نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه علوم گیاهی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شهرکرد، ایران
2 دانشجوی دکترای فیزیولوژی گیاهی گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه شاهد، تهران، ایران
3 عضو هیئت علمی دانشگاه شهرکرد
چکیده
اخیرا پیشتیمار دانهها با لیزر هلیوم – نئون به عنوان یکی از ایمنترین شیوههای تقویت جوانهزنی دانه ، رشد دانهرست و افزایش مقاومت گیاهان به تنشها، علاقه جامعه علمی را به خود جلب کرده است. در این مطالعه، اثر لیزر بر شاخصهای جوانهزنی بذر گیاه خارمریم (Silybum marianum L.) در شرایط نرمال و تحت تنش سرب بررسی گردید. ابتدا اثر غلظتهای مختلف نیترات سرب (0، 125، 250، 500 و 1000 ppm ) بر جوانهزنی نسبی، شاخص مقاومت ریشه و شاخص تحمل جوانهزنی دانههای خارمریم در یک آزمایش با طرح کاملا تصادفی ارزیابی شد. نتایج نشان داد که ppm 125 نیترات سرب، اثر معنیداری بر درصد جوانهزنی دانه و رشد ریشه نداشت، اما غلظتهای بالاتر پارامترهای فوق الذکر را کاهش داد. دومین آزمایش، اثر لیزر هلیوم – نئون با توانهای مختلف ( 5، 10 و 15 میلیوات) و مدت زمانهای متفاوت ( 0، 5، 10، 20 و 40 دقیقه) بر جوانهزنی بذر در یک آزمایش فاکتوریل با طرح کاملا تصادفی، بیشترین سرعت جوانهزنی، انرژی جوانهزنی، طول دانهرست و بنیه طولی را با تابش 10 میلیوات به مدت 20 دقیقه نشان داد. در سومین آزمایش، اثر متقابل مدت تابش لیزر هلیوم – نئون با توان 10 میلیوات (0، 20 و 40 دقیقه) و غلظتهای نیترات سرب (0، 250 و 500 ppm) در یک آزمایش فاکتوریل با طرح کاملا تصادفی نشان داد، لیزر هلیوم – نئون با یک الگوی وابسته به دوز، جوانهزنی بذر، فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز و رشد دانهرست را در هر دو شرایط با و بدون تنش سرب بهبود بخشید.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The effect of laser pretreatment on seed germination indices and α-amylase activity and growth of Silybum marianum L. seedling in normal condition and under Pb stress
نویسندگان [English]
1 Department of plant science, Faculty of Science, University of Shahrekord, Iran
2 Department of plant science, Faculty of Science, University of Shahrekord, Iran
3 Faculty Member of Shahrekord University
چکیده [English]
Recently, seed pre-treatment with helium-neon laser as one of the safest methods for enhancing seed germination, seedling growth and increasing stress tolerance of plants attracted the keen interest of scientific community. Therefore, in this study the effect of laser was investigated on the germination indices of Silybum marianum L. at normal condition and under Pb stress. The first, effect of various concentrations of lead nitrate (0, 125, 250, 500 and 1000 ppm) were evaluated on relative seed germination, root resistance index and germination tolerance index of Silybum marianum seeds at a completely randomize design. The results showed that 125 ppm lead nitrate had no significant effect on seed germination and root growth, but higher concentrations reduced above-mentioned parameters. Second experiment, the effect of various powers (5, 10 and 15 mW) and different times (0, 5, 10, 20, and 40 minutes) of He–Ne laser radiation on seed germination at a factorial experiment with completely randomize design showed that the maximum seed germination percentage, germination velocity, germination energy, seedling length and vigor index were obtained by He–Ne laser irradiation with 10 mW power for 20 min. In the third experiment, the interactive effect of irradiation times (0, 20 and 40 minutes) He–Ne laser with 10 mW power and lead nitrate concentrations (0, 250 and 500 ppm) was assessed at a factorial experiment with completely randomize design showed that He–Ne laser increased seed germination percentage, α-amylase activity and seedlings growth at a dose-dependent pattern at both with and without pb stress conditions.
کلیدواژهها [English]
اثر پیشتیمار لیزر بر شاخصهای جوانهزنی دانه، فعالیت آلفا آمیلاز و رشد دانهرست
خار مریم (L.marianumSilybum) در شرایط نرمال و تحت تنش سرب
عاطفه بنی شریف1،2* و ریحانه عموآقایی3
۱ ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم پایه، گروه علوم گیاهی
2 ایران، تهران، دانشگاه شاهد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی
3 ایران، شهرکرد، پژوهشکده زیست فناوری شهرکرد، گروه علوم گیاهی
تاریخ دریافت: 18/9/96 تاریخ پذیرش: 2/3/97
چکیده
اخیراً پیشتیمار دانهها با لیزر هلیوم – نئون بعنوان یکی از ایمنترین شیوههای تقویت جوانهزنی دانه، رشد دانهرست و افزایش مقاومت گیاهان به تنشها، علاقه جامعه علمی را به خود جلب کرده است. در این مطالعه، اثر لیزر بر شاخصهای جوانهزنی بذر گیاه خارمریم (Silybum marianum L.) در شرایط نرمال و تحت تنش سرب بررسی گردید. ابتدا اثر غلظتهای مختلف نیترات سرب (0، 125، 250، 500 و 1000 ppm) بر جوانهزنی نسبی، شاخص مقاومت ریشه و شاخص تحمل جوانهزنی دانههای خارمریم در یک آزمایش با طرح کاملاً تصادفی ارزیابی شد. نتایج نشان داد که ppm 125 نیترات سرب، اثر معنیداری بر درصد جوانهزنی دانه و رشد ریشه نداشت، اما غلظتهای بالاتر پارامترهای فوقالذکر را کاهش داد. دومین آزمایش، اثر لیزر هلیوم – نئون با توانهای مختلف (5، 10 و 15 میلیوات) و مدت زمانهای متفاوت (0، 5، 10، 20 و 40 دقیقه) بر جوانهزنی بذر در یک آزمایش فاکتوریل با طرح کاملاً تصادفی، بیشترین سرعت جوانهزنی، انرژی جوانهزنی، طول دانهرست و بنیه طولی را با تابش 10 میلیوات بمدت 20 دقیقه نشان داد. در سومین آزمایش، اثر متقابل مدت تابش لیزر هلیوم – نئون با توان 10 میلیوات (0، 20 و 40 دقیقه) و غلظتهای نیترات سرب (0، 250 و 500 ppm) در یک آزمایش فاکتوریل با طرح کاملاً تصادفی نشان داد، لیزر هلیوم – نئون با یک الگوی وابسته به دوز، جوانهزنی بذر، فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز و رشد دانهرست را در هر دو شرایط بدون تنش سرب بهبود بخشید.
