نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسنده
گروه زیست شناسی، دانشگاه پیام نور، صندوق پستی 3697-19395 تهران، ایران
چکیده
در این پژوهش، تأثیر اعمال تنش آبی 25 روزه بر خصوصیات فیزیولوژیکی برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس (Jasminum fruticans L.) مورد مطالعه قرار گرفت. در فصل بهار، سنجش پارامترهای مربوط به رنگیزههای فتوسنتزی و متابولیسم فنلی، تفاوتهای آشکاری را بین برگهای زمستانه و بهاره مشخص کرد. مقادیر کلروفیل b، کاروتنوئید، فنل کل، فلاونوئید و محتوی نسبی آب (RWC) و همچنین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در برگهای زمستانه نسبت به برگهای بهاره افزایش معنی دار نشان دادند و توانایی برگهای زمستانه جهت فروکش غیرفتوشیمیایی انرژی نوری در فتوسیستمها را بالا بردند. اگر چه خشکی تغییر معنی داری در پارامترهای فوق ایجاد نکرد. خشکی باعث افزایش متابولیتهای اکسیدان شامل مالون دی آلدئید (MDA) و پراکسید هیدروژن (H2O2) و همچنین فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD) در برگهای بهاره شد. پارامتر بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (Fv/Fm) از شرایط خشکی متأثر نشد ولی پارامتر شاخص کارآیی فتوسیستم (PIabs) در برگهای بهاره در پاسخ به خشکی کاهش یافت. همچنین تغییرات منحنی فلورسانس کلروفیل (OJIP) در برگهای زمستانه متفاوت از برگ های بهاره بود. بنابراین به نظر میرسد که دستگاه فتوسنتزی برگهای زمستانه نسبت به برگهای بهاره در پاسخ به خشکی مناسب عمل کرد و دلیل عدم کاهش PIabs در برگهای زمستانه در پاسخ به خشکی با نقش کاروتنوئیدها و فنلها (به عنوان جاذب های نوری) در حفاظت فتوسیستمها مرتبط بود.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Comparison of some photoprotection mechanisms of winter and spring leaves of Jasminum fruticans under drought conditions
نویسنده [English]
Department of Biology, Payame Noor University (PNU), PO BOX 19395–3697 Tehran, Iran
چکیده [English]
In this study, the effects of drought on some physiological characteristics of winter and spring leaves of jasmin (Jasminum fruticans L.) were examined in plants grown in pots and treated with or without water stress for 25 days. Our results showed significant difference in pigment content and phenolic metabolism between winter and spring leaves of jasmine during spring season. In this study, winter leaves showed the higher Chlb, carotanoids, total phenol, flavonoids as well as phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity, and relative water content (RWC) as compared to spring leaves, indicating winter leaves are sufficient in their capacity for non-photochemical energy dissipation via these mechanisms. However, water stress did not significantly affect these parameters. Drought significantly increased the amount of malondoialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2) following significant enhancement of peroxidase (POD) activity. However, in winter and spring leaves treated with water stress, decrease in the maximal quantum efficiency of PSII (Fv/Fm) was not statistically significant. In contrary, spring leaves exhibited a significant decrease in the performance index (PIabs) parameter under drought conditions. Notably, the kinetics of the OJIP chlorophyll fluorescence curve exhibited a quicker difference between winter and spring leaves of jasmine under well watered conditions. Thus, photosynthetic apparatus of winter leaves maintained a higher PIabs during spring season, and showed more tolerance to water stress by dissipating excess light energy by carotenoids; and by screening of photoradiation by phenolic compounds.
کلیدواژهها [English]
مقایسۀ برخی سازوکارهای حفاظت نوری برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس در شرایط تنش خشکی
قادر حبیبی
ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیستشناسی
تاریخ دریافت: 30/8/96 تاریخ پذیرش: 15/8/97
چکیده
در این پژوهش، تأثیر اعمال تنش آبی 25 روزه بر خصوصیات فیزیولوژیکی برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس
(Jasminum fruticans L.) مورد مطالعه قرار گرفت. در فصل بهار، سنجش پارامترهای مربوط به رنگیزههای فتوسنتزی و متابولیسم فنلی، تفاوتهای آشکاری را بین برگهای زمستانه و بهاره مشخص کرد. مقادیر کلروفیل b، کاروتنوئید، فنل کل، فلاونوئید و محتوی نسبی آب (RWC) و همچنین فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز در برگهای زمستانه نسبت به برگهای بهاره افزایش معنیدار نشان دادند و توانایی برگهای زمستانه جهت فروکش غیرفتوشیمیایی انرژی نوری در فتوسیستمها را بالا بردند. اگرچه خشکی تغییر معنیداری در پارامترهای فوق ایجاد نکرد. خشکی باعث افزایش متابولیتهای اکسیدان شامل مالون دی آلدئید (MDA) و پراکسید هیدروژن (H2O2) و همچنین فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD) در برگهای بهاره شد. پارامتر بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (Fv/Fm) از شرایط خشکی متأثر نشد ولی پارامتر شاخص کارآیی فتوسیستم (PIabs) در برگهای بهاره در پاسخ به خشکی کاهش یافت. همچنین تغییرات منحنی فلورسانس کلروفیل (OJIP) در برگهای زمستانه متفاوت از برگهای بهاره بود. بنابراین به نظر میرسد که دستگاه فتوسنتزی برگهای زمستانه نسبت به برگهای بهاره در پاسخ به خشکی مناسب عمل کرد و دلیل عدم کاهش PIabs در برگهای زمستانه در پاسخ به خشکی با نقش کاروتنوئیدها و فنلها (بهعنوان جاذبهای نوری) در حفاظت فتوسیستمها مرتبط بود.
