیر با استفاده از DNA برش یافته با آنزیم MspI نشان دهنده الگوی متیله شدن نوع سوم در جایگاه تشخیص آنزیم است. تکثیر فقط با استفاده از DNA ژنومی، بیانگر آن است که یا در قطعه تکثیری جایگاه تشخیص آنزیم وجود ندارد و یا جایگاه تشخیص آنزیم متیله نشده و یا فقط سیتوزین دوم در یک رشته متیله شده است. بنابراین، هردو آنزیم جایگاه تشخیص را شناسایی و DNA را برش دادند (نوع اول). برای اطمینان از وجود و عدم وجود جایگاه تشخیص آنزیم در قطعه تکثیری با DNA ژنومی، قطعات تکثیری نیز با آنزیمهای HpaII و MspIبرش داده شدند. اگر قطعات تکثیری با آنزیمها برش داده شوند، جایگاه تشخیص وجود دارد ولی عدم برش قطعه تکثیری با آنزیمها نشانگر عدم وجود جایگاه تشخیص آنزیم در قطعه تکثیری میباشد.
جدول 5- مشخصات آغازگرهای تصادفی مورد استفاده در روش CRED-RA
نام آغازگر |
توالی آغازگر |
MT5 |
CTCACCGTCC |
MT21 |
CCCGCCGTTG |
MT25 |
CCGTCTCTTT |
428 |
GGCTGCGGTA |
454 |
GCTTACGGCA |
465 |
GGTCAGGGCT |
541 |
GCCCCTTTAC |
630 |
CACTTAACCG |
663 |
CGTATAGCCG |
698 |
CTAGACGTTG |
جدول 6- واکنش آنزیمهای HpaIIو MspIبه متیله شدن سیتوزین در جایگاه تشخیص آنزیم
نوع |
الگوی متیله شدن |
Msp I |
HpaII |
|
اول |
CCGG GGCC |
CCGG GGCC |
فعال |
فعال |
دوم |
|
CCGG GGCC |
غیرفعال |
فعال |
سوم |
|
CCGG GGCC |
فعال |
غیر فعال |
چهارم |
|
CCGG GGCC |
غیر فعال |
غیر فعال |
نتایج
محصولات برش DNA استخراج شده از برگ و ریشه ارقام Sahara3771 و Clipper تحت تیمارهای شاهد و 100 میلی مولار NaCl، توسط آنزیمهای HpaIIو MspI توسط 10 آغازگر تصادفی به طول 10 نوکلوتید در واکنش زنجیرهای پلیمراز تکثیر شدند و انواع مختلفی از تغییرات الگوی متیله شدن مشاهده شد (شکل 1). الگوی متیله شدن DNA ارقام Sahara3771 و Clipper در سه مرحله رشدی نشان دهنده افزایش میزان متیله شدن و متیلزدایی تحت تیمارهای شوری 100 میلی مولار NaCl در مقایسه با تیمار شاهد بود. متوسط تعداد جایگاههای تغییرنیافته در بخش هوایی Sahara3771 و Clipper به ترتیب 93/57 و 41/72 بود. تعداد جایگاههای تغییرنیافته در ریشه Sahara3771 86/82 % و در ریشه Clipper 95/55 % بود. جدولهای 7 و 8 تعداد جایگاههای بدون تغییر در وضعیت متیله شدن، متیله شده و متیلزدایی شده در جایگاه برش را به ترتیب در بخش هوایی و ریشه Sahara3771 و Clipper تحت تنش شوری در مقایسه با تیمار شاهد در زمانهای مختلف نمونهبرداری نشان میدهند.
Sahara3771-سه هفته |
الگوی نوع چهارم |
Clipper-4 ساعت |
الگوی نوع سوم |
الگوی نوع دوم |
الگوی نوع اول |
تنش |
شاهد |
تنش |
شاهد |
تنش |
شاهد |
Sahara3771-24 ساعت |
در بخش هوایی Sahara3771 و تحت تنش شوری در مقایسه با تیمار شاهد بهطور متوسط 2/26 % جایگاهها افزایش و 86/15 % جایگاهها کاهش سطح متیله شدن نشان دادند و در هر سه مرحله نمونه برداری تحت تنش شوری درصد جایگاههای متیله شده بیشتر از جایگاههای متیل زدایی شده بود. اما 24 ساعت پس از اعمال شوری، در مقایسه با تیمار شاهد در ریشه این رقم تعداد جایگاههای متیله شده و سه هفته بعد از آن تعداد جایگاههای متیل زدایی شده درصد بیشتری از تغییرات متیله شدنی را تشکیل میدادند. در پنج هفته پس از اعمال شوری درصد جایگاههای متیله و متیل زدایی شده مقادیر مشابهی را تشکیل میدادند. در مجموع بیشترین میزان تغییرات متیله شدنی در مقایسه با شاهد در مرحله 24ساعت پس از اعمال شوری حاصل شد. در بخش هوایی Sahara3771 بیشترین و کمترین تغییرات متیله شدن DNA در بخش هوایی Sahara3771 تحت تنش شوری در مقایسه با تیمار شاهد به ترتیب 24 ساعت و پنج هفته پس از اعمال شوری مشاهده شد.
