نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه تبریز

چکیده

مامیران (Chelidonium majus L.) گیاهی دارویی از خانواده خشخاش و غنی از آلکالوئیدهای ایزوکوینولین است. از آنجایی که سنتز شیمیایی این آلکالوئیدها مقدور نیست؛ صنعت داروسازی به مقادیر زیادی گیاه برای استخراج این ترکیبات نیازمند است. هدف این پژوهش بهینه‌سازی یک روش تکرارپذیر برای باززایی مامیران بواسطه کالوس‌زایی بود. بدین منظور، بذور مامیران بعد از ضدعفونی سطحی برای جوانه‌زنی در محیط 1⁄(2 MS) کشت شدند. ریزنمونه‌های کوتیلدون و هیپوکوتیل از گیاهچه‌های 20 روزه و ریزنمونه‌های برگ از گیاهان 3 ماهه تهیه و برای کالوس‌زایی در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) تکمیل شده با تنظیم کننده‌های رشد گیاهی مختلف کشت شدند. بیشترین وزن تر کالوس از ریزنمونه‌های مستقر در محیط MS دارای 1 میلی گرم بر لیتر2و4- دی کلرو فنوکسی استیک اسید (2,4-D) در ترکیب با 1 یا 5/0 میلی گرم بر لیتر از یکی از سیتوکنین‌های بنزیل آمینو پورین (BAP) یا تیدیازورون (TDZ) بدست آمد. در چند تیمار بعد از بازکشت‌های مکرر اندام‌زایی نیز مشاهده شد. باززایی دو ماه پس از بازکشت کالوس‌های حاصل از ریزنمونه‌های کوتیلدون در محیط کشت فاقد تنظیم کننده های رشد گیاهی با فراوانی 11/11 درصد و یک شاخساره به ازای هر ریزنمونه مشاهده شد. شاخساره‌ها در محیط MS فاقد تنظیم کننده‌های رشد گیاهی با فراوانی 78/77 درصد و 36/2 ریشه به ازای هر شاخساره ریشه‌دار شدند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

In vitro regeneration of Iranian celandine (Chelidonium majus L.)

نویسندگان [English]

  • Arezoo Aziz Khajeh
  • Ebrahim Dorani
  • Saied Aharizad

Tabriz university

چکیده [English]

Celandine (Chelidonium majus L.) is a medicinal plant belonging to the Papaveraceae and rich in isoquinolin alkaloids. Chemical synthesis of these alkaloids is not possible. So, the pharmaceutical industry requires large quantities of plants to extract these compounds. The purpose of this study was optimization of a repeatable method for regeneration of celandine by callus induction. Celandine seeds after surface sterilizing were placed on 1/2MS medium for germination. Cotyledon and hypocotyl explants were prepared from 20-day-old sterile seedlings and leaf explants from 3-month-old plants. Explants were put on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with different plant growth regulators (PGRs) to callus induction. The highest fresh weight was for calli in mediums containing 1 mg/l 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) in combination with 0.5 or 1 mg/l Amino Purine (BAP) or Tidiazuron (TDZ). Organogenesis was observed in few treatments after repetitive subculture. Plant regeneration only happened in PGRs free MS medium, from cotyledon calli after 2 months with frequency of 11.11 % by one shoot per explant. Shoots were rooted in PGRs free MS medium with frequency of 77.78 % by 2.36 roots per explant.

کلیدواژه‌ها [English]

  • callus induction
  • in vitro regeneration
  • tissue culture
  • Celandine

باز زایی درون شیشه­ایمامیران ایرانی (Chelidonium majus L.)

آرزوعزیزخواجه*، ابراهیم دورانی، سعید اهری­زاد

ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه به­نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی

تاریخ دریافت: 29/1/97                تاریخ پذیرش: 15/8/97

چکیده

مامیران (Chelidonium majus L.) گیاهی دارویی از خانواده خشخاش و غنی از آلکالوئیدهای ایزوکوینولین است. از آنجایی که سنتز شیمیایی این آلکالوئیدها مقدور نیست، صنعت داروسازی به مقادیر زیادی گیاه برای استخراج این ترکیبات نیازمند است. هدف این پژوهش بهینه­سازی یک روش تکرارپذیر برای باز زایی مامیران بواسطه کالوس­زایی بود. بدین منظور، بذور مامیران بعد از ضدعفونی سطحی برای جوانه­زنی در محیط 1/2 MS کشت شدند. ریز نمونه‌های کوتیلدون و هیپوکوتیل از گیاهچه­های 20 روزه و ریز نمونه‌های برگ از گیاهان 3 ماهه تهیه و برای کالوس­زایی در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) تکمیل شده با تنظیم کننده­های رشد گیاهی مختلف کشت شدند. بیشترین وزن‌تر کالوس از ریز نمونه‌های مستقر در محیط MS دارای 1 میلی‌گرم بر لیتر2و4- دی کلرو فنوکسی استیک اسید (2,4-D) در ترکیب با 1 یا 5/0 میلی‌گرم بر لیتر از یکی از سیتوکنین­های بنزیل آمینو پورین (BAP) یا تیدیازورون (TDZ) به دست آمد. در چند تیمار بعد از باز کشت­های مکرر اندام­زایی نیز مشاهده شد. باز زایی دو ماه پس از باز کشت کالوس­های حاصل از ریز نمونه‌های کوتیلدون در محیط کشت فاقد تنظیم کننده‌های رشد گیاهی با فراوانی 11/11 درصد و یک شاخساره به ازای هر ریز نمونه مشاهده شد. شاخساره­ها در محیط MS فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی با فراوانی 78/77 درصد و 36/2 ریشه به ازای هر شاخساره ریشه­دار شدند.

واژه­های کلیدی: القای کالوس، باززایی درون شیشه­ای، کشت بافت، مامیران

* نویسنده مسئول، تلفن: 09148325960، پست الکترونیکی: a.azizkhajeh@gmail.com

مقدمه

 

مامیران بانام علمی Chelidonium majus L. یک گیاه دارویی باستانی است که از دیرباز بدلیل آلکالوئیدهای شیمیایی-دارویی موجود در آن مورد استفاده قرارگرفته است (21). این گیاه حاوی آلکالوئیدهای ایزوکوینولین (از قبیل: سنگوینارین، چلیدونین، چلریترین، بربرین، پروتوپین و کوپتیسین)، فلاوونوئیدها و اسیدهای فنولیک می­باشد (2). عصاره خام مامیران و ترکیبات خالص‌سازی شده از آن طیف وسیعی از فعالیت­های بیولوژیکی از قبیل خواص ضدالتهابی، آنتی باکتریایی، ضد توموری و غیره را نشان می­دهند (4).

سنتز شیمیایی ترکیبات دارای فعالیت بیولوژیکی بدلیل ساختار پیچیده و هزینه­های بالا دشوار است. در­نتیجه صنعت داروسازی برای استخراج ترکیبات باارزش دارویی به مقادیر بالایی از گیاهان دارویی نیازمند است (15). گیاهان دارویی کشت شده در مزرعه نیز مستعد انواع آلودگی­های قارچی، باکتریایی، فلزات سنگین، آفت­کش­ها و غیره هستند (22). از طرف دیگر اکوسیستم­های طبیعی به­سرعت رو به فرسایش بوده و زیستگاه­های طبیعی برخی گیاهان از بین رفته و آن­ها در معرض انقراض هستند. همچنین تکثیر و حفظ بقای گیاهان از طریق روش­های مرسوم مثل تکثیر رویشی یا بذر دارای محدودیت­هایی ازجمله سرعت آهسته تکثیر، فاکتورهای آب و هوایی و خاکی، دوره کمون، کم بودن میزان بذر و درصد پایین جوانه­زنی است و برخی مواقع کلون­های بدست آمده از تکثیر بوسیله بذر یکنواخت نیستند (17). در جهت حل این مشکلات، کشت بافت گیاهی در مقیاس بزرگ یک جایگزین مناسب برای روش­های سنتی کشت و زرع است (13). تکنیک­های کشت بافت گیاهی بطور فزاینده­ای برای ریزازدیادی، نگهداری ژرم­پلاسم، بهبود ژنتیکی گیاهان دارویی و تولید متابولیت­های ثانویه بکار می­روند (6). تولید درون شیشه­ای متابولیت­های ثانویه می­تواند مطمئن­تر، آسان­تر و قابل پیش بینی­تربوده و خالص‌سازی مواد فیتوشیمیایی سریع­تر و مؤثرتر باشد (7). اندام­زایی بواسطه القای کالوس و جنین­زایی سوماتیکی دو روش مهم در ریزازدیادی گیاهان هستند (12). القای کالوس و مورفوژنز در شرایط درون شیشه­ای بطور قابل‌توجهی بوسیله عواملی ازجمله نوع ریز نمونه، مرحله فیزیولوژیکی گیاه مادر، غلظت و ترکیب تنظیم کننده­های رشد گیاهی تحت تأثیر قرار می­گیرند (16).