واژههای کلیدی: فلورسانس کلروفیل، Jasminum fruticans، شاخص کارآیی فتوسیستم، فنیل آلانین آمونیالیاز، تنش آبی
نویسنده مسئول، تلفن: 04137828055 ، پست الکترونیکی: gader.habibi@gmail.com
مقدمه
به دنبال تغییرات اقلیمی در بخشهای قابلتوجهی از کره زمین، خشکی یکی از مهمترین تنشهای محیطی است که تولید ماده خشک و عملکرد گیاهان را کاهش میدهد (19و 20). تنش خشکی باعث کاهش شاخص گشودهگی روزنهها، سرعت تعرق و فتوسنتز خالص میشود. هرچند کاهش سطح تعرق (برگها) و افزایش وزن، طول و تعداد انشعابات ریشه از روشهای افزایش سازگاری با شرایط خشکی در گیاهان محسوب میشوند (5و 27) و موجب کاهش اتلاف آب میشوند، ولی با کاهش دسترسی به دی اکسیدکربن اتمسفر، تولید ماده خشک در گیاهان تحت تنش خشکی افت میکند (7). همچنین، تنش خشکی تولید گونههای واکنشگر اکسیژن (ROS) را القاء میکند. افزایش تولید گونههای فعال اکسیژن، باعث تحریک تجزیه پروتئینها و لیپیدها شده و منجر به تخریب غشاها میگردد. گیاهان برای مقابله با این اثرات مضر، صاحب یک سیستم دفاعی با کارایی بالا هستند که رادیکالهای آزاد را از بین برده یا خنثی میکند. این سیستم دفاعی شامل راهکارهای آنزیمی و غیرآنزیمی است. آنزیمهای این سیستم دفاعی شامل سوپراکسیددیس موتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، آسکوربات پراکسیداز (APX)، دهیدروآسکوربات رودوکتاز (DHAR) و گلوتاتیون رودوکتاز (GR) است. سیستم غیرآنزیمی شامل آسکوربیک اسید (ASA)، گلوتاتیون، آلفاتوکوفرول (ویتامین E) و کاروتنوئیدها میباشد (14).
همانطور که گفته شد فتوسنتز ازجمله فرایندهایی است که بهشدت تحت تأثیر تنش خشکی قرار میگیرد (4). با افزایش شدت خشکی، ظرفیت زنجیره انتقال الکترونی تکمیل شده و احتمال تنش اکسیداتیو افزایش مییابد. خشکی میتواند با آسیب رساندن به مرکز تولید اکسیژن و تجزیه اجزاء پلی پپتیدی فتوسیستم II درنهایت منجر به غیرفعال شدن PSII شود (21و 35). این تغییر با تحریک تولید ROS باعث ممانعت نوری و بروز آسیب اکسیداتیو در اجزای داخلی سلولها میشود (3). گیاهان برای جلوگیری از آسیب رسیدن به فتوسیستم II، سازوکارهایی تحت عنوان سازوکارهای حفاظت نوری را اتخاذ میکنند که ازجمله آنها میتوان به حرکت برگ و کلروپلاست، انباشت فنل در اپیدرم برگ بهمنظور جذب پرتو فرابنفش، فعالسازی سیستم دفاع آنتی اکسیدانت آنزیمی و غیرآنزیمی (مثل انباشت کاروتنوئید، گلوتاتیون و غیره ...)، افزایش عملکرد مکانیسم خاموش شدگی غیرفتوشیمیایی فلورسانس کلروفیل در طی انتقال الکترون و تنفس نوری اشاره کرد (30).