1000 bp 800 bp 600 bp 400 bp 200 bp 100 bp |
شکل1- الگوی نواری ریشه Sahara3771 وClipper تحت دو تیمار صفر و 100 میلی مولار NaCl بر مبنای آغازگر شماره 625
در بخش هوایی Clipper تحت تنش شوری و در مقایسه با تیمار شاهد بهطور متوسط 02/17 % جایگاهها افزایش و 74/11 % آنها کاهش در سطح متیله شدن نشان دادند. همانند آنچه در Sahara3771 مشاهده شد تحت تیمار شوری تعداد جایگاههای دارای افزایش متیله شدن بیشتر از جایگاه متیل زدایی شده بود. بیشترین تغییرات متیله شدنی در بخش هوایی Clipper پنج هفته پس از اعمال شوری مشاهده شد. 24 ساعت و پنج هفته پس از اعمال شوری در بخش هوایی Clipper تعداد جایگاههای متیله شده بیشتر از تعداد جایگاههای متیل زدایی شده بود. در مرحله نمونه برداری سه هفته پس از اعمال شوری جایگاههای متیله شده و دی متیله مقادیر مشابهای داشتند. پنج هفته پس از اعمال تیمار شوری در بخش هوایی Clipper حساس به شوری در مقایسه با Sahara3771 متحمل به شوری تغییرات متیله شدنی بیشتری در مقایسه با مرحله 24 ساعت مشاهده شد.
مطالعه وضعیت متیله شدنی ریشه نشان دهنده تعداد بیشتر جایگاههای بدون تغییر در پاسخ به تنش شوری در مقایسه با بخش هوایی بود. به نظر میرسد با اینکه ریشه اولین اندام دریافت کننده تنش شوری است تغییر وضعیت متیله شدنی در پاسخ به آن عموما در بخش هوایی رخ میدهد. متوسط تعداد جایگاههای دارای افزایش و کاهش سطح متیله شدن در ریشه Sahara3771 به ترتیب 74/7 % و 38/9 % بود. در Sahara3771 متحمل به شوری 24 ساعت پس از اعمال تنش متیله شدن و سه هفته پس از تیمار متیل زدایی مقادیر بیشتری از تغییرات متیله شدنی را به خود اختصاص دادند. پنج هفته پس از اعمال شوری این دو گروه تغییرات متیله شدنی مقادیر مشابهی داشتند.
مطالعه الگوی متیله شدن در ریشه Clipper نشان داد 67/10 % جایگاهها دارای افزایش و 5/7 % آنها دارای کاهش سطح متیله شدن تحت تیمار شوری در مقایسه با شاهد بودند. در Clipper حساس به شوری 24 ساعت پس از اعمال تیمار شوری همانند Sahara3771، تعداد جایگاههای متیله شده بیشتر از تعداد جایگاههای متیله زادیی شده بود. سه و پنج هفته پس از اعمال شوری این دو گروه تغییرات در وضعیت متیله شدن مقادیر مشابهی داشتند. تحت تنش شوری درصد جایگاههای بدون تغییر الگوی متیله شدن در ریشه Sahara3771 متحمل به شوری بیشتر از بخش هوایی آن بود. درصد جایگاههای فاقد تغییر در الگوی متیله شدنی در مراحل 24 ساعت و سه هفته پس از اعمال شوری و در ریشه و بخش هوایی Clipper حساس به شوری مقادیر نزدیکی داشتند اما در مرحله پنج هفته پس از اعمال تنش تعداد جایگاههای بدون تغییر در الگوی متیله شدنی در ریشه بطور قابل توجهی بیشتر از بخش هوایی بود. در مجموع تعداد جایگاههای بدون تغییر در بخش هوایی Clipper بیشتر از Sahara3771 بود. وقوع تغییرات متیله شدنی میتواند یکی از فاکتورهای دخیل در تحمل بیشتر این رقم به شوری در مقایسه با Clipper باشد.
