نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم زیستی دانشکده علوم، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران.

2 دانشگاه کردستان، دانشکده علوم، گروه عتوم زیستی

چکیده

رادیکال‌های آزاد و استرس اکسیداتیو ناشی از آن‌ها باعث ایجاد اختلالات وسیعی در بدن می‌شوند. یکی از راهکارها برای از بین بردن رادیکال‌های آزاد و پیشگیری از عوارض آنها، استفاده از آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی می‌باشد. گیاهان حاوی مقدار فنول و فلاونوئید قابل توجهی هستند که در تمام قسمت‌های گیاهان پراکنده شده‌اند و به گیاهان خاصیت آنتی‌اکسیدانی می‌دهند. هرچند که خاصیت آنتی‌اکسیدانی دو گیاه خاکشیر و شاه‌تره گزارش شده است اما هیچ گزارشی از جایگاه اندامی خاصیت آنتی‌اکسیدانی این گیاهان صورت نگرفته است. هدف از این تحقیق بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی و تعیین مقدار فنول و فلاونوئید تام در اندام‌های هوایی دو گیاه مذکور می‌باشد. از تست‏های احیاء رادیکال آزاد DPPH و احیا آهن، جهت بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی استفاده شد. محتوای فنول و فلاونوئید، عصاره هگزانی اندام‌های هوایی دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی قابل توجه دو گیاه خاکشیر و شاه‌تره به روشهای مرسوم تعیین شدند. برای بررسی هر یک از تست‌ها از یک کنترل استاندارد استفاده شد و هر سنجش برای هر اندام با سه تکرار صورت گرفت. نتایج به دست آمده و آنالیزهای آماری نشان داد که عصاره هگزانی گل گیاه خاکشیر و برگ گیاه شاه‌تره حاوی مقدار بالایی از فنول و فلاونوئید بودند و هم‌چنین به دلیل مقادیر EC50 پایین‌، قدرت مهار رادیکال آزاد بیش‌تری داشتند. لذا اندامهای فوق فعالیت آنتی‌اکسیدانی قابل توجهی نسبت به سایر اندام‌های هوایی داشتند. با مطالعات و تست‌های آنتی‌اکسیدانی بیش‌تر بر روی این دو اندام می‌توان از آن‌ها به عنوان افزودنی یا مکمل در تأمین آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی برای بدن استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of Antioxidant Activity and Determination of Phenol and Flavonoids in Hexane Extract of Aerial Plants Descurainia Sophia and Fumaria vaillantii

نویسندگان [English]

  • Morteza Sadeghi 1
  • Mohammad Ali Zarei 2

1 Department of Biological sciences, Faculty of Science, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran.

2 Department of Biological sciences, Faculty of science, University of Kurdistan

چکیده [English]

Free radicals and oxidative stress caused by them cause extensive disorders in the body. One of the solutions to eliminate free radicals and the prevention of their complications is the use of natural antioxidants. Plants contain significant amounts of phenol and flavonoids that are scattered throughout parts of the plant and give the plants anti-oxidant properties. Although, the antioxidant properties of the Descurainia Sophia and Fumaria vaillantii were reported, however, no reports have been made on the organoleptic characteristics of the antioxidant properties of these herbs. The purpose of this study was to investigate the antioxidant properties and determine the amount of total phenol and flavonoids in the aerial organs of the two plants. DPPH scavenging and iron reduction tests were used to evaluate anti-oxidant properties. The phenol and flavonoid content of hexane extract from the aerial organs, with considerable anti-oxidant properties were determined by conventional tests. A standard control was used for each of the tests and each assay was performed for each organ with three replications. The obtained results and statistical analyzes showed that the hexane extract of Descurainia’s flower, and Fumaria’s leaf had high content of phenol and flavonoid and also, due to lower EC50 values, had more free radical inhibitory power. Therefore, the organs had a significant antioxidant activity compared to other air organs. With these anti-oxidative studies and tests, these two organs can be used as an additive or supplement to provide natural antioxidants to the body.

کلیدواژه‌ها [English]

  • antioxidant
  • phenol
  • Flavonoid
  • Descurainia Sophia
  • Fumaria vaillantii

ارزیابی فعالیت آنتی­اکسیدانی و تعیین میزان فنل و فلاونوئید عصاره هگزانی اندام­های هوایی گیاهان خاکشیر (Descurainia sophia)و شاه­تره (Fumaria vaillantii)

مرتضی صادقی و محمدعلی زارعی*

ایران، سنندج، دانشگاه کردستان، دانشکده علوم، گروه علوم زیستی

تاریخ دریافت: 16/11/96              تاریخ پذیرش: 15/8/97

چکیده

رادیکال­های آزاد و استرس اکسیداتیو ناشی از عملکرد آن­ها باعث ایجاد اختلالات وسیعی در بدن می­شوند. یکی از این راهکارها برای از بین بردن رادیکال­های آزاد و پیشگیری از عوارض آنها، استفاده از آنتی­اکسیدان­های طبیعی می­باشد. گیاهان حاوی مقدار قابل توجهی فنول و فلاونوئید هستند که در تمام قسمت­های گیاهان پراکنده شده­اند و به گیاهان خاصیت آنتی­اکسیدانی می­دهند. هرچند که خاصیت آنتی­اکسیدانی دو گیاه خاکشیر و شاه­تره گزارش شده است اما هیچ گزارشی، از جایگاه اندامی خاصیت آنتی­اکسیدانی این گیاهان صورت نگرفته است. هدف از این تحقیق بررسی خاصیت آنتی­اکسیدانی و تعیین مقدار فنول و فلاونوئید تام در اندام­های هوایی دو گیاه مذکور می­باشد. از تست‏های احیاء رادیکال آزاد DPPH و احیاء آهن، جهت بررسی خاصیت آنتی­اکسیدانی استفاده شد. محتوای فنول و فلاونوئید، عصاره هگزانی اندام­های هوایی دارای خاصیت آنتی­اکسیدانی قابل‌توجه دو گیاه خاکشیر و شاه­تره به روش‏های مرسوم تعیین شدند. برای بررسی هریک از تست­ها از یک کنترل استاندارد استفاده شد و هر سنجش برای هر اندام با سه تکرار صورت گرفت. نتایج به دست آمده و آنالیزهای آماری نشان داد که عصاره هگزانی گل گیاه خاکشیر و برگ گیاه شاه­تره حاوی مقدار بالایی از فنول و فلاونوئید هستند و هم­چنین به دلیل مقادیر EC50 پایین، مهار رادیکال آزاد بیش­تری داشتند. بنابراین اندام‏های فوق فعالیت آنتی­اکسیدانی قابل توجهی نسبت به سایر اندام­های هوایی داشتند. با مطالعات و تست­های آنتی­اکسیدانی بیش­تر بر روی این دو اندام می­توان از آن­ها به‌عنوان افزودنی یا مکمل در تأمین آنتی­اکسیدان­های طبیعی برای بدن استفاده کرد.