واژههای کلیدی: تنش سرب، گیاه خارمریم، لیزر، جوانهزنی، رشد
* نویسنده مسئول، تلفن: 03832232112 ، پست الکترونیکی: atefehbanisharif@gmail.com
مقدمه
سرب یکی از آلایندههای رایج زیستمحیطی و دومین فلز سمی خطرناک است که از طریق صنایع فلزکاری، احتراق گازوئیل، پسابهای صنعتی و کودهای شیمیایی به خاک، آب، اتمسفر و سرانجام به پیکره گیاهان وارد میشود و بهطور گسترده اثرات سمی مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی را در آنها بر جای میگذارد. تحقیقات نشان داده است که سمیت سرب، جوانهزنی دانهها را مهار مینماید، رشد دانهرستها را به تأخیر میاندازد و طول ساقه و ریشه، شاخص مقاومت و وزن خشکریشه و ساقه را کاهش میدهد (41 و 47).
تحقیقات نشان داده است که تیمار سرب موجب کاهش درصد جوانهزنی، طول ریشه و ساقه، سطح برگ، ارتفاع گیاه، میزان کلروفیل و افزایش در فعالیت آنزیمهای کاتالاز و پراکسیداز در گیاه اطلسی شد (4). سمیت سرب، رشد گیاه، طویل شدن ریشه، جذب و انتقال مواد غذایی، تولید کلروفیل، تقسیم سلولی و سازماندهی تیلاکوئیدهای کلروپلاست را تحت تأثیر قرار میدهد (50). کاهش رشد ممکن است مرتبط با مهار شاخصهای میتوزی در هنگام تیمار با فلزات سنگین نظیر سرب و کادمیوم باشد (49). علاوه براین نشان داده شده است که سمیت فلز سنگین سرب، موجب تورم میتوکندری، از بین رفتن کریستالهای میتوکندری، واکوئولیزه شدن شبکه آندوپلاسمی و دیکتیوزوم و صدمه غشای پلاسمایی در سلولهای ریشه سیر شد و در نتیجه نمو دانهرستها را محدود نمود (26).
در دهههای گذشته، کشف و کاربرد بسیاری از مواد شیمیایی برای بهبود باروری و کیفیت گیاهان زراعی، کنترل آفات و مقاومت گیاهان نسبت به تنشهای غیرزیستی، باعث انقلابی در بخش کشاورزی شده است. اما در سالهای اخیر تحقیقات نشان داده است که کاربرد روزافزون مواد شیمیایی باعث کاهش مقاومت گیاه، تغییر ساختار خاک و تغییر بازده محصولات میشود. از سوی دیگر این مواد شیمیایی پس از نفوذ به پیکره گیاه وارد زنجیرههای غذایی شده و بر سلامت انسان تأثیر سوء میگذارند. از اینرو، در سالهای اخیر، استفاده از تکنیکهای بیوفیزیکی در کشاورزی بعنوان یک شیوه سالمتر نسبت به تیمارهای شیمیایی مورد توجه محققان قرارگرفته است. یکی از بهترین تیمارهای بیوفیزیکی، پیش تیمار دانهها با امواج الکترومغناطیسی لیزر پیوسته هلیم-نئون است (48).
تحقیقات متعددی نشان داده است که نور لیزر باعث افزایش انرژی دانهها، بلوغ جنین دانه و تشدید تبادل مواد غذایی و افزایش مقاومت به آفات و بیماریها در گیاهان میشود و جوانهزنی، حجم ریشه و بخشهای هوایی و کیفیت محصولات را افزایش میدهد (13و 48). ابراهیمزاده ابریشمی و عباسی (1) گزارش کردند نور لیزر، میزان و سرعت جوانهزنی بذر ارقام گندم و همچنین طول، وزنتر ریشهچه و ساقهچه، تعداد گیاهچه را بطور معنیداری افزایش داد. بررسی اثر تیمار نوری لیزر و اسید جیبرلیک بر میزان جوانهزنی بذر گیاه دارویی مریم گلی نشان داد که تیمار لیزر میتواند جایگزین مناسبی برای تیمارهای شیمیایی در تسریع جوانهزنی بذر این گیاه باشد (2). میرشکاری و صیامی (8) نیز دریافتند که تابش لیزر موجب بهبود جوانهزنی، رشد اولیه و شاخصهای دارویی گیاه بارهنگ سرنیزهای (Plantago lanceolata) شد و میانگین زمان لازم، برای رسیدن به 50 درصد جوانهزنی را در حد معنیداری کاهش داد. تحقیق دیگری نشان داد که پیشتیمار دانههای سویا با لیزر با طولموج 532 نانومتر، جوانهزنی و طول دانهرستهای سویا را افزایش داد. تابش نوری لیزر با توان 15 و مدتزمان 5 دقیقه در سویا، متابولیسم گیاه را تغییر داد و موجب افزایش تولید نشاسته و ساکارز و اسیدهای بنزنی شد. همچنین افزایش فعالیت آنزیم فنیل آلانینآمونیالیاز، باعث افزایش ایزوفلاوونها در لپه و دانهرستهای سویا شد (46).