چندین پژوهش در زمینه کشت بافت مامیران انجام شده است. تخمک­های نابالغ مامیراندر محیط کشت MS حاوی 52/4 میکرومولار 2,4-D، با فراوانی 40 درصد کالوس جنین­زا تولید کردند. سوسپانسیون سلولی نیز از کشت این کالوس­ها در محیط کشت MS مایع محتوی 52/4 میکرومولار 2,4-D بدست آمد. توده­های سلولی حاصل از کشت سوسپانسیون سلولی، جنین­های سوماتیکی تولید کردند که در نهایت این جنین­ها تبدیل به گیاهچه شدند (9). در پژوهشی دیگر جنین­زایی سوماتیکی در محیط کشت فاقد تنظیم کننده­های رشد و یا محیط کشت­های حاوی کاینتین (Kin) از ریز نمونه‌های اپیکوتیل مامیران و بدون کالوس­زایی مشاهده شده است (20). در آزمایشات ونتو(19) بیشترین مقدارکالوس از ریز نمونه‌های ساقه مامیران در محیط کشت MS حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر ایندول استیک اسید(IAA)  و 5/0 میلی‌گرم بر لیترKin  بدست آمده است. برای ریزازدیادی کشت ریز نمونه‌های ساقه در محیط کشت MS حاوی یک میلی‌گرم در لیتر BAP در ترکیب با 5/0 میلی‌گرم بر لیتر2,4-D ، و برای ریشه‌زایی محیط MS فاقد تنظیم‌کننده های رشد بهترین نتیجه را داشته­اند. در پژوهشی که اتگونپورو و همکارانش نتیجه گرفتند که نسبت برابر اکسین و سیتوکنین برای کالوس­زایی در مامیران مناسب است. برای تهیه سوسپانسیون سلولی نیز از کشت کالوس­های قدیمی، در محیط کشتMS  مایع استفاده کردند (10). هاشمی و نقوی گزارش کردند که برای القای کالوس در مامیران با استفاده از ریز نمونه‌های ساقه، IAA بهتر از 2,4-D و نفتالین استیک اسید(NAA)  می­باشد و بیشترین درصد القای کالوس در محیط کشت B5 حاوی 1 یا 2 میلی‌گرم بر لیتر IAA و 1/0 یا 2/0 میلی‌گرم بر لیتر BAP بدست آمده است (5). در پژوهش اسفندیار و همکاران (1) بیشترین درصد کالوس­زایی از ریز نمونه ساقه مامیران در محیط کشت­های  MSدارای 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر بنزیل آدنین (BA) به میزان 44/69 درصد و 2 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D به همراه 5/1 میلی‌گرم بر لیتر BA به میزان 88/63 درصد گزارش شد. بیشترین وزن‌تر نیز از کالوس­های ساقه تشکیل شده در محیط حاوی 2 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D بدست آمد. باز زایی نیز در محیط تکمیل شده با 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 5/0 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D بصورت تشکیل برگ مشاهده شد.

در این پژوهش سعی شده است رفتار ریز نمونه‌های هیپوکوتیل، کوتیلدون و برگ مامیران در محیط کشت­های تکمیل شده با تنظیم کننده­های رشد گیاهی مختلف بررسی گردد. هدف دستیابی به یک روش تکرارپذیر برای باز زایی مامیران بواسطه کالوس­زایی است.

مواد و روشها

بذور مامیران از مرکز ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شدند. بذور بطور سطحی با هیپوکلریت سدیم 6/1 درصد به مدت 15 دقیقه ضدعفونی شدند. سپس سه مرتبه و هر بار به مدت سه دقیقه با آب مقطر استریل آبکشی شدند. تقریباً 15 بذر در 35 میلی‌لیتر محیط 1/2 MSدر پتری دیش­های 100 × 15 میلی‌متر کشت شدند. محیط کشت پایه شامل نمک­های MS، ویتامین­های B5به همراه 3 درصد ساکارز و 6/0 درصد آگار بود و pH آن قبل از افزودن آگار روی 7/5 تنظیم شده بود. بمنظور استریل شدن، محیط کشت به مدت 15 دقیقه تحت فشار 2/1 کیلوگرم بر سانتی‌متر مکعب و دمای 121 درجه سانتی‌گراد اتوکلاو شده بود. بذور در اتاق رشد با شدت نور کم  (2 µmol. m-2s-1)و دمای 2 ±25 درجه سانتی‌گراد جوانه زدند. ریز نمونه‌های هیپوکوتیل (بطول تقریبی 1 سانتی‌متر) و کوتیلدون (با ابعاد تقریبی 5/0 ×5/0 سانتی‌متر) از گیاهچه­های 20 روزه و ریز نمونه‌های برگ (با ابعاد تقریبی 5/0 ×5/0 سانتی‌متر) از گیاهان سه ماهه تهیه و در محیط کشت MS تکمیل شده با ترکیب و غلظت­های متفاوتی از تنظیم کننده­های رشد گیاهی (جدول 1) قرار داده شدند. برای هر تیمار سه تکرار (هر تکرار حاوی شش ریز نمونه) در نظر گرفته شد. کشت­ها پس از 45 روز باز کشت شدند و درصد کالوس­زایی، وزن‌تر کالوس­ها و درصد اندام­زایی (در محیط القای کالوس) بعد از سه ماه محاسبه شد.