واژه‌های کلیدی: آنتی‏اکسیدان، محتوی فنولی، محتوی فلاونوئید، خاکشیر، شاه‏تره

* نویسنده مسئول، تلفن: 09188710632، پست الکترونیکی: mazarei@uok.ac.ir

مقدمه

 

نقش فیزیولوژیک آنتی‏اکسیدان‏ها، جلوگیری از آسیب به اجزای سلولی که ناشی از واکنش‏های شیمیایی رادیکال‏های آزاد است. رادیکال‏های آزاد باعث اکسیداسیون ماکرومولکول‏هایی مانند اسیدهای نوکلئیک، لیپیدها و پروتئین‏ها می‏شوند که این منجر به آسیب‏رساندن سلول و مرگ آن می‏شود (31). بسیاری از رادیکال‏های آزاد به شدت واکنش‏پذیرند که می‏توانند هم به‌عنوان، دهنده‏ی الکترون و هم پذیرنده‏ی الکترون عمل کنند، بنابراین دچار اکسیداسیون و احیا می‏شوند؛ بیشتر رادیکال‏های آزاد در سیستم‏های بیولوژیک نیمه‏عمری کوتاه (۱۰۶ ثانیه یا کم‏تر) دارند اگرچه بعضی از گونه‏ها برای مدت طولانی دوام می‏آورند (13).

درحال حاضر نتایج مطالعات بالینی نشان می‏دهد که استرس اکسیداتیو ناشی از گونه‏های فعال اکسیژن و نیتروژن در انواعی از اختلالات، ازجمله سرطان و پیری نقش دارد. پیامد مهم این است که آنتی‏اکسیدان‏ها باید در پیشگیری یا سرکوب چنین اختلالاتی مؤثر باشند. درواقع مطالعات زیادی نشان می‏دهد که آنتی‏اکسیدان‏ها دارای اثر مهاری قوی در برابر آسیب‏های اکسیداتیو هستند و گزارشات اپیدمیولوژیک پیشنهاد می‏کند که آنتی‏اکسیدان‏ها اثرات سودمندی دارند (23). آنتی‏اکسیدان‏ها ممکن است اثرات خود را با عملکردهای مختلفی مثل سرکوب کردن تشکیل گونه‏های فعال با کاهش هیدروپراکسیداز و هیدروژن پراکسید، از بین بردن رادیکال‏های آزاد فعال و تعمیر یا پاکسازی آسیب اعمال کنند (25).

داروهای آنتی‌اکسیدانی مصنوعی و شیمیایی به‌طور گسترده بررسی شده‏اند و برخی از آن‏ها در واقع استفاده‏های تجاری دارند. آنتی‏اکسیدان‏های ساختگی و شیمیایی مثل بوتیلیدهیدروکسی‏آ‏نیزول و بوتیلید ‏هیدروکسی ‏تولوئن طی سال‏های زیادی برای حفظ و ثبات ارزش غذایی، به عنوان افزودنی‏های غذایی و در تولید غذاهای جانوری مورد استفاده می‏باشند. اما تحقیقات نشان داد که این آنتی‏اکسیدان‏های مصنوعی می‏توانند در حیوانات آزمایشگاهی باعث ایجاد سرطان شوند (18). بنابراین، مطالعات زیادی بر روی آنتی‏اکسیدان‏ها، خصوصاً آنتی‏اکسیدان‏های طبیعی که باعث مهار تشکیل رادیکال‏های آزاد و آسیب‏های ناشی از آن‏ها می‏شود، در حال انجام است. در بدن سیستم‏های آنتی‏اکسیدانی مانند آنزیم‏های سوپراکسیددیسموتاز، کاتالاز، ماکرومولکول‏هایی مثل آلبومین، سرولوپلاسمین و سایر مولکول‏های کوچک مثل آسکوربیک‏اسید، آلفاتوکوفرول و بتاکاروتن وجود دارند که می‏توانند با رادیکال‏های آزاد مقابله کنند (15). اگرچه آنتی‏اکسیدان‏ها در بدن وجود دارند اما برای از بین بردن رادیکال‏های آزاد در بدن باید از آنتی‏اکسیدان‏های افزودنی و از طریق تغذیه، استفاده شود (33).

اخیراً نقش آنتی‏اکسیدان‏ها در رژیم غذایی مورد توجه قرارگرفته است به‌عنوان‌مثال مشخص شده است که رژیم‏های غذایی سرشار از میوه‏ها و سبزیجات به علت دارا بودن مواد آنتی‏اکسیدانی، خطر ابتلا به بیماری‏های کرونر قلب و سرطان را پایین می‏آورند (22). مطالعاتی که بر روی گیاهان دارویی درحال انجام است، نشان می‏دهد که گیاهان دارویی به دلیل خواص آنتی‏اکسیدانی قوی و مقرون به‏صرفه بودن ازلحاظ اقتصادی، موضوعات پژوهشی مناسبی هستند (21). خواص آنتی‏اکسیدانی گیاهان در درجه‏ی اول به دلیل ترکیبات فنولی موجود در آن‏هاست که ممکن است در تمام قسمت‎‏های گیاهان مثل میوه‏ها، دانه‏ها و برگ‏ها وجود داشته باشد (28). بسیاری از این ترکیبات آنتی‏اکسیدانی دارای اثرات ضدالتهابی، ضدتومور، ضدسرطان و یا فعالیت‏های ویروسی می‏باشند (3). فنول‏ها و ترکیبات فنولیک مثل فلاونوئیدها جزء متابولیت‏های ثانویه گیاهان می‏باشند و به‌صورت گسترده در بعضی گیاهانی که دارای خاصیت آنتی‏اکسیدانی هستند، یافت می‏شوند (2). توان آنتی‏اکسیدانی این ترکیبات به دلیل وجود گروه‏های هیدروکسیل در ساختار حلقه آروماتیک می‏باشد و با دارا بودن الکترون‏های جفت نشده‏ای که اطراف حلقه وجود دارد، رادیکال‏های آزاد را از بین می‏برند (8). مهم‏ترین گروه پلی‏فنول‏ها، فلاونوئیدها می‏باشند که با داشتن گروه‏های هیدروکسیل و متوکسیل باعث خنثی شدن رادیکال‏های آزاد می‏شوند (16). هم‏چنین آنزیم‏هایی مانند سیکلواکسیژناز و لیپواکسیژناز که در تولید گونه‏های فعال اکسیژن نقش دارند، توسط فلاونوئیدها مهار می‏شوند و بنابراین از این طریق نیز تولید رادیکال‏های فعال نیز کاهش می‏یابد (26).