پاسخ به خشکی و سازگاری در گونههای مختلف براساس سازوکارهای مختلفی انجام میگیرد و در برخی گیاهان، حتی برگهای مختلف یک گیاه پاسخهای متفاوتی به خشکی میدهند که با مورفولوژی آن برگها در ارتباط است (14). بررسیها نشان میدهد که پاسخ گونههای مختلف گیاه یاس نسبت به خشکی، کمتر مورد مطالعه قرارگرفته است (10). از طرف دیگر پس از گذران فصل زمستان، گیاه یاس برگهایی دارد که دچار خزان نشده و سبز هستند. با شروع فصل بهار و گرم شدن هوا، برگهای بهاره جدید در کنار برگهای زمستانه رشد میکنند که نسبت به برگهای زمستانه دارای سطح وسیعی هستند. مهمترین فرضیه تحقیق این بود که با توجه به مورفولوژی و قطر غیریکسان برگهای زمستانه و بهاره، انتظار میرفت این برگها ازنظر محتوی متابولیتهای اکسیدانت و آنتی اکسیدانت، متابولیسم فنلی، و رنگیزههای فتوسنتزی نیز متفاوت باشند و درنتیجه بخاطر تفاوت در ظرفیت فتوسنتزی، پاسخ این دو نوع برگ به تنش خشکی نیز متفاوت باشد. در نتیجه جهت تعیین قابلقبول بودن فرضیه فوق، این تحقیق بر روی برگهای مختلف گیاه یاس در فصل بهار در سال 1395 انجام شد.
مواد و روشها
کشت گیاهان و اعمال تیمارها: پایههای جوان با طول تقریبی 22 سانتیمتر که از گیاه مادر منشعب شده بودند، جداسازی و در مزرعهای در اطراف شهرستان میاندوآب (استان آذربایجان غربی) در بهار سال 1394 در قالب طرح کاملاً تصادفی با 4 تکرار کشت شدند. این منطقه در طول جغرافیایی ۴۶ درجه و ۶ دقیقه شرقی و در عرض ۳۶ درجه و ۵۸ دقیقه شمالی در وسط جلگههای منتهی به دریاچه ارومیه با ارتفاع ۱۳۱۴ متر از سطح دریا قرار دارد. متوسط بارندگی در این منطقه 275 میلیمتر و رطوبت نسبی 4/61 درصد بود. بافت خاک مزرعه لوم سیلتی بود. برخی از خصوصیات فیزیکی و شیمیایی خاک محل آزمایش در جدول 1 آورده شده است.
پس از گذران فصل تابستان، پاییز و زمستان، و ظاهر شدن برگهای بهاره در کنار برگهای زمستانه، گیاهان به مدت 25 روز تحت تیمار خشکی (توقف آبیاری و رسیدن به40 درصد ظرفیت مزرعه) قرارگرفتند و سپس بلافاصله گیاهان برداشت شدند. سنجش رنگیزهها و متابولیتها بر روی نمونههای تازه برداشت شده و یا نگهداری شده در ازت مایع انجام شد.
جدول 1- مشخصات فیزیکی و شیمیایی خاک محل اجرای آزمایش
روی Zn (mg kg-1) |
منگنز Mn (mg kg-1) |
آهن Fe (mg kg-1) |
هدایت الکتریکی EC (dS. m-1) |
اسیدیته pH |
ظرفیت مزرعه FC (%) |
بافت خاک Soil texture |
عمق خاک Depth (cm) |
0.93 |
6.21 |
9.24 |
1.75 |
7.5 |
20.5 |
لوم سیلتی |
0-50 |
اندازهگیری مقدار نسبی آب (RWC) و شاخص LMA: مقدار نسبی آب برگها با استفاده از وزنتر (Fw)، وزن خشک (Dw) و وزن اشباع (Sw) و براساس رابطه RWC=100×(Fw-Dw)/(Sw-Dw)که توسط لارا و همکارانش (22) ارائه شده است، بدست آمد. پس از اندازهگیری وزن خشک و سطح برگها، شاخص LMA براساس وزن خشک برگ در واحد سطح (g DW/m-2) محاسبه شد.
سنجش رنگیزههای برگ: جهت سنجش مقدار رنگیزهها، نمونههای گیاهی با آب دو بار تقطیر شستشو شده و بر روی کاغذ صافی خشک شدند. پس از اندازهگیری وزنتر (تقریباً 200 میلیگرم)، نمونهها در داخل ورقه آلومینیومی قرارگرفته و در ازت مایع تا زمان سنجش نگهداری شدند. استخراج ماده مورد نظر با استفاده از استون بر روی یخ و با هاون چینی سرد انجام شد. غلظت کلروفیـل و کاروتنوئیدها بهوسیله اسپکتروفتومتر، بعد از 24 ساعت استخـراج در استون 100 درصد تعییـن شد. جذب در 662، 645 و470 نانومتر اندازهگیـری شده و غلظت کلروفیلa، bو کل طبق فرمولهای زیر محاسبه شد (23).