 

جدول 1- تنظیم کننده­های رشد گیاهی بکار رفته در محیط کالوس­زایی و مقایسه میانگین درصد کالوس­زایی و وزن‌تر کالوس­ها (داده­ها نشان‌دهنده میانگین±انحراف معیار هستند)

ردیف

تنظیم کننده­های رشد گیاهی

درصد کالوس­زایی

وزن‌تر کالوس برحسب گرم

برگ

هیپوکوتیل

کوتیلدون

1

0.5 mg/l IAA+ 0.5 mg/l BAP

 c43/14±78/77

de 007/0±052/0

d002/0±010/0

d006/0±035/0

2

1 mg/l IAA+ 0.5 mg/l BAP

 a55/5±15/98

cd 025/0±078/0

c005/0±019/0

c016/0±065/0

3

1 mg/l IAA+ 1 mg/l BAP

b78/8±74/90

c 009/0±106/0

c009/0±025/0

cd008/0±042/0

4

0.5 mg/l IAA+ 0.5 mg/l TDZ

ab35/7±30/96

e 012/0±041/0

c003/0±019/0

d003/0±036/0

5

1 mg/l IAA+ 0.5 mg/l TDZ

ab 78/11±44/94

f 004/0±023/0

c007/0±024/0

c005/0±063/0

6

1 mg/l IAA+ 1 mg/l TDZ

ab 33/8±44/94

cd 015/0±065/0

c006/0±017/0

cd014/0±048/0

7

0.5 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l BAP

ab 35/7±30/96

b 028/0±194/0

ab 016/0±082/0

b018/0±145/0

8

1 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l BAP

a 0±100

ab 071/0±316/0

ab026/0±109/0

ab071/0±236/0

9

1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BAP

a 0±100

ab 043/0±312/0

ab009/0±124/0

a060/0±281/0

10

0.5 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l TDZ

a 0±100

b 064/0±236/0

b013/0±075/0

b026/0±151/0

11

1 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l TDZ

a 0±100

a049/0±440/0

ab014/0±079/0

ab008/0±192/0

12

1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l TDZ

a 0±100

a137/0±463/0

a013/0±133/0

a040/0±265/0

13

1 mg/l 2,4-D

0

0

0

0

14

1 mg/l BAP

0

0

0

0

15

1 mg/l TDZ

0

0

0

0

 

 

برای باز زایی، کالوس­های موفق به محیط کشت­های باز زایی که با ترکیب متفاوتی از تنظیم کننده­های رشد گیاهی تکمیل شده بودند (جدول 2) و محیط کشت فاقد تنظیم کننده­های رشد انتقال داده شدند.

شاخساره­های باز زا شده برای ریشه­زایی به محیط فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی و محیط MS تکمیل شده با 2 میلی‌گرم بر لیتر از یک اکسین شامل: IAA، IBA و NAA انتقال داده شدند. تمامی کشت­ها در مراحل کالوس­زایی، باز زایی و ریشه­زایی در اتاق رشد با دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد و شدت نور کم µmol.m-2s-1 2 نگهداری شدند.

 

جدول 2- تنظیم کننده­های رشد گیاهی مورد استفاده در محیط باززایی

شماره ترکیب

مقدار تنظیم کننده­های رشد برحسب میلی گرم بر لیتر

BAP

TDZ

2,4-D

1

2/0

0

0

2

2

0

0

3

2

0

5/0

4

0

2/0

0

5

0

2

0

6

0

2

5/0

7

2

2

0

 

 

تجزیه داده­ها با استفاده از نرم‌افزار MSTAT-C در قالب آزمایش فاکتوریل با سه تکرار بر پایه طرح کاملاً تصادفی و مقایسه میانگین­ها به روش دانکن انجام شد.

نتایج و بحث

ریز نمونه‌های در محیط کشت تکمیل شده با یک اکسین یا یک سیتوکنین، شامل محیط کشت­های حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D، BAP یاTDZ، خشک شدند و هیچ تقسیم سلولی در آن­ها دیده نشد.القای کالوس در محیط کشت­هایی مشاهده شد که حاوی اکسین و سیتوکنین بودند.