در مورد مکانیسم عمل تابش لیزر برای افزایش جوانهزنی بذر و رشد دانهرست گیاهان پیشنهاد شده است که احتمالاً فعالیت فتودینامیکی نور و یا انرژی لیزر هلیوم – نئون، جوانهزنی دانهها را تسریع نموده است. در واقع بدلیل حساس بودن فیتوکرومها به نور قرمز، با پرتودهی لیزر هلیوم-نئون فعالیت آنزیمهای مرتبط با جوانهزنی مانند آمیلازها و همچنین انرژی درونی و آنتروپی طی جوانهزنی افزایش مییابد. نور لیزر تعادل انرژی جوانهزنی بذر را میشکند و در نتیجه تبادل انرژی بیشتری بین بذر و محیط اطراف صورت میگیرد (22). تابش نوری لیزر در بهبود فعالیت آلفا آمیلاز مؤثر است و رادیکالهایی که خواب دانه را القا مینمایند، را بیاثر مینماید و به همین دلیل، درصد جوانهزنی و بنیه دانهها را بهبود میبخشد (33 و 42).
علاوه براین تحقیقات مختلف نشان دادهاند که پیشتیمار دانهها با لیزر، دانهرستها را در مقابل تنشهای مختلف ازجمله خشکی (52)، شوری (6و20) وUV-B (12) حفاظت مینماید. حسین زاده ثابتی و همکاران (5) گزارش نمودند که لیزر هلیوم-نئون با توان 3/3 میلیوات بمدت 30 دقیقه، اثرات شوری بر مورفولوژی، فیزیولوژی و فرایندهای بیوشیمیایی را تعدیل کرد و باعث افزایش عملکرد ارقام مورد بررسی برنج تحت تیمارهای شوری شد.
مطابق با بررسی منابع ما، تأثیر لیزر هلیم- نئون بر جوانهزنی و رشد اولیه گیاهان دارویی تاکنون بررسی نشده است. لذا پژوهش حاضر برای بررسی تأثیر لیزر هلیم- نئون بر جوانهزنی و رشد اولیه گیاه خارمریم در شرایط نرمال و تحت تنش سرب طراحی شد. خارمریم یکی از گیاهان دارویی معروف جهت درمان اختلالات کبدی و صفراوی محسوب میشود. 80 درصد فلاونوئیدهای این گیاه خاصیت آنتیاکسیدانی داشته و برای تنظیم متابولیسم بدن مفید میباشد و در درمان انواع بیماریهای کبدی، قلبی و سرطان مؤثر است. ماده مؤثره این گیاه موسوم به سیلیمارین در درمان سرطان، قابلیت تکثیر سلولها را کاهش داده و از رشد تومورها جلوگیری مینماید (34). علیرغم ارزش و اهمیت دارویی این گیاه اثر تنش فلزات سنگین بر مراحل رشد این گیاه بندرت بررسی شده است. با توجه به اطلاعات فوق چنین فرض شد که احتمالاً لیزر میتواند بعنوان یک روش بیوفیزیکی که نسبت به تیمارهای شیمیایی برتری دارد، برای بهبود جوانهزنی این گیاه تحت تنش سرب مورد استفاده قرار گیرد و پژوهش حاضر در جهت بررسی این فرضیه اجرا شد.
مواد و روشها
در این پژوهش 3 آزمایش به شرح زیر انجام شد: تأثیر غلظتهای مختلف نیترات سرب بر جوانهزنی بذر و رشد دانهرست: در اولین آزمایش، غلظتی از فلز سنگین سرب که در آن جوانهزنی بذر و رشد دانهرست خارمریم تحت تأثیرات منفی قرار میگیرد، تعیین شد. برای این منظور دانههای خارمریم با هیپوکلریت سدیم 15 درصد بمدت 5 دقیقه استریل شد و با آب مقطر 2 بار شسته شد. بذرهای ضدعفونی شده خارمریم روی کاغذ صافی در درون پتری دیشها چیده شدند و در یک آزمایش ساده با طرح کاملاً تصادفی با 5 تکرار، تأثیر هرکدام از غلظتهای متفاوت نیترات سرب (125، 250، 500 و 1000ppm ) بر روی جوانهزنی و رشد دانهرست مطالعه شد. دانههای شاهد نیز با آب مقطر تیمار شدند. درصد جوانهزنی نسبی، درصد شاخص مقاومت ریشه و شاخص تحمل جوانهزنی با استفاده از رابطههای زیر محاسبه شد (16).
رابطه1
جوانهزنی نسبی بذر = 15طھغŒظ…ط§ط± ط²ط¯ظ‡طظˆط§ظ†ظ‡ ط¨ط°ط±ظ‡ط§غŒ طھط¹ط¯ط§ط¯ط´ط§ظ‡ط¯ ط²ط¯ظ‡ طظˆط§ظ†ظ‡ ط¨ط°ط±ظ‡ط§غŒ طھط¹ط¯ط§ط¯"> ×100
رابطه2
) درصد شاخص مقاومت ریشهRTI (= 15طھغŒظ…ط§ط± ط¯ط± ط±غŒط´ظ‡ ط·ظˆظ„ط´ط§ظ‡ط¯ ط¯ط± ط±غŒط´ظ‡ ط·ظˆظ„"> × 100
رابطه 3
شاخص جوانهزنی )GI( = 15ط±غŒط´ظ‡ ظ…ظ‚ط§ظˆظ…طھ ط´ط§ط®طµ ط¯ط±طµط¯ أ—ط¨ط°ط± ظ†ط³ط¨غŒ ط²ظ†غŒ طظˆط§ظ†ظ‡100">
اثر سطوح مختلف تابش لیزر بر جوانهزنی بذر و رشد دانهرست: در دومین آزمایش مدتزمانی از تابش لیزر که در آن جوانهزنی بذر خارمریم در شرایط نرمال تقویت میشود، تعیین شد. بذرهای گیاه خارمریم در یک آزمایش فاکتوریل با طرح کاملاً تصادفی با 5 تکرار در معرض تابش لیزر با شدت 5، 10 و 15 میلیوات در بازه زمانیهای 5، 10، 20 و 40 دقیقه قرارگرفته و حد مورد نظر تعیین شد. بمنظور تیمار از دستگاه لیزر هلیوم ـ نئون مدل No. MSHN5-A-B450MM با توانهای مختلف و طولموج 650 نانومتر استفاده شد. تابش بذرها در اتاق تاریک بمنظور تأثیر بهتر انجام گرفت. لازم بذکر است که بذرها قبل از تیمار با نور لیزر 12 ساعت در آب استریل خیسانده شدند. سپس سطح دانهها خشک شد و بر روی کاغذ صافی مرطوب قرارگرفتند. در ضمن در هر بار استفاده، توان لیزر با استفاده از پاورمتر مدل LLM-3 آزموده شد. بذرها در پتریدیشها در انکوباتور (مدل GC-1000) تحت دمای 25 درجه سانتیگراد قرار داده شدند و بمدت 10 روز بطور روزانه تعداد بذرهای جوانهزده شمارش شدند و شاخصهای جوانهزنی مورد ارزیابی قرار گرفت. درصد جوانهزنی نهایی بصورت درصد کل دانههای جوانهزده در هر تیمار بعد از 10 روز و انرژی جوانهزنی بصورت درصد جوانهزنی بذرها در روز سوم بعد از کاشت تعیین شد (15). سرعت جوانهزنی از رابطه 4 محاسبه گردید که در این رابطه n تعداد بذور جوانهزده تا زمان t و t تعداد روز تا شمارش مورد نظر میباشد (15).