Chl a=11.75 A662 - 2.350 A645
Chl b=18.61 A645 – 3.960 A662
Total carotenoids=1000 A470 - 2.270 Chl a – 81.4 Chl b/227
سنجش پارامترهای فلوئورسانس کلروفیل و تست JIP: جهت تعیین فلوئورسانس کلروفیل، از دستگاه فلوئورسانسسنج (PEA, Hansatech Instruments Ltd., King’s Lynn, Norfolk, PE 32 1JL, England) استفاده شد. پارامترهای فلوئورسانس کلروفیل در برگهای سازش یافته با تاریکی (به مدت حداقل 20 دقیقه) شامل F0(فلوئورسانس پایه) و Fm(فلوئورسانس بیشینه) اندازهگیری شد. برای رسم منحنی فلورسانس از تست JIP بهره گرفته شد. تست JIP دادههای ثبت شده اولیه توسط دستگاه فلوئورسانسسنج را به پارامترهای بیوفیزیکی تبدیل میکند و کمیت مراحل جریان انرژی را طی فتوسیستم II تعیین میکند. در این دستگاه برای تولید منحنی فلورسانس OJIP (O-J-I-P rise)، از نور قرمز با طول موج 627 نانومتر و شدت 3500 میکرومول/مترمربع/ثانیه (برای اطمینان از رسیدن به پیک Fm) استفاده میشود. شاخصهای زیر در اندازهگیریهای فلورسانس اولیه مورد استفاده قرارگرفته است: شدت فلورسانس بیشینه (Fm)، شدت فلورسانس در 50 میکروثانیه (بهعنوان Fo در نظر گرفته میشود)، شدت فلورسانس در 300 میکروثانیه (F300µs)، نسبت فلورسانس متغیر (V) و شدت فلورسانس در 2 میلیثانیه (مرحلهJ) که نشانگر FJ است. سپس محاسبات لازم برای بدست آوردن سایر پارامترها ازجمله شاخص کارآیی فتوسیستمها (PIabs) و بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (Fv/Fm) انجام شد (28 و 29).
سنجش فعالیت آنزیم فنیلآلانین آمونیالیاز: فعالیت فنیلآلانین آمونیالیاز (PAL) مطابق روش زوکر (36) مورد اندازهگیری قرارگرفت. ابتدا عصارۀ آنزیمی در بافر 50 میلیمولار بافر فسفات سدیم با 8/7=pH و حاوی اتیلن دیآمین تترااستیکاسید (EDTA) با غلظت 2 میلیمولار، 18 میلیمولار مرکاپتواتانول و 1/0 درصد تریتون X-100استخراج شد. عصارهها به مدت 15 دقیقه در g15000 سانتریفوژ شده و رو شناور برای سنجش فعالیت مورد استفاده قرار گرفت. مقدار 100 میکرولیتر از عصاره به یک میلیلیتر از محلول واکنشی شامل 50 میلیمولار بافر سدیم بورات (8/8=pH) و 5 میلیمولار L-فنیل آلانین اضافه شده و مخلوط حاصل به مدت 60 دقیقه در دمای 30 درجه بهمنظور انجام واکنش قرارگرفت. جذب نمونهها در 290 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. یک واحد فعالیت آنزیم براساس غلظت پروتئین آنزیمی لازم برای تولید یک نانومول سینامیک اسید محاسبه شد.
سنجش فنل کل: از آنجایی که بیشترین ترکیبات فنلی گیاهان از نوع پلیفنلها میباشد، از روش معرف فنلی فولینسیوکالتو (24) برای سنجش فنل کل استفاده شد. برای این منظور 5 گرم بافت تر برگ جداسازی شده و پس از پودر شدن توسط هاون در 100 میلیلیتر آب مقطر به مدت 30 دقیقه جوشانده شد و با استفاده از کاغذ واتمن شماره 42 صاف گردید. غلظت 250 میکرولیتر معرف فولین با 25 میکرولیتر عصاره و 500 میکرولیتر محلول آبی کربنات سدیم 20 درصد مخلوط شد. نمونههای شاهد فاقد عصاره بودند. پس از قرار دادن نمونهها در دمای آزمایشگاه به مدت 30 دقیقه جذب آنها در طول موج 765 نانومتر اندازهگیری شد و غلظت فنل کل براساس منحنی استاندارد اسید گالیک به دست آمد. برای هر عصاره این سنجش 4 بار تکرار شد و میانگین فنل کل موجود در عصاره تیمارها به صورت میلیگرم اسید گالیک در گرم بافت بیان شد.
سنجش فلاونوئیدها: برای سنجش غلظت فلاونوئیدها، 5 گرم بافت تر برگ در متانول حاوی آلومینیوم کلراید دو درصد استخراج شده و پس از سانتریفوژ، روشناور برداشته شده و جذب آن در طول موج 415 نانومتر قرائت شد. از غلظتهای مختلف کوئرستین (صفر تا 16 میلیگرم در لیتر) بهعنوان استاندارد استفاده گردید و غلظت فلاونوئیدها براساس واحد میلیگرم کوئرستین بر یک گرم وزن تر برگ محاسبه شد (27).