نتایج تجزیه واریانس نشان داد که تنظیم کننده­های رشد گیاهی درصد کالوس­زایی را تحت تأثیر قرار داده‌اند. همچنین وزن‌تر کالوس­ها نیز تحت تأثیر نوع ریز نمونه، تنظیم‌کننده رشد گیاهی و اثر متقابل ریز نمونه×تنظیم‌کننده رشد گیاهی بوده است. مقایسه میانگین برای درصد کالوس­زایی نشان داد که به‌جز محیط کشت­های حاوی 5/0 میلی‌گرم بر لیتر IAAبه‌اضافه 5/0 یا 1 میلی‌گرم بر لیتر BAP، سایر محیط کشت­ها عملکرد مشابهی دارند (جدول 1).باتوجه به معنی­دار بودن اثر متقابل ریز نمونه×تنظیم‌کننده رشد گیاهی، مقایسه میانگین برای صفت وزن‌تر کالوس برای تنظیم کننده­های رشد گیاهی در هر ریز نمونه بصورت جداگانه انجام شد (جدول 1). همه ریز نمونه‌ها در محیط کشت­های تکمیل شده با 1 میلی‌گرم بر لیتر2,4-Dدر ترکیب با 1 یا 5/0 میلی‌گرم بر لیتر از یکی از سیتوکنین­های BAP یا TDZ عملکرد مشابهی داشتند.همه کالوس­ها سفت و متراکم بودند و رنگشان در ابتدا زرد روشن بود (شکل a1). اما بعد از بازکشت در محیط کشت مشابه رنگشان تغییر کرد و به رنگ قهوه­ای درآمد (شکل b1). کالوس­های قهوه­ای به مدت 6 ماه در محیط کالوس­زایی نگهداری شدند. پس از طی این مدت در محیط کشت­های حاوی 2,4-D و TDZ نقاط سبزرنگی بر روی کالوس­های قهوه­ای ظاهر شدند ولی اندام­زایی رخ نداد (شکل c1). رنگ محیط کشت نیز بدلیل ترشح متابولیت­های ثانویه توسط کالوس­ها به محیط به رنگ نارنجی تغییر پیدا کرد.

پس از بازکشت کالوس­ها، در چند تیمار اندام‌زایی رخ داد (جدول 3). بیشترین درصد اندام­زایی (2/33 درصد) در ریز نمونه‌های برگ کشت شده در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر IAAبه‌اضافه 5/0 میلی‌گرم بر لیترBAPمشاهده شد و به ازای هر ریز نمونه 2 شاخساره تشکیل شد (شکل d1). این شاخساره­ها از کالوس­ها جدا شدند و برای رشد بیشتر به محیط کشت  MSحاوی 2/0 میلی‌گرم بر لیتر BAPانتقال داده شدند.

 

 

جدول 3- اثر تنظیم کننده­های رشد گیاهی و ریز نمونه‌ها بر میزان اندام­زایی در محیط­های القای کالوس ( RP: درصد اندام­زایی(%) و SH/E: تعداد شاخساره تشکیل شده به ازای هر ریز نمونه)

ردیف

ترکیب تنظیم کننده­های رشد گیاهی

ریز نمونه

برگ

لپه

زیر لپه

RP

SH/E

RP

SH/E

RP

SH/E

1

1 mg/l IAA + 0.5 mg/l BAP

2/33

2

0

0

0

0

2

1 mg/l IAA + 1 mg/l BAP

5/5

2

0

0

0

0

3

0.5 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l BAP

0

0

6/16

33/1

5/5

1

4

1 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l BAP

06/11

2

0

0

0

0

5

1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l BAP

0

0

5/5

1

0

0

6

0.5 mg/l 2,4-D + 0.5 mg/l TDZ

0

0

0

0

5/5

1

     

شکل 1- القای کالوس در مامیران: a: تشکیل کالوس­هایی به رنگ زرد روشن در مراحل اولیه القا، b: قهوه­ای شدن کالوس­ها پس از بازکشت در محیط مشابه، c: ظهور نقاط سبزرنگ بر روی کالوس­های قهوه­ای تشکیل شده در محیط کشت حاوی 1 میلی گرم بر لیتر 2,4-D و 5/0 میلی گرم بر لیتر TDZ، d: اندام­زایی در محیط کشت القای کالوس (محیط تکمیل شده با 1 میلی گرم بر لیتر IAA و 5/0 میلی گرم بر لیتر BAP)

 