خاکشیر بانام علمی Descurainia sophia از خانواده چلیپائیان و گیاهی یک‏ ساله به ارتفاع 20 تا 60 سانتی‏متر با کاسبرگ‏های حاوی غده‏های مویی است (32). این گیاه در آسیا (ایران، افغانستان، آذربایجان، چین و عراق) و اروپا بیش‏تر یافت می‏شود (12). گیاه خاکشیر غنی از ترکیبات پلی‏فنول است که تعداد زیادی از این ترکیبات مانند فلاونوئید، کومارین و سولفورگلیکوزیدها به دلیل دارا بودن خاصیت آنتی‏اکسیدانی معروف می‏باشند (17). شاه‏تره نیز با نام علمی Fumaria vaillantii از خانواده فوماریاسه و گیاهی یک ‏ساله با طولی در حدود 60 سانتی‏متر و دارای گل‏های سفید یا صورتیِ کم‏رنگ است (20). این گیاه برای درمان یبوست، اسهال و عوارض کبدی استفاده می‏شود و به‌طور گسترده در طب سنتی به عنوان یک تصفیه‏کننده خون در درمان بیماری‏های پوستی کاربرد دارد (19). گیاه کامل شاه‏تره حاوی چندین ترکیب آلکالوئید و فلاون هتروزید مانند آدلومین، فوماریلین و فوماریتین می‏باشد که به گیاه خاصیت آنتی‏اکسیدانی داده‏اند (27).

با توجه به اینکه قدرت آنتی‏اکسیدانی بالایی برای هر دو گیاه گزارش شده است اما هیچ گزارشی برای بررسی خاصیت آنتی‏اکسیدانی در بخش‏های هوایی دو گیاه در دست نیست. بنابراین، با در نظر گرفتن خصوصیات ذکر شده برای دو گیاه، هدف از این تحقیق ضمن اندازه‏گیری محتوای تام فنولی و تام فلاونوئیدی، بررسی توان آنتی‏اکسیدانی احیاء آهن و ارزیابی خاصیت آنتی‏اکسیدانی توسط دی‏فنیل پیکریل هیدرازیل (DPPH) در عصاره‏های هگزانی اندام‏های هوایی دو گیاه بود.

مواد و روشها

مواد شیمیایی و بیوشیمیایی: دی­فنیل پیکریل هیدرازیل، اسید آسکوربیک، کوئرستین، استات پتاسیم، آلومینیوم کلراید، فولین سیوکالتو، اسید گالیک، سدیم کربنات، پتاسیم فری­سیانید، تری­کلرو استیک اسید، آهن کلراید (III) از نمایندگی­های شرکت مرک خریداری شدند.

جمع­آوری گیاهان: اندام­های هوایی گیاهان خاکشیر و شاه­تره در ماه­های اردیبهشت و خرداد از مناطق اطراف شهر سنندج توسط کارشناس ارشد سیستماتیک گیاهی جمع­آوری و به مرکز تحقیقات کشاورزی استان کردستان ارسال شد. پس از شناسایی تاکسونومیک در هرباریوم مرکز تحقیقات کشاورزی استان کردستان، بلافاصله به آزمایشگاه گروه علوم زیستی منتقل شدند. اندام­های مختلف (شامل گل، برگ و ساقه) به طور کامل جداسازی شده و در سایه و دمای محیط آزمایشگاه خشک شدند. قبل از تهیه­ی پودر نمونه‏ها از لحاظ نظافت و عدم آلودگی بررسی شدند. سپس به وسیله قیچی باغبانی به قطعات کوچکی خرد شدند و به‏ وسیله آسیاب خانگی مولینکس به صورت پودر نرم درآمدند. پودرهای به دست آمده از اندام­های هوایی گیاه پس از توزین در ظروف درب­دار پلاستیکی تا زمان عصاره­گیری، در دمای اتاق نگه­داری شدند.

تهیه عصاره هگزانی از نمونه‌های گیاهی: به منظور تهیه­ی عصاره هگزانی، ۴۰ گرم پودر تهیه شده از هریک از اندام­های هوایی گیاه در ۲۰۰ میلی­لیتر حلال ان- هگزان به مدت ۲۴ ساعت خیسانده و در فواصل زمانی معینی هم­زده ­شد. پس از زمان طی شده مخلوط فوق توسط کاغذ صافی واتمنشماره ۴۲ صاف شد. مایع صاف شده توسط دستگاه روتاری اواپریتور در دمای ۶۵ درجه سانتی‏گراد تغلیظ شده و پس از تخلیه از مخزن دستگاه، جهت خشک شدن کامل، روی شیشه ساعت به قطر ۱۵ سانتی­متر، پخش شده و در زیر هود شیمیایی و در دمای محیط قرارگرفت. عصاره­های خشک شده از روی سطح شیشه ساعت جمع­آوری و در میکروتیوب ۵/۱ میلی­لیتری تا زمان انجام مراحل بعدی در دمای ۲۰- درجه سانتی­گراد نگه­داری شدند.