رابطه 4 = (n/t) GR
و بنیه طولی دانهرست مطابق فرمول زیر محاسبه شد (15).
رابطه 5
(مجموع طول ریشهچه و ساقهچه) × جوانهزنی نهایی= بنیه طولی
اثر برهمکنش نیترات سرب و لیزر بر جوانهزنی بذر و رشد دانهرست: اثرات تابش لیزر بر کاهش اثرات منفی فلز سنگین سرب بر جوانهزنی و رشد دانهرست خارمریم در یک آزمایش بصورت فاکتوریل با طرح کاملاً تصادفی و در 5 تکرار تعیین گردید. برای این منظور بذرهای ضدعفونی شده در پتری دیشهای حاوی کاغذ صافی مرطوب تحت سه سطح تابش (شاهد)، 0،20 دقیقه و 40 دقیقه لیزر هلیوم ـ نئون با شدت 10 میلیوات قرارگرفتند. سپس آب مقطر (شاهد) یا محلول نیترات سرب با دو غلظت 250 و ppm500 مطابق طرح آماری به پتریها اضافه گردید. لازم بذکر است برای هر تیمار 3 تکرار در نظر گرفته شد. درصد جوانهزنی بذرها و وزنتر و خشک دانهرست بعد از ده روز محاسبه گردید. بعد از اندازهگیری طول ریشه توسط خطکش و وزنتر دانهرستها توسط ترازو، برای اندازهگیری وزن خشک، دانهرستهای مربوط به هر تیمار را داخل پاکتهای کاغذی مخصوص گذاشته و سپس در آون در دمای 60 درجه بمدت 48 ساعت خشک شدند. همچنین فعالیت آمیلاز بذرهای در حال جوانهزنی (24 ساعت پس از تابش لیزر) به شرح زیر اندازهگیری شد.
اندازهگیری آنزیم آلفا آمیلاز : بطور خلاصه، 1 گرم دانههای جوانهزده در 10 میلیلیتر آب مقطر سرد در دمای 4 درجه سانتیگراد و با کمک دسته و هاونی که در یک فریزر از قبل سرد شده بودند، له شدند. سپس عصاره حاصل در دورrpm 15000 بمدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. روشناور برای اندازهگیری فعالیت آلفا آمیلاز بکار برده شد. جهت اندازهگیری آنزیم آلفا آمیلاز ابتدا ٥/٠میلیلیتر محلول نشاسته (٢٠میلیگرم در یک میلیلیتر فسفات پتاسیم (7PH=) به داخل لولهآزمایش منتقل شد. سپس ٥/٠ میلیلیتر عصاره حاوی آنزیم آلفا آمیلاز به آن اضافه شده و بعد از ٣٠ دقیقه انکوباسیون در ٣٧ درجه سانتیگراد بوسیله یک میلیلیتر اسید هیدروکلریک یک نرمال واکنش را متوقف نموده و در ادامه یک میلیلیتر از معرف ید به آن اضافه شد. پسازآن حجم محتوی لوله را با آب مقطر به حدود 10 میلیلیتر رسانده و میزان جذب رنگ را با استفاده از اسپکتروفتومتر در طولموج 620 نانومتر خوانده و با نمونه شاهد (محلول نشاسته و ید بدون افزودن آنزیم) مقایسه شد (53).
آنالیز آماری دادهها توسط نرمافزار SAS و رسم نمودارها توسط برنامه Excel انجام شد. مقایسه اختلاف بین میانگینها نیز توسط آزمون چند دامنهای دانکن و در سطح احتمال 05/0 P <انجام گرفت.
نتایج
تأثیر غلظتهای مختلف نیترات سرب بر جوانهزنی و رشد دانهرست گیاه خارمریم : مقایسه میانگین جوانهزنی نسبی در بین تیمارها نشان داد، سرب با غلظت 125، 250، 500 و ppm 1000 بترتیب جوانهزنی نسبی را 48/4%، 50/23%، 90/52 % و 82/80 % (شکل1- الف)، شاخص مقاومت ریشه را 81/0%، 63/17%، 53/41 % و 55/63 % (شکل1 - ب) و شاخص تحمل جوانهزنی (شکل 1 - ج) را 01/5%، 02/37%، 53/72% و 23/93% کاهش داد. اختلاف جوانهزنی نسبی، شاخص مقاومت ریشه و شاخص تحمل جوانهزنی در غلظت ppm 125 با شاهد معنیدار نبود اما سایر غلظتها با شاهد اختلاف معنیداری داشتند.
شکل 1- تأثیر غلظتهای مختلف نیترات سرب بر جوانهزنی نسبی (الف)، شاخص مقاومت ریشه (ب) و شاخص تحمل جوانهزنی (ج)
حروف یکسان نشاندهنده عدم تفاوت معنیدار بین تیمارها بر طبق آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد
میباشد.