کلیه کالوس­های تشکیل شده در محیط کشت­های تکمیل شده با 2,4-D به‌اضافه یکی از سیتوکنین­هایBAP یاTDZبه محیط کشت­های باززایی انتقال داده شدند. رنگ این کالوس­ها تیره­تر شد و تقسیم سلولی در آن­ها ادامه پیدا کرد. در ریز نمونه‌های کوتیلدون و هیپوکوتیل نقاط سبزرنگی بر روی کالوس­های قهوه­ای پدید آمد. باززایی فقط در محیط کشت عاری از تنظیم کننده­های رشد گیاهی از کالوس­های مشتق از ریز نمونه‌های کوتیلدون که در محیط کالوس زایی حاوی 1 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D به‌اضافه 5/0 میلی‌گرم بر لیتر BAPتشکیل شده بودند، با فراوانی 11/11 درصد و تشکیل یک شاخساره به ازای هر ریز نمونه، دو ماه بعد از انتقال مشاهده شد (شکل a2 و b2).

 

شکل 2- باززایی بواسطه کالوس­زایی در محیط کشت MS فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی

تشکیل ریشه با فراوانی 78/77 درصد و 36/2 ریشه به ازای هر شاخساره در محیط کشت فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی 10 روز پس از انتقال شاخساره­ها به محیط ریشه­زایی مشاهده شد (شکل a3). در محیط­های ریشه­زایی تکمیل شده با تنظیم کننده­های رشد گیاهی، ریشه­های نابجا از قسمت­های بالایی شاخساره به وجود آمدند (شکل b3). تعداد این ریشه­های نابجا خیلی زیاد و شمارش آن­ها غیرممکن بود.

 

 

شکل 3- ریشه­زایی درون شیشه­ای درمامیران: a: ریشه­زایی در محیط کشت MS فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی، b: ریشه­های نابجا در محیط کشت MS تکمیل شده با 2 میلی گرم بر لیتر NAA

 

کیم و همکاران (9) گزارش کردند که تخمک­های نابالغ C. majus در محیط کشت MS تکمیل شده با 2,4-Dکالوس جنین­زا تشکیل می­دهند. در آزمایشات اسفندیار و همکاران نیز بیشترین وزن کالوس از ریزنمونه­های ساقهمامیران در محیط کشت MSحاوی 2 میلی گرم بر لیتر 2,4-Dگزارش شد (1). طبق مطالعات افزودن TDZ به محیط کشت به‌عنوان تنها تنظیم‌کننده رشد گیاهی منجر به تولید کالوس­هایی با توانایی باززایی از ریزنمونه­های برگ Echinacea purpurea L. (8)، و اندام­زایی غیرمستقیم از ریزنمونه­های گره Asparagus racemosus (18) شده است. همچنین BAPاندام­زایی غیرمستقیم از ریزنمونه­های برگ Curculigo orchioides را سبب شده است (3). اما در این پژوهش ریز نمونه‌ها در پاسخ به محیط کشت­هایی که با 2,4-D، TDZیا BAP تکمیل شده بودند، خشک شدند. تکثیر کالوس از بافت­های بیشتر گیاهان دولپه معمولاً به حضور اکسین و سیتوکنین در محیط رشد نیاز دارد. عموماً برای القای کالوس غلظت برابر اکسین و سیتوکنین بیشتر از سایر غلظت­ها بکار می­رود (11). اتگونپورو و همکاران (10) و ونتو (19) گزارش کردند که غلظت برابر اکسین و سیتوکنین برای القای کالوس در مامیران بهتر است. اما نتایج پژوهش حاضر نشان داد که غلظت این دو تنظیم کننده رشد گیاهی می­تواند برابر باشد و یا غلظت اکسین در محیط کشت بیشتر باشد. هاشمی و نقوی (5) گزارش کردند که در میان اکسین­ها، برای کالوس­زایی از ریزنمونه­های ساقه مامیران، IAA مؤثرتر از2,4-D و NAA است. ولی نتایج پژوهش حاضر نشان داد که برای کالوس­زایی در مامیران با استفاده از ریزنمونه­های کوتیلدون، هیپوکوتیل و برگ، 2,4-Dموثرتراز IAA است. طبق نتایج بدست آمده، برگ‌ریز نمونه موفقی برای کالوس­زایی در مامیران است. در تقابل، ونتو (19) گزارش کرد که برگ‌ریز نمونه خوبی برای القای کالوس درمامیران نیست و واکنش ریزنمونه­های برگ فقط نکروزه شدن است.