ارزیابی خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره‏ها از دو روش معمول شامل توان احیاء رادیکال آزاد دی­فنیل پیکریل هیدرازیل (DPPH) و قدرت احیاء آهن (Fe III) استفاده شد. مبنای روش اول، به دام انداختن رادیکال­های DPPH طبق توانایی هیدروژن­دهی نمونه است (7). دی­فنیل پیکریل هیدرازیل به عنوان یک رادیکال آزاد پایدار به رنگ بنفش می­باشد که در صورت احیاء شدن توسط عوامل دهنده الکترون ( ترکیبات آنتی­اکسیدانی مثل اسید آسکوربیک) به دی­فنیل پیکریل هیدرازین (Diphenylpicrylhydrazine) (غیررادیکالی) زرد رنگ تبدیل می­شود. در جریان این آزمایش قدرت احیاء­کنندگی عصاره­ها با کم­رنگ شدن یا بی­رنگ شدن DPPH توسط ترکیبات عصاره مورد سنجش قرارگرفت و هرچه محلول واکنش کم­رنگ­تر شود، جذب آن کاهش می­یابد و این نشان می­دهد که عصاره دارای خاصیت آنتی­اکسیدانیِ بالا می­باشد (24). در روش دوم، قدرت احیاءکنندگی مواد موجود در عصاره با احیاء شدن آهن III به آهن II ارزیابی می­شود. احیاء شدن آهن اکثراً تحت عنوان سنجش الکترون­دهی استفاده می­شود که روش مناسبی در بررسی کارکرد فعالیت آنتی­اکسیدانی مواد فنولی می­باشد (14).

ارزیابی رادیکال آزاد DPPH توسط ماده موجود در عصاره: جهت بررسی فعالیت آنتی­اکسیدان و مهار رادیکال آزاد DPPH دراین تحقیق از روش فو و همکارانش استفاده شد (10). سنجش­ها در میکروپلیت­های ۹۶ چاهکی و در حجم کل ۲۰۰ میکرولیتر و با استفاده از دستگاه میکروپلیت­خوان تکن (Tecan) مدل سانرایز(Sunrise)، به ترتیب زیر انجام شد. ابتدا ۱۰۰ میکرولیتر از محلول ۱/۰ میلی­مولار DPPH (حل شده در متانول) به چاهک­ها افزوده شد و سپس مقدار ۱۰۰ میکرولیتر از غلظت­های مختلف عصاره به آن افزوده­شد. آنگاه به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی­گراد انکوبه شد. از محلول DPPH به عنوان کنترل منفی نیز استفاده گردید. بعد از گذشت ۳۰ دقیقه، جذب در طول‌موج ۵۱۷ نانومتر اندازه­گیری­شد. از اسید آسکوربیک با غلظت­های 031/0، 25/0، 5/0، 1، 2، 5، 8 و 12 میکروگرم بر میلی­لیتر به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید.

پس از پایان سنجش، جذب پلیت خالی از جذب چاهک­های متناظرش کسر شده و سپس با تفریق جذب چاهک بلانک از جذب چاهک تست، جذب نهایی محاسبه شد. فعالیت آنتی­اکسیدانی برای سه تکرار هر عصاره محاسبه و در پایان میانگین گرفته شد. درنهایت فعالیت پاکسازی رادیکال (Free radical scavenging activity (FRSA)) DPPH بااستفاده از فرمول (1) محاسبه شد.

فرمول(1)

100×  = فعالیت پاکسازی رادیکال آزاد

توانایی پاکسازی نسبی (RSA= Relative Scavenging Activity) نشانگر نسبت EC50 آنتی­اکسیدان استاندارد (اسید آسکوربیک) به EC50 آنتی­اکسیدان مورد نظر می­باشد. از توانایی پاکسازی نسبی می­توان جهت مقایسه توانایی پاکسازی آنتی­اکسیدان­های مورد نظر استفاده کرد و جهت محاسبه RSA از معادله زیر استفاده شد (6).

 

ارزیابی خاصیت آنتی­اکسیدانی احیاء آهن: میزان قدرت احیاءکنندگی عصاره­ها توسط روش ین و چن با کمی تغییرات انجام شد (34). بدین ترتیب که عصاره با غلظت­های مختلف 50، 100، 200، 400، 600 و 800 میکروگرم در میلی­لیتر آماده شد. سپس 5/2 میلی­لیتر بافر فسفات 2/0 مولار و 5/2 میلی­لیتر پتاسیم فری­سیانید 1 درصد به آن­ها اضافه شد. مخلوط واکنش به مدت 30 دقیقه در دمای 45 درجه سانتی­گراد نگه­داری شد. سپس 5/2 میلی­لیتر تری کلرواستیک اسید 10 درصد به دلیل توقف واکنش به آن­ها اضافه شد. نمونه­های حاوی مواد به مدت 15 دقیقه در سانتریفیوژ 3000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ شدند پس از اتمام سانتریفیوژ 5/2 میلی­لیتر از مایع بالای محلول برداشته شد و با 5/0 میلی­لیتر آهن (III) کلراید 1 درصد مخلوط شد و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب در 700 نانومتر خوانده شد. از اسید آسکوربیک با غلظت­های 50، 100، 200، 400، 600 و 800 میکروگرم بر میلی­لیتر به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

اندازه­گیری فنول تام عصاره­ها: میزان کل ترکیبات فنولی با روش فولین سیوکالچیو (Folinciocalteu) و مطابق دستورکار توسط شهیدی و ناچک با کمی تغییرات اندازه­گیری شد (29). یک میلی­گرم از هریک از اندام­های هوایی گیاه در 10 میلی­لیتر متانول حل شد تا نمونه کشت ppm100 ایجاد شود. فراکسیون­های 5/0 میلی­لیتر (سه گانه) در لوله آزمایش ریخته شد و بعد 5/0 میلی­لیتر معرف فولین سیوکاچیو به لوله­ها اضافه و به مدت 2 دقیقه هم­زده شد. سپس 10 میلی­لیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد اضافه شد. جذب نمونه­ها پس از یک ساعت قرار دادن نمونه­ها در دمای 45 درجه سانتی­گراد با دستگاه اسپکتروفتومتر در 765 نانومتر اندازه­گیری شد و آزمایشات برای عصاره و استاندارد سه بار تکرار شد. برای رسم منحنی استاندارد اسید گالیک، محلول پایه­ای از این ماده با غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر تهیه شد سپس از این غلظت، رقت­های مختلف (100، 80، 60، 40، 20، 10) برحسب میکروگرم بر میلی­لیتر تهیه شدند. پس از طی مراحل مختلف طبق روش مذکور جذب نمونه­ها قرائت شد. براساس یک نمودار کالیبراسیون اسید گالیک، با به دست آوردن معادله خطی منحنی استاندارد و قرارداد جذب عصاره در آن، مقدار فنول تام عصاره اندازه­گیری شد. در پایان محتوای فنول تام بصورت میلی­گرم اسید گالیک در گرم عصاره بیان شد. روش فولین سیوکالچیو یک روش مهم برای اندازه­گیری مقدار فنول موجود در عصاره می­باشد که اساس این روش احیاء معرف فولین سیوکالچیو توسط ترکیبات فنولی موجود در عصاره و تشکیل کمپلکس آبی رنگ می­باشد که ماکزیمم جذب را در 765 نانومتر دارد.