تأثیر توانهای مختلف و مدت تابش لیزر بر جوانهزنی و رشد دانهرست خارمریم: مقایسه میانگینها در بین تیمارها نشان داد 5 ، 10، 20 و 40 دقیقه تابش با توان 5 میلیوات، اثرات مشابهی بر درصد جوانهزنی نهایی (شکل 2- الف) داشتند و بطور معنیداری جوانهزنی نهایی را نسبت به شاهد افزایش دادند. بیشترین اثرات معنیدار لیزر با توان 5 میلیوات بر انرژی جوانهزنی (شکل2 - ب) و سرعت جوانهزنی (شکل 2 - ج) در 20 و 40 دقیقه تابش بدست آمد. 5 ، 10، 20 و 40 دقیقه تابش با توان 10 میلیوات بطور معنیداری درصد جوانهزنی نهایی (شکل 2- الف)، انرژی جوانهزنی (شکل2- ب) و سرعت جوانهزنی (شکل 2 - ج) را نسبت به شاهد افزایش داد.
شکل2- تأثیر توان (5، 10 و 15 میلیوات) و مدت تابش لیزر هلیوم-نئون (0، 5، 10، 20 و 40 دقیقه) بر درصد جوانهزنی (الف)، انرژی جوانهزنی (ب) و سرعت جوانهزنی (ج) دانهرست خارمریم
حروف یکسان نشاندهنده عدم تفاوت معنیدار بین تیمارها بر طبق آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد میباشد.
تابش نوری لیزر با توان 10 میلیوات بمدت 20 دقیقه بهترین اثر را بر انرژی جوانهزنی داشت و انرژی جوانهزنی را 02/68 % نسبت به شاهد افزایش داد اما اثر 40 دقیقه تابش با توان 10 میلیوات بر انرژی جوانهزنی در حد معنیداری کمتر از تیمار 20 دقیقه بود. درحالیکه اثر تابش نوری لیزر با توان10 میلیوات بمدت 10، 20 و40 دقیقه بر جوانهزنی نهایی و بمدت 20 و40 دقیقه بر سرعت جوانهزنی، تفاوت معنیداری با یکدیگر نداشتند. 5، 10 و 20 دقیقه تابش با توان 15 میلیوات، بطور معنیداری درصد جوانهزنی نهایی (شکل 2- الف )، انرژی جوانهزنی (شکل2 - ب ) و سرعت جوانهزنی (شکل2 - ج) را نسبت به شاهد افزایش داد اما 40 دقیقه تابش با توان 15 میلیوات، هر سه پارامتر را نسبت به شاهد بطور معنیداری کاهش داد. درمجموع بیشترین اثرات معنیدار لیزر بر درصد جوانهزنی نهایی (شکل 2- الف) انرژی جوانهزنی (شکل2 - ب ) و سرعت جوانهزنی (شکل 2 - ج) در تابش با توان 10 میلیوات بمدت 20 دقیقه بدست آمد.
همچنین مقایسه میانگینها در بین تیمارها نشان داد 10، 20 و 40 دقیقه تابش با توان 5 میلیوات، بطور مشابه و معنیداری طول دانهرست (شکل3 - الف) و بنیه طولی (شکل 3 - ب) را نسبت به شاهد افزایش دادند. تابش با توان 10 میلیوات بمدت 5، 10 و 20 دقیقه نیز بطور معنیداری طول دانهرست و بنیه طولی را نسبت به شاهد افزایش دادند. اثر 40 دقیقه تابش با توان 10 میلیوات، بر پارامترهای فوق در حد معنیداری کمتر از تیمار 20 دقیقه اما بالاتر از تیمار شاهد بود. 5، 10 و 20 دقیقه تابش با توان 15 میلیوات، بطور معنیداری طول دانهرست (شکل3 - الف) و بنیه طولی (شکل 3 - ب) را نسبت به شاهد افزایش دادند اما 40 دقیقه تابش با توان 15 میلیوات، دو پارامتر مذکور را نسبت به شاهد بطور معنیداری کاهش داد. در مجموع تابش نوری لیزر با توان 10 میلیوات بمدت 20 دقیقه بیشترین اثرات را بر پارامترهای مذکور داشت و 94/32% طول دانهرست و 69/48 % بنیه طولی را نسبت به شاهد افزایش داد.
شکل 3-تأثیر توان (5، 10 و 15 میلیوات) و مدت تابش لیزر هلیوم-نئون (0، 5، 10، 20 و 40 دقیقه) طول دانهرست (الف) و بنیه طولی (ب) دانهرست خارمریم
حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنیدار بین تیمارها بر طبق آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد میباشد.
تأثیر غلظتهای مختلف سرب و مدت تابش لیزر بر جوانهزنی و رشد دانهرست: مقایسه میانگین درصد جوانهزنی (شکل4-الف) در بین تیمارها نشان داد غلظت 250 و 500 ppm سرب، درصد جوانهزنی دانهرست خارمریم را بترتیب 51/21 % و 70/51 % در مقایسه با شاهد کاهش داد. در گروه شاهد (تیمار بدون سرب) تیمار 20 و 40 دقیقه تابش لیزر بطور مشابه و در حد معنیداری (حدود 13%) در مقایسه با شاهد جوانهزنی را افزایش داد. در تیمار با غلظت ppm 250 سرب، تابش 20 دقیقه لیزر، درصد جوانهزنی را 53/11 % افزایش داد اما با 40 دقیقه تابش لیزر، درصد جوانهزنی تفاوت معنیداری با شاهد این گروه نداشت. در تیمار با غلظت ppm 500 سرب، تابش 20 و40 دقیقه تابش لیزر بترتیب 69/29 % و67/47 % درصد جوانهزنی را افزایش داد (شکل4-الف).
شکل 4 -تأثیر غلظت نیترات سرب (0، 250 و 500 ppm) و مدت تابش لیزر (0، 20 و 40 دقیقه) بر درصد جوانهزنی (الف) و فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز (ب) دانهرست خارمریم
حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنیدار بین تیمارها بر طبق آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد میباشد.