سنجش فعالیت سایر آنزیمهای آنتیاکسیدان: فعالیت آنزیمهای آنتیاکسیدان با استفاده از روشهای توصیف شده پیشین ما (16) سنجش شدند. فعالیت آنزیم سوپراکسید دیس موتاز (SOD) مطابق روش جیاناپولیتیس و رایس (13) و براساس درصد ممانعت از احیاء NBT به ترکیب ارغوانی رنگ دی فورمازان بوسیلۀ رادیکال سوپراکسید (O2•-) حاصل از فتولیز ریبوفلاوین، توسط آنزیم موجود در عصاره مورد اندازهگیری قرارگرفت. فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) مطابق روش سایمون و همکارانش (27) و براساس کاهش جذب پراکسید هیدروژن (H2O2) در 240 نانومتر مورد اندازهگیری قرارگرفت. فعالیت آنزیم پراکسیداز از طریق تست گایاکول و تبدیل آن به تتراگایاکول به انجام رسید. نمونهها در ازت مایع پودر شده و عصارۀ آنزیمی در بافر فسفات پتاسیم با غلظت 10 میلیمولار و 7=pH استخراج شده و به مدت 10 دقیقه در g10000 سانتریفوژ گردید. سنجش فعالیت آنزیم در بافر فسفات پتاسیم با غلظت 10 میلیمولار حاوی 5 میلیمولار از H2O2 و 4 میلیمولار از گایاکول به انجام رسید. واکنش با افزودن عصارۀ آنزیمی در 25 درجۀ سانتیگراد آغاز شده و جذب نمونهها به مدت سه دقیقه در طول موج 470 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. درنهایت فعالیت آنزیم براساس ضریب خاموشی تتراگایاکول برحسب واحد میکرومولار تتراگایاگول بر میلیگرم پروتئین در دقیقه محاسبه شد (15).
اندازهگیری متابولیتها: سنجش مالون دی آلدئید (MDA) بهعنوان معیاری برای بررسی میزان پراکسیداسیون لیپیدها براساس روش بومیناتان و دوران (6) صورت گرفت. عصارۀ برگ در محلول 1/0 درصد تری کلرواستیک اسید (TCA) استخراج شده و به مدت پنج دقیقه در 10000 دور سانتریفوژ گردید. نسبت 1 به 4 از روشناور با محلول 20 درصد از تری کلرواستیک اسید حاوی 5/0 درصد تیوباربیتوریک اسید در لولۀ آزمایش باهم مخلوط شده و به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجۀ سانتیگراد قرارگرفت. سپس لولهها بهسرعت در یخ سرد شده و به مدت 15 دقیقه در 10000 دور سانتریفوژ شدند. همزمان با عصارههای برگ محلولهای استاندارد در محدودۀ صفر تا 100 نانومول از 1،1،3،3- تترا اتوکسی پروپان تهیه شده و جذب نمونهها در 532 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر مورد اندازهگیری قرارگرفت. در نهایت غلظت مالون دی آلدئید نمونهها برحسب نانومول بر گرم وزن تر محاسبه شد. غلظت پراکسید هیدروژن (H2O2) براساس روش توصیف شده توسط حبیبی و حاجی بلند (15) سنجش شد. محلول استخراج برگها محلولتری کلرواستیک اسید (1/0 درصد وزنی به حجمی) بود. عصارهها به مدت 15 دقیقه در 12000 دور سانتریفوژ شده و روشناور مورد استفاده قرارگرفت. 500 میکرولیتر از عصاره به یک میلیلیتر از محلول واکنشی شامل 10 میلی مولار بافر فسفات پتاسیم (7=pH) و یک مولار یدید پتاسیم اضافه شده و مخلوط حاصل به مدت 60 دقیقه در تاریکی بهمنظور انجام واکنش قرارگرفت. جذب نمونهها در 390 نانومتر توسط اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. مقادیر براساس منحنی استاندارد H2O2 در محدودۀ صفر تا 50 نانومول محاسبه شد.
اندازهگیری پروتئین کل: عصارۀ پروتئینی در بافر فسفات سدیم با غلظت 50 میلیمولار و 8/6=pH استخراج شده و به مدت 20 دقیقه در g15000 سانتریفوژ شد. از روشناور حاصل برای سنجش پروتئین کل به روش برادفورد (8) استفاده به عمل آمد.
بررسی آماری نتایج: آزمایشها به صورت طرح کاملاً تصادفی طرحریزی و به اجرا درآمد. هر تیمار دارای 4 تکرار مستقل بود. میانگین و انحراف معیار (SD) دادهها و همچنین رسم نمودارها بوسیلۀ نرمافزار Excel 2007 به انجام رسید. برای گروهبندی میانگینها نیز از نرمافزار Sigma stat 3.5 با آزمون Tukey در سطح احتمال
05/0≥P استفاده شد.