اندام­زایی در مامیران از ریزنمونه­های ساقه در محیط کشتMS تکمیل شده با 1 میلی گرم بر لیتر BAP به‌اضافه 5/0 میلی گرم بر لیتر 2,4-Dو تولید 5 شاخساره به ازای هر ریز نمونه گزارش‌شده است (19). اما در این مطالعه اندام­زایی بصورت غیرمستقیم رخ داد که این موضوع می­تواند به نوع ریز نمونه، تنظیم کننده­های رشد گیاهی و اکوتیپ مورد استفاده در مطالعه که متعلق به منطقه گیلان بود، مربوط باشد.

در میان محیط کشت­هایی که برای باز زایی مورد آزمایش قرارگرفتند، باز زایی فقط در محیط کشت فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی مشاهده شد که این نتیجه با برخی پژوهش­ها مطابقت دارد. کیم و همکاران (9) باز زایی مامیران از طریق جنین­زایی سوماتیکی در محیط کشت MS فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی با استفاده از سلول­های منفرد حاصل از سوسپانسیون سلولی را گزارش کرده­اند. سرخیل و همکاران (14) نیز گزارش کرده­اند که محیط کشت فاقد تنظیم کننده­های رشد، مناسب­ترین محیط برای باز زایی رازیانه (Foeniculum vulgare Mill.) بواسطه کالوس­زایی است. ولی اسفندیار و همکاران محیط پایه MS حاوی 2 میلی گرم بر لیتر BAP و 5/0 میلی گرم بر لیتر 2,4-D را به‌عنوان بهترین محیط باززاییمامیران معرفی کردند (1).

نتیجه‌گیری کلی

در این پژوهش در مرحله کالوس­زایی درصد کالوس­زایی، وزن‌تر کالوس­ها و درصد اندام­زایی کالوس­ها مورد بررسی و محاسبه قرارگرفت. ریز نمونه­های کوتیلدون، هیپوکوتیل و برگ در 15 نوع محیط کشت MS که هرکدام با ترکیب و غلظت­های متفاوتی از تنظیم کننده­های رشد گیاهی تکمیل شده بودند (جدول 1)، کشت شدند. ازنظر درصد کالوس­زایی به غیر از ریزنمونه­های کشت شده در محیط کشت­های تکمیل شده با 5/0 میلی گرم بر لیتر IAAبه‌اضافه 5/0 یا 1 میلی گرم بر لیتر BAP، همه ریز نمونه‌ها در سایر محیط­ها عملکرد مشابه داشتند. بیشترین وزن‌تر کالوس از هر سه ریز نمونه در محیط کشت­های MS تکمیل شده با 1 میلی گرم بر لیتر2,4-Dدر ترکیب با 1 یا 5/0 میلی گرم بر لیتر از یکی از سیتوکنین­های BAP یا TDZ بدست آمد. در این مرحله در برخی کالوس­ا اندام­زایی نیز مشاهده شد. بیشترین درصد اندام­زایی (2/33 درصد) به ریزنمونه­های برگ کشت شده در محیط کشت MS حاوی 1 میلی گرم بر لیتر IAAبه‌اضافه 5/0 میلی گرم بر لیترBAPمربوط بود و به ازای هر ریز نمونه 2 شاخساره تشکیل شد. کالوس­های تشکیل شده در محیط کشت­های تکمیل شده با 2,4-Dدر ترکیب با BAP یا TDZ به محیط کشت­های باز زایی انتقال داده شدند. ولی باز زایی فقط در محیط کشت MSفاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی از کالوس­های مشتق از ریزنمونه­های کوتیلدون که در محیط کالوس زایی حاوی 1 میلی گرم بر لیتر 2,4-D به‌اضافه 5/0 میلی گرم بر لیتر BAPتشکیل شده بودند، با فراوانی 11/11 درصد و تشکیل یک شاخساره به ازای هر ریز نمونه، دو ماه بعد از انتقال مشاهده شد. ریشه­زایی در شاخساره­های حاصله نیز در محیط کشت MS فاقد تنظیم کننده­های رشد گیاهی با فراوانی 78/77 درصد و 36/2 ریشه به ازای هر شاخساره رخ داد.

1- اسفندیار، ا.، کاظمی تبار، ک.، و کیانی، غ.، 1396. بررسی امکان القای کالوس و باز زایی غیرمستقیم در گیاه مامیران (Chelidonium majus L.) تحت تأثیر تنظیم کننده‌های رشد اکسین و سیتوکنین، مجله پژوهش‌های گیاهی، (3)30، صفحات 671-656.

 

2- Clombo, M. L., and Bosisio, E., 1996. Pharmaligical activities of Chelidonium majus L. (Papaveraceae). Pharmalogical Research, 33, PP: 127 – 134.