همچنین میزان متیلاسیون جایگاهها در بخش هوایی و ریشه در نمونههای شاهد بین زمانهای 24 ساعت، سه هفته و 5 هفته مقایسه شد. نتایج در جدول 9 نشان داده شده است. بر این اساس در مرحله 3 هفته در مقایسه با 24 ساعت تعداد جایگاههای بدون تغییر ساقه در هر دوژنوتیپ Sahara3771 و Clipper بیشتر از ریشه بود. در مقایسه مرحله 3 هفته و 5 هفته با 24 ساعت در هر دو ژنوتیپ تعداد جایگاههای دارای افزایش سطح متیلاسیون در ریشه بیشتر از ساقه بود. تعداد جایگاه دارای افزایش سطح متیلاسیون در مرحله 3 هفته بیشتر از 5 هفته بود.
بحث و نتیجه گیری
تنشهای محیطی میتوانند موجب تغییر در الگوی متیله شدن DNA گیاهان شوند. گونههای فعال اکسیژن که در نتیجه تنش شوری تولید میشوند، اثرهای مخربی بر روی مولکولهایی نظیر پروتئینها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئوئیک دارند (21).
جدول 9- تغییرات الگوی متیله شدن بخش هوایی و ریشه Sahara3771 و Clipper در نمونههای شاهد بین زمانهای 3 هفته در مقایسه با 24 ساعت، 5 هفته در مقایسه با 24 ساعت و 3 هفته در مقایسه با 5 هفته
3هفته در مقایسه با 5 هفته |
5 هفته در مقایسه با 24 ساعت |
3 هفته در مقایسه با 24 ساعت |
|
|
||||||
کاهش سطح متیله شدن |
افزایش سطح متیله شدن |
بدون تغییر |
کاهش سطح متیله شدن |
افزایش سطح متیله شدن |
بدون تغییر |
کاهش سطح متیله شدن |
افزایش سطح متیله شدن |
بدون تغییر |
|
|
29 |
21 |
93 |
22 |
32 |
91 |
13 |
26 |
106 |
Sahara3771 |
ساقه |
21 |
22 |
102 |
30 |
27 |
88 |
13 |
9 |
123 |
Clipper |
|
36 |
28 |
76 |
22 |
66 |
52 |
8 |
51 |
81 |
Sahara3771 |
ریشه |
16 |
29 |
94 |
15 |
62 |
60 |
15 |
102 |
72 |
Clipper |
خسارت ناشی از تنش اکسیداتیو بر DNA میتواند الگوی متیله شدن آن را تحت تاثیر قرار دهد و گزارشات متعددی از آسیب DNA در نتیجه شوری وجود دارد. برای مثال ROS های حاصل از تنش مستقیما بر الگوی متیله شدن تاثیر میگذارند (16). تغییرات متیله شدن DNA تحت تنش شوری شامل کاهش و افزایش سطح متیله شدن ژنها است. اما در مجموع تعداد جایگاههای متیله شده ژنوم تحت این تنش بیشتر از جایگاههای متیل زدایی شده است (7). متیله شدن نوکلئوتیدهای سیتوزین اصولا با خاموشی ژن همراه است (22). اما مواردی مبنی بر نقض این قاعده موجود هستند. برای مثال بیان ژن FLC که یکی از ژنهای عامل بازدارندگی گلدهی میباشد با کاهش سطح متیله شدن آن بازداشته شده و منجر به گلدهی زودهنگام میشود. این امر در ارتباط با کاهش سطح متیله شدن هیستونهای H3 و کاهش سطح متیله و استیله شدن هیستونهای H4 و نه DNA است (11). میتوان نتیجه گرفت همیشه متیله شدن به معنی خاموشی ژن نیست.