نتایج
مقایسه محتوی رنگیزههای فتوسنتزی در برگهای زمستانه
و بهاره گیاه یاس نشان داد که برگهای زمستانه نسبت به برگهای بهاره دارای مقادیر بیشتری کلروفیل b و کاروتنوئید میباشند. تیمار خشکی تأثیر معنیداری بر محتوی کلروفیل a و b و کاروتنوئید نداشت (شکل 1). مقایسه محتوی نسبی آب (RWC) برگهای گیاه یاس نشان داد که مقدار RWC در برگهای بهاره نسبت به زمستانه در شرایط پرآبی بیشتر است. هرچند با اعمال خشکی RWC در برگهای زمستانه تغییر معنیداری نشان نداد ولی این پارامتر در شرایط خشکی در برگهای بهاره کاهش معنیدار نشان داد (جدول 2). بررسی تغییرات شاخص LMA (وزن خشک برگ در واحد سطح) نشان داد که برگهای بهاره نسبت به برگهای زمستانه دارای LMA کمتری هستند. اعمال خشکی تغییری در LMA برگهای بهاره و زمستانه نسبت به شرایط شاهد ایجاد نکرد.
مقایسه متابولیسم فنلی در برگهای زمستانه و بهاره گیاه یاس نشان داد که بهطور کلی برگهای زمستانه مقادیر بالایی فنل کل و فلاونوئید در مقایسه با برگهای بهاره دارند، افزایش مقدار فنل کل و فلاونوئید در برگهای زمستانه با افزایش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) همراه بود. هرچند اعمال خشکی تغییر معنیداری در مقادیر فنل کل و فلاونوئید همچنین فعالیت آنزیم PAL ایجاد نکرد (شکل 2).
برای رسم منحنی فلورسانس از تست JIP بهره گرفته شد. تست JIP دادههای ثبت شده اولیه توسط دستگاه فلوئورسانس سنج را به پارامترهای بیوفیزیکی تبدیل میکند و کمیت مراحل جریان انرژی را طی فتوسیستم II تعیین میکند. بررسی تغییرات منحنی فلورسانس OJIP (شکل 3: محور عمودی شدت فلورسانس و محور افقی زمان بر اساس میکروثانیه) در گیاه یاس در شرایط شاهد نشان داد که بطور کلی شدت فلورسانس در برگهای زمستانه بیشتر است. شدت فلورسانس در فاز J در برگهای زمستانه نسبت به برگهای بهاره افزایش نشان داد (شکل 3).
اعمال خشکی باعث تغییرات عمدهای در شکل منحنی فلورسانس OJIP هم در برگهای زمستانه و هم در برگهای بهاره شد. بررسی تغییرات منحنی فلورسانس در شرایط خشکی نشان داد که شدت فلورسانس در فاز IP کاهش چشمگیری یافته است و منحنی فلورسانس نسبت به حالت شاهد شکل مسطحی پیدا کرده است. بررسی پارامترهای شاخص کارآیی فتوسیستمها (PIabs) و بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (Fv/Fm) در برگهای زمستانه و برگهای بهاره نشان داد که هرچند مقدار بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II در برگهای زمستانه گیاه یاس تفاوت معنیداری در مقایسه با برگهای بهاره نشان نداد ولی شاخص کارآیی برگهای بهاره در مقایسه با برگهای زمستانه بسیار بالا بود (شکل 4). با اعمال تیمار خشکی شاخص کارآیی فتوسیستمهای برگهای بهاره کاهش معنیدار نشان داد ولی شاخص کارآیی فتوسیستمهای برگهای زمستانه تغییر نیافت.
تفاوتی ازنظر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانت بین برگهای زمستانه و بهاره مشاهده نشد (شکل 5). هرچند با اعمال خشکی فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیس موتاز و کاتالاز تغییر نیافت ولی کمبود آب فعالیت آنزیم پراکسیداز را در برگهای زمستانه و بهاره افزایش داد. مقدار MDA و H2O2 در برگهای زمستانه بسیار بیشتر از برگهای بهاره بود (شکل 6). البته با اعمال خشکی مقدار MDA و H2O2 برگهای بهاره در مقایسه باحالت شاهد افزایش نشان داد و از آنجایی که مقدار MDA شاخص پراکسیداسیون لیپیدها میباشد افزایش این متابولیت نشانگر تنش اکسیداتیو در شرایط خشکی در برگهای بهاره بود.
بحث و نتیجهگیری
فعالیت کمپلکس فتولیز آب در فتوسیستم II با محتوی نسبی آب برگها همبستگی دارد (18). دراین تحقیق، هر دو پارامتر محتوی نسبی آب و کارآیی فتوسیستمها در برگهای زمستانه پس از اعمال خشکی کاهش معنیدار نشان ندادند. به نظر میرسد برگهای زمستانه با حفظ محتوی آب خود در شرایط خشکی توانستند از افت شاخص کارآیی فتوسیستمها ممانعت کنند. در حالیکه خشکی باعث کاهش معنیدار محتوی نسبی آب و در نتیجه کاهش کارآیی فتوسیستمها در برگهای بهاره گردید.