مقایسه میانگین فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز در بین تیمارها نشان داد غلظت 250 و 500 ppm سرب، فعالیت آنزیم آلفا آمیلاز دانهرست خارمریم را بترتیب 67/25% و 28/34 % کاهش داد. در گروه شاهد، تیمار 20 دقیقهای لیزر در مقایسه با شاهد 92/19 % فعالیت این آنزیم را افزایش داد و با تابش 40 دقیقه فعالیت این آنزیم کاهش یافت. بهترین اثر لیزر در غلظت ppm 250 سرب با 20 و 40 دقیقه تابش اما در غلظت ppm 500 با 40 دقیقه تابش بدست آمد. تابش 20 دقیقه باعث افزایش 47/25 % فعالیت آلفا آمیلاز در غلظت ppm 250 و تابش 40 دقیقه باعث افزایش 71/20 % در غلظت ppm 250 و افزایش 47/27 در غلظتppm 500 شد (شکل4-ب).
شکل5 - تأثیر غلظت نیترات سرب (0، 250 و 500 ppm) و مدت تابش لیزر (0، 20 و 40 دقیقه) برطول (الف)، وزنتر (ب) و خشک (ج) دانهرست خارمریم
حروف یکسان نشان دهنده عدم تفاوت معنیدار بین تیمارها بر طبق آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد میباشد.
مقایسه میانگین در بین تیمارها نشان داد غلظت 250 و 500 ppm سرب بترتیب طول دانهرست را 95/16 % و 35/40%، وزن تر دانهرست را 30/30 % و 54/54 % و وزن خشک دانهرست را 57/28 % و 14/57 % کاهش داد. در گروه شاهد (بدن تیمار سرب)، طول، وزن تر و وزن خشک دانهرست با تیمار 20 دقیقهای لیزر در مقایسه با شاهد بترتیب 33/33 %، 24/24 % و 97/11 % را و با تابش 40 دقیقه 80/22 %، 12/12 % و 56/10 % افزایش یافت. در اغلب موارد بهترین اثر لیزر در غلظت ppm 250 سرب با 20 دقیقه تابش اما در غلظت ppm 500 با 40 دقیقه تابش بدست آمد. تابش 20 دقیقه در دانهرستهای تحت تنش ppm 250 سرب، طول دانهرست، وزن تر و وزن خشک را 55/8 %، 04/13 % و 49/25 % و تابش 40 دقیقه در دانهرستهای تحت تنش ppm 500 سرب طول دانهرست، وزن تر و وزن خشک را 03/23 %، 60 % و 14/37% را افزایش داد (شکل5).
بحث و نتیجهگیری
جوانهزنی یکی از مراحل حساس زندگی گیاه است که بشدت تحت تأثیر تنشهای مختلف قرار میگیرد. اغلب، تنشها میزان، سرعت یا هماهنگی جوانهزنی بذرها را بطور منفی تحت تأثیر قرار میدهد (7و 9). در این تحقیق هم نتایج اولین آزمایش نشان داد با افزایش غلظت سرب، جوانهزنی نسبی، شاخص مقاومت ریشه و شاخص تحمل جوانهزنی کاهش یافت (شکل1). بطور مشابهی چهرگانیراد و همکاران (4) گزارش نمودند که تیمار سرب موجب کاهش درصد جوانهزنی، طول ریشه و ساقه گیاهچه اطلسی شد. ابراهام و همکاران (10) نیز نشان دادند که افزایش غلظت بیشتر از 75 و 100 mg/l فلزات سنگینی نظیر Cd، Pb و Cu میزان جوانهزنی را در گیاهArachis hypogeaeکاهش داد که دلیل آن عدم تحرک ذخیره دانه و کاهش جذب آب بود. نتایج این تحقیق نشان داد که طول ریشه بیش از جوانهزنی دانه به تنش سرب حساس بوده است و کاهش شاخص تحمل جوانهزنی دانه محسوستر از دو شاخص جوانهزنی نسبی و طول ریشه بود (شکل 1) که با توجه به اینکه شاخص تحمل جوانهزنی، ترکیبی از اثرات دو شاخص دیگر را منعکس مینماید، قابلانتظار است. کبیر و همکاران (28) نیز گزارش نمودند که جوانهزنی بذر، رشد دانهرست، وزن خشک و شاخص تحمل Thespesia populneaتحت تیمارهای 10، 30، 50 و 70 میکرومولار سرب و کادمیوم نسبت به شاهد کاهش یافت و این کاهش مرتبط با کاهش فعالیت سلولهای مریستمی و نیز کاهش بسیاری از آنزیمهای موجود در لپهها و اندوسپرم و نیز تولید گونههای فعال اکسیژنی بود. کاهش طول ریشه تحت تنش سرب بدلیل کاهش تقسیم سلولی ناحیه مریستمی، در پیاز (Allium cepa) هم گزارش شده است (27 و 38). بهرحال در غلظتهای 250 و 500 ppm سرب، درصد جوانهزنی بالاتر از 60 و40 درصد باقی ماند (شکل1- الف) و مقادیر عددی بالای شاخص تحمل جوانهزنی دانه (شکل1- ج) در این غلظت سرب بیانگر آن است که جوانهزنی بذر این گیاه تحمل نسبتاً بالایی به سرب دارد. چون در بسیاری از گیاهان جوانهزنی بوسیله غلظتهای بسیار پایین سرب مهار میشود. مثلاً کوپیتک و همکاران (29) نشان دادند سرب حتی در سطح میکرومولار اثرات سوء بر جوانهزنی و رشد دانهرست Vigna unguiculata داشت. مشابه با نتایج ما مالار و همکاران (31) نیز اعلام نمودند که آسیب کم دانهرستهای گیاه سنبل آبی در غلظت بالای سرب نشان دهنده این است که این گیاه مکانیسم مؤثری برای مقاومت به استرس القا شده توسط سرب دارد.