اندازه­گیری فلاونوئید تام عصاره: فلاونوئید تام با روش ایجاد کمپلکس رنگی آلومینیوم کلراید و مطابق دستورکار چانگ- یانگ با کمی تغییرات اندازه‏گیری شد (5). طبق این روش، محلول 1/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر از عصاره هر یک از اندام­های هوایی دو گیاه تهیه شد. 5/0 میلی­لیتر از نمونه در 5/1 میلی­لیتر متانول حل شد. سپس 1/0 میلی­لیتر آلومینیوم کلراید 10 درصد، 1/0 میلی­لیتر استات پتاسیم 1 مولار و 8/2 میلی­لیتر آب مقطر به آن اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرارگرفت و جذب خوانده شد. جذب مخلوط در 415 نانومتر قرائت شد. از کوئرستین برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد و نتایج براساس میلی­گرم معادل کوئرستین (Quercetin) در گرم عصاره بیان شد. بدین صورت که ابتدا یک محلول از کوئرستین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر تهیه شد. سپس غلظت­های دیگر (80، 60، 40، 20، 10) برحسب میکروگرم بر میلی­لیتر از رقیق‌سازی محلول فوق به دست آمدند. براساس یک نمودار کالیبراسیون کوئرستین، با به دست آوردن معادله خط و قرار دادن جذب عصاره در آن، مقدار فلاونوئید تام عصاره ارزیابی شد. آزمایشات 3 بار تکرار شد و میانگین این تکرارها گزارش شد. اساس این روش رنگ ایجاد شده توسط کمپلکس اسیدی ایجاد شده آلومینیوم کلراید با گروه هیدروکسیل فلاونوئیدها است و در صورت وجود فلاونوئید در عصاره این کمپلکس ایجاد می­شود که بیشترین جذب را در طول‌موج 415 نانومتر دارد.

تحلیل­ها و آنالیزهای آماری: داده­ها و نتایج حاصل از آزمایش­ها در این تحقیق و رسم نمودارها با استفاده از نرم­افزار سیگماپلات (Sigma plot) و اکسل مورد تجزیه‌وتحلیل قرارگرفت. برای بررسی و مقایسه میانگین عصاره­های هگزانی از آزمون تجزیه واریانس یک­طرفه (ANOVA) استفاده شد و تمام داده­های حاصل از آزمایش با سه بار تکرار و مقدار آن­ها به صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش شد.

نتایج

توانایی به دام اندازی رادیکال DPPH توسط اندام­های هوایی گیاه: فعالیت پاکسازی رادیکال آزاد عصاره هگزانی اندام­های هوایی دو گیاه توسط معرف DPPH صورت گرفت. درصد مهار DPPH و EC50= Efficient concentration (بیان کننده مقدار غلظتی از عصاره که باعث مهار 50 درصد از رادیکال آزاد می­شود) توسط عصاره هگزانی هریک از اندام­های هوایی در گیاه خاکشیر و شاه­تره در جدول 1 نشان داده شده است، مقادیر EC50 مربوط به هر یک از اندام­های هوایی در کنار نمونه استاندارد (اسید آسکوربیک) در شکل 1 آمده است و هم­چنین مقدار RSA نیز در عصاره هگزانی هریک از اندام­های هوایی دو گیاه در جدول 2 آورده شده است.

 

جدول 1-درصد مهار DPPH و EC50 برای عصاره هگزانی هر یک از اندام­های هوایی گیاه خاکشیر و شاه­تره. اسید آسکوربیک به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد (mg/ml 35/0=EC50)

نام علمی گیاه

اندام

EC 50 (mg/ml)

درصد احیا DPPH در غلظت mg/ml 100

Descurainia sophia

گل

5/1

100

برگ

9/7

33/75

ساقه

18

21/47

Fumaria vaillantii

گل

9/3

27/55

برگ

8/1

100

ساقه

35

08/43

 

 

جدول 2- مقدار RSA برای عصاره هگزانی اندام­های هوایی گیاهان

نام علمی گیاه

اندام

RSA

Descurainia sophi

گل

23/0

برگ

044/0

ساقه

019/0

Fumaria vaillantii

گل

09/0

برگ

19/0

ساقه

01/0

 

شکل 1- مقایسه EC50 عصاره هگزانی اندام­های هوایی دو گیاه با اسید آسکوربیک، معنی علائم (گل خاکشیر:DF، برگ خاکشیر:DL، ساقه خاکشیر:DS، گل شاه­تره:FF، برگ شاه­تره:FL، ساقه شاه­تره:FS، اسید آسکوربیک:AA)

توانایی احیاءکنندگی آهن توسط عصاره هگزانی اندام­های هوایی دو گیاه: توان احیاءکنندگی، قدرت الکترون­دهی آنتی­اکسیدان را نشان می­دهد. در این روش قدرت احیایی عصاره هگزانی اندام­های هوایی براساس احیاء آهن III به آهن II ارزیابی می­شود و محلول عصاره هر اندامی که قدرت احیای بالایی داشته باشد، جذب بیش­تری دارد و در این آزمایش، افزایش در جذب به معنی افزایش در فعالیت آنتی­اکسیدانی می­باشد و بدون واحد است چون از جذب نوری برای میزان توان احیاء­کنندگی استفاده می­شود. شکل 2 منحنی غلظت-جذب عصاره هگزانی اندام­های هوایی دو گیاه را نشان می­دهد و مشاهده می­شود که قدرت احیاءکنندگی تمام اندام­ها با افزایش غلظت زیاد می­شود. مقایسه میزان احیاء در بالاترین غلظت (800 میکروگرم بر میلی­لیتر) عصاره هگزانی اندام­های هوایی دو گیاه با اسید آسکوربیک در شکل 3 آمده است.