3- Dhenuka, S., Balakrishna, P., and Anand, A., 1999. Indirect organogenesis from leaf explants of medicinally important plant Curculigo orchioides Gaertn, Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology, 8, PP: 113-115.

4- Gilca, M., Gaman, L., Panait, E., Stoian, I., and Valeriu, A., 2010. Chelidonium majus – an integrative review: traditional knowledge versus modern finding. Forsch Komplementmed, 17, PP: 241 – 248.

5- Hashemi, S. M., and Naghavi, M. R., 2015. Callus production of medicinal plant (Chelidonium majus L.), 1th International and 9th National Biotechnology Congress of Islamic Republic of Iran. May 24-26, Shahid Beheshti University, Tehran. Iran.

6- Hussain, A., Qarshi, I. A., Nazir, H., and Ullah, I., 2012a. Plant tissue culture: current status and opportunities, In: A. Leva and L. M. R., Rinaldi (eds). Recent Advances in Plant in Vitro Culture. INTECH, PP: 1 – 28.

7- Hussain, S., Fareed, S. H., Ansari, S., Rahman, A., Ahmad, I. Z., and Saeed, M., 2012b. Current approaches toward production of secondary plant metabolites, Journal of Pharmacy and BioAllied Sciences, 4, PP: 10-20.

8- Jones, M. P. A., Yi, Z., Murch, S. J., and Saxena, P. K., 2007. Thidiazuron induced regeneration of Echinacea purpurea L: micropropagation in solid and liquid culture systems, Plant Cell Reports, 26, PP: 13-19.

9- Kim, S. K., Min, B. W., and Liu, J. R., 1999. High frequency plant regeneration from immature ovule-derived embryogenic cell suspension cultures of Chelidonium majus var. asiaticum, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 56, PP: 125 – 129.

10- Otgonpurev, S., Altantsetseg, K. H., and Tsevegsuren, N., 2013. Callus and cell suspension culture of Chelidonium majus, Journal of Agriculture Sciences, 11, PP: 150–154.

11- Ramawat, K. G., and Merillon, J. M., 1999. Biotechnology Secondary Metabolites, Science Publisher, Enfield, USA, PP: 425-432.

12- Rout, G. R., Samantaray, S., and Das, P., 2000. In vitro manipulation and propagation of medicinal plants. Biotechnology Advances, 18, PP: 91-120.

13- Sajc, L., Grubisic, D., and Vunjak-Novakovic, G., 2000. Bioreactors for plant engineering: an outlook for further research, Journal Biochemistry Engineering, 4, PP: 89–99.

14- Sarkheil, P., Omidi, M., Peyghambari, S. A., and Davazdahemami, S., 2009. The effect of plant growth regulators and explants on callogenesis, regeneration and suspension culture in Foeniculum vulgare Mill, Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 25, PP: 364-375.

15- Shimomura, K., Yoshimatsu, K., Jaziri, M., and Ishimaru, K., 1997. Traditional medicinal plant genetic resources and biotechnology applications. In: K. Watanabe and E.R.G. Pehu (eds), Plant biotechnology and plant genetic resources for sustainability and productivity. Austin, TX: R. G., Landes Company and Academic Press Inc, PP: 209 - 225.

16- Sidhu, Y., 2010. In vitro propagation of medicinal plants by tissue culture. The Plymouth Student Scientist, 4, PP: 432-449.

17- Sridhar, T. M., and Aswath, C. R., 2014. Review on medicinal plants propagation: A comprehensive study on role of natural organic extracts in tissue culture medium. American Journal of Plant Sciences, 5, PP: 3073-3088.

18- Trivedi, M., Yadav, S. K., Yadav, G. K., Bhaskar, R., and Tiwari, R. K., 2010. Thidiazuron induce callus induction and in vitro regeneration of asparagus (Asparagus racemosus Wild). Indian Journal of Science Research, 1, PP: 27-30.

19- Vantu, S., 2011. Aspects of in vitro cultivation of Chelidonium majus. Scientific Annals of Alexandru Cuza University of Iasi. New Series, Section 2, Vegetable Biology, PP: 49 – 52.

20- Vinterhalter, B., and Vinterhalter, D., 2002. Propagation of Chelidonium majus L., by somatic embryogenesis. Biologia Plantarum, 45, PP: 489 – 493.

21- Wagner, H., 1982. Pharmazeutische biologie, Vol. 2, Fischer, Stuttgart, PP: 155.

22- Wen, K., 2000. The turnover rate of marker constituents in Chinese herbal medicine, Journal of Food and Drug Analysis, 8, PP: 270 – 277.