جوانهزنی از مراحل آسیبپذیر در چرخه زندگی گیاهان است. فلزات از دو طریق بر روی جوانهزنی دانه اثر میگذارند: یکی بدلیل ماهیت سمیشان و دوم بدلیل ممانعت از جذب آب. مواجهه گیاهان با فلزات سنگین منجر به تغییر در فرایندها و ساختارهای سلولی میشود. یکی از اثرات آشکار سمیت فلز که در مرحله اولیه قابلمشاهده میباشد کاهش در تکثیر و رشد سلول میباشد. در بذری که قرار است جوانه بزند، لازم است که پتانسیل آب جنین از یک آستانه بحرانی بگذرد. شواهد نشان میدهند که پتانسیل آب تا حدودی با تغییرات سرعت و درصد جوانهزنی ارتباط دارد. بسیاری از تحقیقات نشان دادهاند که تنش فلزات با محدود نمودن جذب آب باعث کاهش جوانهزنی بسیاری از گونههای گیاهی میشود (30).
نتایج دومین آزمایش نشان داد 5، 10، 20 و 40 دقیقه تابش با توان 5 و 10 میلیوات و 5، 10و 20 دقیقه تابش با توان15 میلیوات بطور معنیداری درصد جوانهزنی، انرژی جوانهزنی، سرعت جوانهزنی، طول دانهرست و بنیه طولی را نسبت به شاهد افزایش دادند. تابش نوری لیزر با توان 10 میلیوات بمدت 20 دقیقه بهترین اثرات را نشان داد (شکلهای2 و3). بطور مشابهی گزارش شده است که تابش لیزر هلیوم ـ نئون باقدرت 7/1 وات برای مدت 9 دقیقه شاخص جوانهزنی دانههای Acacia farnesiana را تحت تأثیر قرارداد (44). نتایج تحقیقات دیگر نیز نشان داد که پیشتیمار لیزر، جوانهزنی دانههای یونجه (18)، تربچه (35)، بادرنجبویه (24) و ذرت و گندم (45) را بهبود بخشید.
چن و همکاران (17) گزارش نمودند که لیزر هلیوم – نئون جوانهزنی دانه، بیوماس و رشد دانهرست Isatis indogotica را بطور قابلتوجهی افزایش داد. آنها اعلام کردند که تغییرات آنتالپی در طی فرایند جوانهزنی دانههای پیشتیمار شده با نور لیزر بیشتر از نمونههای شاهد است. تغییر آنتالپی به گرما و انرژی درونی اشاره مینماید. لیزر بعنوان یک نور تأثیرگذار بوسیله ماکرومولکولها جذب میگردد و در نتیجه دانههای تابش دیده با نور لیزر، انرژی بیشتری از محیط در مقایسه با نمونههای شاهد جذب میکنند. لذا نور لیزر بخاطر اثرات الکترومغناطیسی و انرژی تولیدی مولکولهای سلولی را تحت تأثیر قرار داده و باعث افزایش فعالیت آنزیمها میگردد و همچنین آنتروپی و انرژی درونی دانهها را در حین جوانهزنی افزایش میدهد و تعادل سینتیکی جوانهزنی دانهها را تغییر میدهد. از سوی دیگر چون مطالعات نشان داده که جوانهزنی با تجمع رادیکالهای آزاد در دانهها مرتبط است و تجمع مقادیر کم ROS بمنزله سیگنالی برای راهاندازی فرایندهای جوانهزنی است، پیشنهاد شده است که احتمالاً با تابش لیزر، تولید ROS در دانه افزایش مییابد و همین امر باعث تسریع جوانهزنی میگردد که این موضوع به دوز استفاده شده و نیز گونه گیاهی بستگی دارد (39).
نتایج این تحقیق نشان داد که 40 دقیقه تابش با توان 15 میلیوات، سرعت جوانهزنی و رشد دانهرست خارمریم را نسبت به شاهد بطور معنیداری کاهش داد (شکلهای 2 و3). احتمالاً شدت بالای لیزر تولید ROSدر گیاهان را در حد زیادی افزایش میدهد که برخلاف مقادیر کم آنکه محرک جوانهزنی و رشد دانهرست بود، این مقادیر زیاد ROS اثرات مخرب و منفی بر گیاهان دارد. نتایج ولتژن و همکاران (51) نیز نشان داد که شدت و مدت زیاد تابش لیزر دیود و CO2 با طول موجهای 940 و 10600 نانومتر باعث کاهش رشد Echinochloa crusgalliو Nicotiana tabacum گردید. همچنین تیمار با شدت 5 وات دیود لیزری میزان رشد گیاه Stellaria media را بطور قابلتوجهی کاهش داد. در حالیکه برای بهرهگیری از اثرات مثبت لیزر بر رشد گیاهان شدتهای پایین لیزر و بازههای زمانی بلند مدت مورد استفاده قرار میگیرند، اما شدت بالای لیزر اثرات منفی را بر علفهای هرز بر جای میگذارد و بعنوان یک علفکش طبیعی نیز مورد استفاده قرار میگیرد (32). باصر کوچهباغ و همکاران (3) در بررسی تأثیر تیمارهای مختلف امواج فراصوت، اشعه گاما و بتا، لیزر هلیوم-نئون و میدان مغناطیسی در سه مدتزمان 5، 10 و 15 دقیقه بر روی بذرهای گیاه تاتوره دریافتند که 5 دقیقه تابش لیزر هلیوم-نئون طول ریشهچه و ساقهچه، طول گیاه، وزن خشک و درصد جوانهزنی نهایی بذرهای گیاه تاتوره را در حد معنیداری افزایش داد اما اثر 10 و 15 دقیقه تابش لیزر هلیوم-نئون بر پارامترهای فوق کمتر از اثرات 5 دقیقه تابش لیزر هلیوم-نئون بود و میزان این پارامترها با 15 دقیقه تابش لیزر هلیوم-نئون حتی کمتر از بذرهای شاهد بود.