 

شکل 2- قدرت احیاءکنندگی عصاره هگزانی اندام­های هوایی دو گیاه در غلظت 800-50 میکروگرم بر میلی­لیتر (اسید آسکوربیک به عنوان نمونه استاندارد در نظر گرفته شد)، (گل خاکشیر:DF، برگ خاکشیر:DL، ساقه خاکشیر:DS، گل شاه­تره:FF، برگ شاه­تره:FL، ساقه شاه­تره:FS، اسید آسکوربیک:AA)

 

شکل 3- توانایی احیاء آهن توسط عصاره هگزانی اندام­های هوایی دو گیاه در مقایسه با اسید آسکوربیک در غلظت 800 میکروگرم بر میلی‏لیتر

مقدار تام فنول موجود در اندام­های هوایی: مقدار ترکیبات فنول تام عصاره هگزانی خاکشیر و شاه­تره براساس مقدار جذب حاصل از واکنش عصاره با معرف فولین­سیو­کالچیو و بر مبنای مقایسه آن با محلول­های استاندارد اسید گالیک و براساس معادله خط حاصل از منحنی اسید گالیک (نمودار 1) محاسبه گردید. مقدار فنول مربوط به هر یک از اندام­های هوایی دو گیاه مذکور محاسبه شد (جدول 3).

 

نمودار 1- منحنی استاندارد گالیک اسید به منظور تعیین مقدار فنول موجود در اندام­های هوایی گیاه خاکشیر و شاه­تره

مقدار فلاونوئید تام موجود در اندام­های هوایی: مقدار فلاونوئید تام عصاره هگزانی دو گیاه بر مبنای رنگ­سنجی آلومینیوم کلراید صورت گرفت.

جدول 3- محتوای فنلی محاسبه شده برای اندام­های هوایی گیاهان مورد مطالعه

نام علمی گیاه

فنول (میلی­گرم گالیک­اسید در گرم عصاره)

اندام هوایی

Descurainia sophi

68/0± 96/2

برگ

73/0± 38/21

گل

31/0± 89/0

ساقه

Fumaria vaillantii

59/0± 13/121

برگ

61/0± 51/58

گل

51/0± 14/2

ساقه

 

با قراردادن میزان جذب عصاره اندام­های هوایی در معادله خط منحنی استاندارد محلول کوئرستین (نمودار2)، محاسبه میزان ترکیبات فلاونوئیدی صورت گرفت. مقدار فلاونوئید محاسبه شده برای هر اندام در جدول 4 آمده است.

 

نمودار 2- منحنی استاندارد کوئرستین به منظور تعیین محتوای فلاونوئیدی اندام­های هوایی گیاهان مورد مطالعه

 

جدول 4- منحنی استاندارد کوئرستین به منظور تعیین محتوای فلاونوئیدی اندام­های هوایی گیاهان مورد مطالعه

نام علمی گیاه

مقدارفلاونوئید (میلی­گرم کوئرستین در گرم عصاره)

اندام هوایی

Descurainia sophi

68/0± 81/12

برگ

73/0± 85/35

گل

76/0± 53/4

ساقه

Fumaria vaillantii

59/0± 83/11

برگ

61/0± 52/2

گل

45/0± 11/1

ساقه

هم­چنین مقایسه میان محتوی فنول و فلاونوئید اندام­های هوایی خاکشیر و شاه­تره به ترتیب در شکل 4 و 5 نشان داده شده است.

 

شکل 4- مقایسه محتوای فنول و فلاونوئید اندام­های هوایی گیاه خاکشیر

 

شکل 5- مقایسه محتوای فنول و فلاونوئید اندام­های هوایی گیاه شاه­تره

بحث و نتیجه‌گیری

جهت یافتن عصاره­های مؤثرتر از لحاظ فعالیت آنتی­اکسیدانی و پاکسازی رادیکال­های آزاد، مطالعات گسترده­ای بر روی گیاهان انجام شده است. طی تحقیقی که به منظور بررسی ارزیابی خواص آنتی­اکسیدانی و تعیین مقدار فنول تام صورت گرفت، عصاره متانولی برگ Cinnamomum verum دارای بالاترین فعالیت مهارکنندگی رادیکال آزاد و بیشترین مقدار فنول بود (21). باساک و همکاران فعالیت پاکسازی گونه­های فعال اکسیژن را در عصاره هیدروالکلی گیاه Laurus nobilis مورد بررسی قرار دادند و نتایج نشان داد که این گیاه به دلیل دارا بودن ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی قدرت مهار رادیکال­های آزاد را دارد (4). مطابق تحقیقات سوری و همکاران، خاکشیر با داشتن این خاصیت آنتی­اکسیدانی، سلول­ها را در مقابل آسیب­های اکسیداتیو حفظ می­کند (30). افشاری و همکاران با مطالعه عصاره­های متانولی شش گونه­ی گیاه Achillea نشان دادند که بعضی از گونه­های این گیاه (به­خصوص گونه A.pachycephalla) دارای بیش­ترین محتوای فنول و فلاونوئید بود و بنابراین از این نظر منبع طبیعی سرشار از آنتی­اکسیدان است (1). امروزه تأثیرات برخی از مواد مفید در گیاهان بر سلامت و شادابی انسان اثبات شده است که این اثرات ناشی از خاصیت آنتی­اکسیدانی موجود در اندام­های گیاهی می­باشد (11). ازجمله این ترکیبات، فنول و فلاونوئید موجود در اندام­های گیاهی هستند که در انسان باعث جلوگیری بسیاری از بیماری­ها به­خصوص بیماری­های قلبی- عروقی می­شوند (9). میزان فنول و فلاونوئید موجود در عصاره هگزانی اندام­های هوایی گیاه خاکشیر و شاه­تره این نظر را تأیید می­کند. نتایج حاصل از تست مهار رادیکال­های آزاد DPPH توسط اندام­های هوایی خاکشیر و شاه­تره نسبت به کنترل مثبت (اسید آسکوربیک) نشان داد که خاصیت ضد رادیکالی در اندام­های هوایی همانند اسید آسکوربیک، وابسته به غلظت است. به گونه­ای که با زیاد شدن غلظت عصاره هریک از اندام­ها، فعالیت مهارکنندگی رادیکال آزاد بیش­تری مشاهده می­شد. در محدوده غلظت 0001/0 تا 200 میلی­گرم بر میلی­لیتر درصد مهارکنندگی رادیکال­های DPPH توسط اسید آسکوربیک از 73/85 به 100 درصد و درصد مهارکنندگی رادیکال آزاد توسط عصاره هگزانی گل خاکشیر از 6/32 به 100 درصد و برگ شاه­تره از 11/40 به 100 درصد رسید. این افزایش خاصیت آنتی­اکسیدانی در اندام­های هوایی (به ویژه در گل خاکشیر و برگ شاه­تره) را می­توان به وجود ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی نسبت داد، در غلظت­های بالاتر ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی، به دلیل ازدیاد حضور عوامل هیدروکسیل در واکنش، احتمال انتقال هیدروژن به رادیکال آزاد و در نتیجه توانایی مهارکنندگی عصاره مربوط به اندام مربوطه افزایش می­یابد. با توجه به وجود مقدار فلاونوئید بیش­تر نسبت به فنول در گل خاکشیر، این خاصیت مهارکنندگی و پاکسازی رادیکال­های آزاد بیش­تر مربوط به فلاونوئید باشد. این قضیه در مورد برگ شاه­تره عکس می­باشد چون در برگ شاه­تره میزان فنول بیش­تر است. نتایج آنالیز واریانس درصد احیاء DPPH برای غلظت­های مختلف عصاره هگزانی اندام­های هوایی دو گیاه و هم­چنین اسید آسکوربیک به عنوان کنترل مثبت، نشان داد که نوع و غلظت اندام­های هوایی دو گیاه تأثیر معنی­داری در به دام اندازی رادیکال آزاد DPPH دارند. بررسی­های آماری نشان داد که خاصیت آنتی­اکسیدانی عصاره­های هگزانی اندام­های هوایی دو گیاه در مقایسه با اسید آسکوربیک اختلاف معنی­داری دارند (001/0 P =).