گیاهان سطوح نسبتا بالایی از 5-متیل سیتوزین دارند (8). این مقدار از 25-6 درصد کل سیتوزینها را بسته به گونه دربرمیگیرد (29). تکنیک CRED-RA برای بررسی تغییرات الگوی متیله شدن در توالیهای CCGG مورد استفاده قرار میگیرد. در هر سه مرحله نمونه برداری تعداد جایگاههای بدون تغییر در ریشه Sahara3771 بیشتر از بخش هوایی بود. در Clipper هم در هر سه مرحله نمونه برداری تعداد جایگاههای بدون تغییر در ریشه بیشتر از بخش هوایی بود. اما در Clipper حساس به شوری اختلاف تعداد جایگاههای بدون تغییر بین ریشه و ساقه کمتر از Sahara3771 بود. همچنین نتایج حاصل از این مطالعه نشان دهنده تعداد بیشتر جایگاههای متیله و متیل زدایی شده بخش هوایی Sahara3771 در پاسخ به تنش شوری در مقایسه با Clipper حساس به شوری بود. به نظر میرسد یکی از فاکتورهای دخیل در تحمل بیشتر Sahara3771 به شوری توانایی پاسخ به تنش در نتیجه تغییر الگوی متیله شدن است. سازگاری سریع به شوری حاصل تنظیم بیان ژن به واسطه متیله شدن سیتوزین است (20). ژائو و همکاران (35) تغییرات الگوی متیله شدن سیتوزین را در پنبه تحت تنش شوری با روش MSAP بررسی کردند. بر این اساس تعداد جایگاههای سیتوزین متیله و متیل زدایی شده در لاینهای متحمل بیشتر از لاینهای حساس بود. زونگ و همکاران (36) نیز نشان دادند که در شرایط شوری سطح متیله شدن توالیهای CCGG در رقم متحمل گندم بیشتر از رقم حساس است.
با وجود اختلاف قابل توجه تعداد جایگاههای دارای تغییر الگوی متیله شدن در بخش هوایی بین Sahara3771 و Clipper، مطالعه حاضر نشان دهنده نبود تفاوت چشمگیر بین دو ژنوتیپ از نظر تعداد جایگاه دارای تغییر در الگوی متیله شدن در ریشه بود. با توجه به نتایج بالا و تحمل بیشتر Sahara3771 به شوری احتمالا نقش ساقه در تحمل شوری بیشتر از ریشه است. بنابراین تمرکز بر صفات و ژنهای ریشه در بهبود تحمل به شوری نتایج بهتری به دنبال خواهد داشت. مقایسه الگوی نواری MSAP در ریشه و بخش هوایی چهار ژنوتیپ برنج تحت شرایط عادی و تنش شوری نشان دهنده درصد بیشتر جایگاههای متیله و متیلزدایی شده تحت تنش شوری در ساقه در مقایسه ریشه بود (15).
تعداد جایگاههای متیله شده تحت تنش شوری در ساقه Sahara3771 بیشتر از ریشه بود. در هر دو اندام حداکثر تعداد جایگاه متیله شده در مقایسه با شاهد 24 ساعت پس از اعمال شوری مشاهده شد. اما در Clipper حساس به شوری تعداد جایگاههای متیله شده تحت تنش در ریشه بیشتر از ساقه بود. بیشترین تعداد جایگاههای متیله شده در ریشه و ساقه Clipper به ترتیب 24 ساعت و پنج هفته پس از اعمال شوری مشاهده شد. در مطالعه وانگ و همکاران (33) متیله شدن سیتوزینها با سازگاری به خشکی پیوستگی نشان داد. خشکی همچنین منجر به متیله شدن شدید سیتوزین (CCGG) در ژنوم نخود شد (17). مطالعه ارتورک و همکاران (3) بر روی تغییرات متیله شدن DNA در ذرت تحت غلظتهای صفر، پنج، 10، 20 و 40 میلیمولار بٌر با استفاده از روش CRED-R نشان دهنده افزایش میزان متیله شدن DNA تحت تیمارهای بٌر در مقایسه با شاهد بود.
شواهد زیادی نشان دهنده نقش متیلاسیون DNA در تنظیم بیان ژنها در طول رشد و نمو گیاهان است (4، 24، 39). همچنین بسیاری از مطالعات نشان دادهاند DNA گیاهان در بافتهای بزرگسال در مقایسه با بافتهای جوان در سطوح بالاتری متیله شده است (10، 15، 28، 44، 45، 48). اما برخی گزارشها حاکی از سطوح پایینتر متیلاسیون را در گیاهان بزرگسال در مقایسه با گیاهان جوان بوده است (1، 13، 31، 32، 34). گو و همکاران (2011) و یوآن و همکاران (2014) گزارش کردند که با افزایش سن گیاه مجموع DNA متیله شده گیاهان بامبو بطور قابل توجهی افزایش پیدا کرد. مجموع شواهد بیان کننده این مطلب است که وضعیت متیلاسیون DNA ژنومی در طول افزایش سن گیاه و پیری متفاوت باشد که منجر به تغییرات در بیان ژنهای مرتبط با سن گیاه شود. سطح و الگوی متیلاسیون سیتوزین توسط دو سیستم متیلاسیون و متیل زدایی تعیین میشوند.
سپاسگزاری
از قطب علمی اصلاح مولکولی غلات دانشگاه تبریز برای فراهم کردن هزینه و امکانات آزمایشگاهی این تحقیق قدردانی میشود.