شکل 1- تأثیر اعمال خشکی بر مقدار رنگیزههای فتوسنتزی در برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس در طول فصل بهار. تفاوت بین اعداد مربوط به ستونها که با حروف متفاوت نشان داده شدهاند معنیدار میباشد (05/0P ≤).
بررسی تغییرات منحنی فلورسانس در برگهای زمستانه و بهاره نشان داد که شدت فلورسانس در فاز J در برگهای زمستانه افزایش یافته است. افزایش شدت فلورسانس در فاز J با کاهش ذخایر کوئینونA احیاء (QAH2) و پلاستوکوئینون احیاء (PQH2) مرتبط میباشد (16).
جدول 2- تأثیر اعمال خشکی بر محتوی نسبی آب (RWC) و تغییرات شاخص LMA (وزن خشک برگ در واحد سطح) در برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس در طول فصل بهار. تفاوت بین اعداد مربوط به هر پارامتر که با حروف متفاوت نشان داده شدهاند معنیدار میباشد (05/0P ≤).
تیمار |
RWC (%) |
LMA (g DW/m-2) |
|
شاهد |
برگ زمستانه |
75±3 b |
151±10 a |
برگ بهاره |
84±3 a |
120±14 b |
|
خشکی |
برگ زمستانه |
73±2 b |
159±11 a |
برگ بهاره |
76±4 b |
125±9 b |
شکل 2- تأثیر اعمال خشکی بر مقدار فنل، فلاوونوئید و فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) در برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس در طول فصل بهار. تفاوت بین اعداد مربوط به ستونها که با حروف متفاوت نشان داده شدهاند معنیدار میباشد (05/0P ≤).
کاهش ذخایر QAH2 و PQH2 احتمالاً نشان میدهد که جریان انتقال الکترون در ناقلهای پاییندست در برگهای زمستانه بلوکه شده است (29 و 33). با اعمال خشکی، منحنی فلورسانس برگهای زمستانه و بهاره شکل مسطحی را نشان دادند و شدت فلورسانس در فاز IP کاهش شدیدی را نشان داد. کاهش شدت فلورسانس در فاز IP تحت تأثیر خشکی در این تحقیق با یافتههای وان هیدن و همکاران (33) در تطابق بود. کاهش فاز IP که با کاهش شدت فلورسانس بیشینه (Fm) در ارتباط میباشد نشان دهندهی غیرفعال شدن پروتئینها در ساختار فتوسیستم II میباشد (18) که در همه برگهای گیاه یاس در پاسخ به خشکی مشاهده شد.
شاخص Fv/Fm یکی از شاخصهای مهم جهت تعیین مقاومت به انواع تنشها ازجمله پاتوژنها (26)، خشکی و سرما (12) و دما (34) میباشد. سنجش Fv/Fm برگهای گیاه یاس نشان داد که این پارامتر در پاسخ به خشکی تغییری نشان نداد. هرچند شاخص PIabs در برگهای بهاره در پاسخ به خشکی کاهش معنیدار نشان داد. این یافته با نتایج تحقیق Brestic و Zivcak (9) که نشان دادند پارامترPIabs در مقایسه با پارامتر Fv/Fm به تنش خشکی حساستر است، در انطباق میباشد. پارامتر PIabs یک پارامتر کمپلکس است که با ظرفیت فتوسنتزی و میزان تثبیت دی اکسیدکربن در برگها همبستگی دارد (33). مقدار بالای پارامتر PIabs در برگهای بهاره نسبت به برگهای زمستانه نشان داد که شاید ظرفیت فتوسنتزی و سرعت تثبیت دی اکسیدکربن در برگهای بهاره بیشتر است.
از سازوکارهای مهم حفاظت نوری در گیاهان، فعال شدن سیستم جاروب کننده مولکولهای ROS (32) و انباشت جاذبهای نوری در اپیدرم برگها ازجمله فلاوونوئیدها و آنتوسیانینها میباشد (31). در این پژوهش، فعالیت آنزیم PAL، مقادیر فنل کل و فلاوونوئید در برگهای زمستانه نسبت به برگهای بهاره افزایش نشان داد. شاید دلیل بالا بودن مقادیر فنل در برگهای زمستانه این است که این برگها در طی فصل سرد برای جلوگیری از مهار نوری فتوسیستمها، مقادیر فنلها را افزایش دادهاند و این توانایی و سازگاری را تا بهار سال بعد حفظ کردهاند. به همین علت در شرایط خشکی، بالا بودن محتوی ترکیبات فنلی برگهای زمستانه بهعنوان سازوکارهای حفاظت نوری از افت شاخص کارآیی فتوسیستمها (PIabs) جلوگیری کرد. در حالیکه شاخص کارآیی فتوسیستمهای برگهای بهاره در شرایط خشکی کاهش معنیداری نشان داد.