نتایج سومین آزمایش نشان داد در غلظت 250 و 500 ppm سرب، جوانهزنی و فعالیت آلفا آمیلاز (شکلهای 4) و طول و وزن تر و خشک دانهرست (شکلهای 5) خارمریم کاهش یافت. تیمار 20 دقیقهای لیزر در مقایسه با شاهد جوانهزنی، طول و وزن تر و خشک دانهرست و فعالیت آلفا آمیلاز را در شرایط نرمال افزایش داد (شکلهای 4 و 5). آنزیم آلفا آمیلاز مهمترین آنزیم در مراحل اولیه جوانهزنی است و با تأمین سوبسترای رشد برای جنین دانه، جوانهزنی را تسریع مینماید. پودلسنی و همکاران (40) نیز نشان دادند پیشتیمار دانههای لوپین و باقلا با لیزر هلیوم - نئون باعث افزایش انرژی درونی دانهها، افزایش فعالیت آنزیم آمیلاز در لپهها و تسریع جوانهزنی شد. علاوه بر این، نور لیزر باعث افزایش وزن تر و خشک دانهرستها و افزایش طول هیپوکوتیل و ریشهها در باقلا و لوپین گردید. پروین و همکاران (37) هم اعلام کردند اشعه لیزر پارامترهای ترمودینامیکی دانه را تحت تأثیر قرارداد و بطور قابلتوجهی جوانهزنی و فعالیت آنزیمهای پروتئاز و آمیلاز را افزایش داد.
نتایج این تحقیق نشان داد دوز مناسب لیزر جوانهزنی دانه و فعالیت آلفا آمیلاز تحت تنش سرب را بهبود داد (شکل4). و و همکاران (52) نیز گزارش نمودند که تیمار لیزر هلیوم- نئون جوانهزنی و رشد ریشه و وزن تر دانهرست کاج چینی را تحت تنش خشکی افزایش داد. آنها دریافتند که بهبود جوانهزنی دانه تحت تنش خشکی با تقویت فعالیتهای آنزیمی در مدت جوانهزنی همراه بود و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت مثل SOD و POD را در دانهرستها افزایش داد.
بیوماس و وزن گیاه شاخص خوبی برای بنمایش گذاشتن خصوصیات رشد در حضور فلزات سنگین است. نتایج نشان داد که تیمار سرب، وزن تر و خشک بخش هوایی و ریشه دانهرست خارمریم را کاهش داد (شکل5). بطور مشابهی فلزات سنگین وزن تر و خشک بخش هوایی و ریشه گیاه تربچهRaphanus sativus را کاهش دادند (23). آلیا و همکاران (14) نیز نشان دادند که Cd ، Pb و Zn در Spinacia oleracea اثرات منفی بر وزن تر و خشک ریشه و ساقه داشتند. تحقیق دیگری نیز نشان داد کهCd ، Pb و Zn در Brassica rapa اثرات سمی بر جوانهزنی، رشد و وزن این گیاه بر جای گذاشتند (43).
در این تحقیق پیشتیمار دانههای خارمریم با لیزر هلیوم- نئون، وزن تر و خشک ساقه و ریشه را در گیاهان تحت تنش سرب افزایش داد و بهترین اثر لیزر در غلظت ppm250 سرب، با 20 دقیقه تابش و در غلظت ppm 500 سرب، با 40 دقیقه تابش بدست آمد (شکل5). فردوسی زاده و همکاران (19) نیز گزارش کردند که پیشتیمار بلند مدت دانهها با لیزر، وزن تر و خشک را تحت تنش شوری در گندم افزایش داد. مشابه با نتایج این تحقیق، محققان فوق دریافتند که بسته بمدت زمان قرارگیری در معرض نور لیزر، نتایج میتواند متفاوت باشد و تأثیرگذاری نور لیزر به نوع تنش همبستگی دارد. بعنوان مثال برای غلظتهای مختلف شوری، بازههای زمانی متفاوتی از نور میتواند در ایجاد تحمل در گیاهان مؤثر باشد. ابوالسود و شَهدا (12) گزارش کردند پیشتیمار دانههای ذرت با لیزر هلیوم- نئون، طول و بیوماس بخش هوایی و وزن خشک ریشه و فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدانت را در گیاهچههای ذرت تحت تنش UV را افزایش داد. گااو و همکاران (20) نیز اعلام کردند که تیمار لیزر هلیوم- نئون تحمل به شوری در دانهرست فستوکای بلند را افزایش داد.
دو مکانیسم درباره نحوه اثر لیزر بر جوانهزنی و رشد گیاه در شرایط نرمال و تحت تنش پیشنهاد شده است: اول آنکه فیتوکرومها به این خاطر که طولموج لیزر هلیوم – نئون نزدیک به طولموج جذبی توسط فیتوکروم یعنی 633 نانومتر است توسط لیزر هلیوم – نئون تحریک میگردند. با تحریک فیتوکرومها، فعالیت آنزیمها و فرایندهای مرتبط با فیتوکروم مانند جوانهزنی میتواند توسط نور لیزر افزایش یابد (11، 20، 22، 25و 36). مکانیسم دوم آن است که تابش لیزر موجب جذب انرژی اضافی در دانهها میشود و از طریق ایجاد میدان الکترومغناطیسی و گرما فرایندهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی را در گیاهان پیشتیمار شده با لیزر تشدید مینماید که نتیجه آن بصورت بهبود رشد و تحمل تنش تجلی مییابد (11، 21و 25).
در مجموع نتایج این پژوهش نشان داد که استفاده از دوز مناسب لیزر جوانهزنی دانه و رشد اولیه دانهرست خار مریم تحت تنش سرب را بهبود داد. بهرحال برای آنکه روشن شود آیا پیش تیمار لیزری دانهها در مزرعه نیز چنین اثراتی را نشان خواهد داد یا خیر تحقیقات بیشتری لازم است.
سپاسگزاری
از دانشگاه شهرکرد برای حمایت مالی و فراهم آوردن تجهیزات لازم برای انجام این تحقیق سپاسگزاری میشود. همچنین از آقای دکتر شهریاری برای کمک در تنظیم تجهیزات لیزری تشکر و قدردانی میشود.