با توجه به نتایج به دست آمده، عصاره هگزانی گل گیاه خاکشیر و برگ گیاه شاه­تره دارای میزان بالاتری از فنول و فلاونوئید تام در مقایسه با سایر اندام­ها بودند و شاید بتوان گفت که فعالیت آنتی­اکسیدانی این گیاهان مربوط به ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی موجود در این اندام­ها است. با توجه به مقادیر EC50 به دست آمده برای اندام­های هوایی دو گیاه، می­توان نتیجه گرفت که مقدار EC50 گل خاکشیر و برگ شاه­تره نسبت به سایر اندام­های هوایی کم­تر می­باشد و شاخص RSA برای این دو اندام از بقیه اندام­ها بیش­تر بود و این نشان می­دهد که توانایی پاکسازی رادیکال آزاد بیش­تری دارند. این شاخص­ها (EC50 و RSA) نشان می­دهند که این دو اندام نسبت به اندام­های دیگر، در غلظت­های پایین می­توانند رادیکال­های آزاد DPPH بیش­تری را مهار کنند و بنابراین فعالیت آنتی­اکسیدانی قابل توجهی نسبت به سایر اندام­ها دارند. روند تغییرات مقدار EC50 در اندام­های مورد مطالعه این دو گیاه به صورت: برگ خاکشیر > گل شاه­تره > برگ شاه­تره > گل خاکشیر و روند تغییرات شاخص RSA نیز در اندام­های مورد مطالعه این دو گیاه به صورت: گل خاکشیر > برگ شاه­تره > گل شاه­تره > برگ خاکشیر می­باشد. بنابراین هر دو شاخص حکایت از توان بالای میزان پاکسازی رادیکال آزاد توسط عصاره گل خاکشیر و برگ شاه­تره دارد.

باتوجه به نتایج به دست آمده از آنالیز واریانس مشاهده می­شود که در هر دو تست ارزیابی توان آنتی­اکسیدانی (DPPH و قدرت احیاء آهن)، اختلافات مربوط به هریک از اندام­ها معنی­دار بودند (05/0>P). به گونه­ای که در تست توان احیاء­کنندگی آهن مشاهده شد که قدرت احیاء­کنندگی تمام اندام­های هوایی در دو گیاه، با افزایش غلظت زیاد می­شود. قدرت احیاء­کنندگی آهن در گل خاکشیر در غلظت­های پایین بیش­تر از اندام­های دیگر بود در حالی که در غلظت­های بالا قدرت احیاء­کنندگی آهن در برگ شاه­تره بیش­تر از بقیه اندام­ها بود. بر طبق آنالیز واریانس داده­های حاصل از تست احیاء آهن، مقادیر در آزمون توانایی احیاء­کنندگی تا سطح 001/0 معنی­دار هستند. در تمام تست­ها مشاهده شد که گل خاکشیر و برگ شاه­تره به دلیل درصد فنول و فلاونوئید بالا، فعالیت مهارکنندگی DPPH بالا و هم­چنین خاصیت احیاکنندگی آهن بالایی داشتند.

با تکیه بر نتایج حاصل از این پژوهش می­توان نتیجه گرفت که عصاره هگزانی گل خاکشیر و برگ شاه­تره در مقایسه با سایر اندام­های دو گیاه درجات بالایی از خاصیت آنتی­اکسیدانی بوده و محتوای فنل و فلاونوئید بالایی از خود نشان می‏دهند. در نتیجه پس از انجام تستهای تکمیلی می­توانند به عنوان منابع مفید افزودنی و مکمل غذایی در تأمین آنتی‏اکسیدان­های طبیعی بدن مورد استفاده قرارگیرند.

تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله مراتب سپاس و قدردانی خود را از تمامی همکاران و مسئولین دانشکده علوم دانشگاه کردستان به جهت فراهم نمودن شرایط و امکانات انجام این پژوهش ابراز می‌نمایند.

1-      Afshari, M., Rahimmalek, M., and Miroliaei, M., 2018. Variation in polyphenolic profiles, antioxidant and antimicrobial activity of different Achillea species as natural sources of antiglycative compounds. Chemistry & biodiversity, 15:8, e 1800075.

2-      Alam, M. S., Kaur, G., Jabbar, Z., Javed, K., and Athar, M., 2007. Eruca sativa seeds possess antioxidant activity and exert a protective effect on mercuric chloride induced renal toxicity, Food and chemical toxicology, 45(6), PP: 910-920.

3-      Barbaro, B., Toietta, G., Maggio, R., Arciello, M., Tarocchi, M., Galli, A., and Balsano, C., 2014. Effects of the olive-derived polyphenol oleuropein on human health. International journal of molecular sciences, 15(10), PP:18508-18524.

4-      Basak, S. S., and Candan, F., 2013. Effect of Laurus nobilis L. essential oil and its main components on α-glucosidase and reactive oxygen species scavenging activity. Iranian journal of pharmaceutical research, IJPR, 12(2), PP: 367-379.