شکل 3- تغییرات منحنی فلورسانس OJIP (محور عمودی شدت فلورسانس و محور افقی زمان براساس میکروثانیه است) در برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس که به مدت 25 روز در شرایط خشکی قرار گرفتند. برای تولید منحنی فلورسانس OJIP، از نور قرمز با طول موج 627 نانومتر و شدت 3500 میکرومول/ مترمربع/ثانیه (برای اطمینان از رسیدن به پیک Fm) استفاده شد.
عامل دیگری که از افت شاخص کارآیی فتوسیستمهای برگهای زمستانه در خشکی ممانعت کرد، بالا بودن محتوی کاروتنوئیدها و کلروفیل b در برگهای زمستانه بود. افزایش کاروتنوئیدها با فعالسازی چرخه ویولاگزانتین/زئاگزانتین و فروکش غیرفتوشیمیایی باعث تخفیف آسیبهای ناشی از تنش در گیاهان میشوند (11و 14). یافتههای این تحقیق با نتایج حبیبی و آجری (14) که نشان دادند شاخص کارآیی فتوسیستمها با محتوی کاروتنوئیدها و کلروفیل b در گیاه ماروبیوم ولگار همبستگی دارد، در توافق است.
در گیاهان تنشهای مختلف باعث افزایش تولید مولکولهای ROS(Reactive oxygen species) ازجمله H2O2 شده و این مولکولها منجر به پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء میشوند و باعث ظهور اثرات منفی بر رشد و ساختار گیاه میگردند (1و 2). از آن جایی که غشاء اولین بخش از سلول است که تحت تأثیر تنش قرار میگیرد، در این تحقیق برای تعیین آسیب غشاها در شرایط خشکی، مقدار MDA را بهعنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدها سنجش کردیم. اعمال خشکی باعث افزایش مقدار MDA و H2O2 برگهای بهاره شد و افزایش شاخص پراکسیداسیون لیپیدها در شرایط خشکی نشان داد که خشکی اعمال شده در این تحقیق باعث تنش اکسیداتیو در برگهای بهاره شده است (17). در مقایسه، شاخص پراکسیداسیون لیپیدها در برگهای زمستانه تغییر معنیداری در شرایط خشکی نشان نداد. این نتایج مشخص کرد که برگهای زمستانه نسبت به برگهای بهاره مقاومت بهتری نسبت به خشکی بروز میدهند.
شکل 4- تأثیر اعمال خشکی بر پارامترهای شاخص کارآیی فتوسیستمها (PIabs) و بیشینه عملکرد کوانتومی فتوسیستم II (Fv/Fm) در برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس در طول فصل بهار. تفاوت بین اعداد مربوط به ستونها که با حروف متفاوت نشان داده شدهاند معنیدار میباشد (05/0P ≤).
مقایسه ویژگیهای فیزیولوژیکی برگهای زمستانه و بهاره مشخص کرد که برگهای زمستانه و بهاره ازنظر محتوی کلروفیل، فنل، فلاوونوئید و انباشت متابولیتهای اکسیدانت (MDA و H2O2) تفاوت محسوسی باهم دارند.
شکل 5- تأثیر اعمال خشکی بر فعالیت آنزیمهای سوپر اکسید دیس موتاز (SOD)، پراکسیداز (POD) و کاتالاز (CAT) در برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس در طول فصل بهار. تفاوت بین اعداد مربوط به ستونها که با حروف متفاوت نشان داده شدهاند معنیدار میباشد (05/0 P ≤).
شکل 6- تأثیر اعمال خشکی بر مقدار پراکسیدهیدروژن (H2O2) و مالون دی آلدئید (MDA) در برگهای بهاره و زمستانه گیاه یاس در طول فصل بهار. تفاوت بین اعداد مربوط به ستونها که با حروف
متفاوت نشان داده شدهاند معنیدار میباشد (05/0P ≤).
برگهای زمستانه در مقایسه با برگهای بهاره مقاومت بیشتری به خشکی نشان دادند و برخلاف برگهای بهاره، محتوی نسبی آب و شاخص کارآیی فتوسیستمها در برگهای زمستانه در پاسخ به خشکی کاهش نشان ندادند. حفظ ظرفیت فتوسنتزی و کارآیی فتوسیستمها در برگهای زمستانه در شرایط خشکی با مقادیر بالای کلروفیلb، کاروتنوئید، فنل کل و فلاوونوئید در این برگها همبستگی داشت.
سپاسگزاری
نگارنده مقاله از خانم ندا آجری به خاطر مساعدت در جمعآوری و کشت گیاهان تشکر میکند.