5-      Chang, C. C., Yang, M. H., Wen, H. M., and Chern, J. C., 2002. Estimation of total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric methods. Journal of food and drug analysis 10(3), 178-182.

6-      Chang, T. S., 2009. An updated review of tyrosinase inhibitors. International journal of molecular sciences 10(6), PP: 2440-2475.

7-      Chung, Y. C., Chien, C. T., Teng, K. Y.,  and Chou, S. T., 2006. Antioxidative and mutagenic properties of Zanthoxylum ailanthoides Sieb and zucc, Food Chemistry 97(3), PP: 418-425.

8-      Di Meo, F., Lemaur, V., Cornil Jrm, Lazzaroni, R., Duroux, J. L., Olivier, Y.,  and Trouillas, P., 2013. Free radical scavenging by natural polyphenols: atom versus electron transfer, The Journal of Physical Chemistry A, 117(10), PP: 2082-2092.

9-      Dillard, C. J., and German, J. B., 2000. Phytochemicals: nutraceuticals and human health, Journal of the Science of Food and Agriculture 80(12), PP: 1744-1756.

10-   Fu, R., Zhang, Y., Guo, Y., and Chen, F., 2014. Antioxidant and tyrosinase inhibition activities of the ethanol-insoluble fraction of water extract of Sapium sebiferum (L.) Roxb. leaves. South African Journal of Botany, 93, PP: 98-104.

11-   Ghasemzadeh, A., and Ghasemzadeh, N., 2011. Flavonoids and phenolic acids: Role and biochemical activity in plants and human. Journal of medicinal plants research, 5(31), PP: 6697-6703.

12-   Golalikhani, M., Khodaiyan, F., and Khosravi, A., 2014. Response surface optimization of mucilage aqueous extraction from flixweed (Descurainia sophia) seeds. International journal of biological macromolecules, 70, PP: 444-449.

13-   Halliwell, B., and Gutteridge, J. M., 2015. Free radicals in biology and medicine: Oxford University Press, USA.

14-   Hinneburg, I., Dorman, H. D., and Hiltunen, R., 2006. Antioxidant activities of extracts from selected culinary herbs and spices. Food chemistry, 97(1), PP: 122-129.

15-   Jayaprakasha, G., and Patil, B. S., 2007. In vitro evaluation of the antioxidant activities in fruit extracts from citron and blood orange, Food Chemistry 101(1), PP: 410-418.

16-   Jiang, J., Xiong, Y. L., 2016. Natural antioxidants as food and feed additives to promote health benefits and quality of meat products: A review. Meat science, 120, PP: 107-117.

17-   Lee, Y. J., Kim, N. S., Kim, H., Yi, J. M., Oh, S. M., Bang, O. S., and Lee, J., 2013. Cytotoxic and anti-inflammatory constituents from the seeds of Descurainia sophia. Archives of pharmacal research 36(5), PP: 536-541.

18-   - Lundebye, A. K., Hove, H., Måge, A., Bohne, V., and Hamre, K., 2010. Levels of synthetic antioxidants (ethoxyquin, butylated hydroxytoluene and butylated hydroxyanisole) in fish feed and commercially farmed fish. Food Additives & Contaminants: Part A 27(12), PP: 1652-1657.

19-   Mandal, U., Ali, K. M., Chatterjee, K., De, D., Biswas, A., and Ghosh, D., 2014. Management of experimental hypochlorhydria with iron deficiency by the composite extract of Fumaria vaillantii L. and Benincasa hispida T. in rat. Journal of natural science, biology, and medicine 5(2)  397 p.

20-   Mandal, U., Nandi, D., Chatterjee, K., Biswas, A., and Ghosh, D., 2010. Remedial effect of aqueous extract of whole plant of Fumaria vaillantii Loisel and ripe fruit of Benincasa hispida Thunb in ranitidine induced-hypochlorhydric male rat. International Journal of Applied Research in Natural Products 3(1), PP: 37-47.

21-   Mathew, S., and Abraham, T. E., 2006. In vitro antioxidant activity and scavenging effects of Cinnamomum verum leaf extract assayed by different methodologies. Food and Chemical Toxicology 44(2), PP:198-206.

22-   McDonald, S., Prenzler, P. D., Antolovich, M., and Robards, K., 2001. Phenolic content and antioxidant activity of olive extracts, Food chemistry 73(1), PP: 73-84.

23-   Mishra, K., Ojha, H., and Chaudhury, N. K., 2012. Estimation of antiradical properties of antioxidants using DPPH assay: A critical review and results. Food chemistry 130(4), PP: 1036-1043.

24-   Molyneux, P., 2004. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J Sci Technol 26(2), PP: 211-219.

25-   Noguchi, N., and Niki, E., 2000. Phenolic antioxidants: A rationale for design and evaluation of novel antioxidant drug for atherosclerosis. Free Radical Biology and Medicine 28(10), PP: 1538-1546.

26-   Pietta, P. G., 2000. Flavonoids as antioxidants. Journal of natural products 63(7), PP:1035-1042.

27-   Rajopadhye, A. A., and Upadhye, A. S., 2011. Botanical and phytochemical standardization of Fumaria vaillantii Loisel.

28-   Shah, M. A., Bosco, S. J. D., and Mir, S. A., 2014. Plant extracts as natural antioxidants in meat and meat products. Meat science 98(1), PP: 21-33.

29-   Shahidi, F., and Naczk, M., 1995. Food phenolics: Technomic Pub. Co.

30-   Souri, E., Amin, G., and Farsam, H., 2008. Screening of antioxidant activity and phenolic content of 24 medicinal plant extracts. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences 16(2), PP: 83-87.

31-   Speakman, J. R., and Selman, C., 2011. The free‐radical damage theory: accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. Bioessays 33(4), PP: 255-259.

32-   Vural, C., 2009. A new combination in Descurainia (Brassicaceae) from Turkey; BioOne, PP: 65-66.

33-   Waraho, T., McClements, D. J., and Decker, E. A., 2011. Mechanisms of lipid oxidation in food dispersions. Trends in Food Science & Technology, 22(1), PP: 3-13.

34-   Yen, G. C., and Chen, H. Y., 1995. Antioxidant activity of various tea extracts in relation to their antimutagenicity. Journal of Agricultural and Food Chemistry 43(1), PP: 27-32.