نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات تهران، ایران

2 کارشناس پژوهشکده بیوتکنولوژی منطقه مرکزی کشور، نجف آباد، ایران

3 محقق بخش تحقیقات کشت بافت گیاهی، مدیریت بیوتکنولوژی کشاورزی منطقه مرکزی کشور-اصفهان، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی

چکیده

خربزه تلخ (‏Momordica charantia‏) گیاه دارویی از خانواده کدوییان است. این گیاه به‌عنوان داروی سنتی برای ‏درمان دیابت به کار می‌رود. ترکیبات اولیه مسئول کاهش قند خون در این گیاه شامل شبه انسولین حیوانی موسوم ‏به پلی‌پپتید ‏P، کوکوربیتوئید، مموردیسین و اولینولیک اسید است. پلی پپتید ‏P‏ از لحاظ ساختاری و دارویی شبیه ‏انسولین گاوی است. اثرات بازدارندگی این گیاه در خصوص ویروس ‏HIV‏ نیز اثبات ‌شده است. این پژوهش با ‏هدف بررسی تأثیر جهت‌ استقرار ریزنمونه برگ، نوع اکسین و شرایط نوری بر درصد کالوس‌‌زایی و تشکیل ‏ریشه مویین از کالوس گیاه دارویی خربزه تلخ‎ ‎انجام شد. ریزنمونه برگ در دو جهت (سطح بالایی / سطح ‏زیرین) در تماس با محیط کشت حاوی دو نوع اکسین در غلظت 2 میلی‌گرم در لیتر ‏NAA‏ و ‏‎2,4-D‏ کشت و تحت دو ‏شرایط تاریکی و نور قرار گرفت. بالاترین میزان کالوس‌زایی (40/95 %) و ریشه‌زایی (60/40 %) در شرایطی ‏حاصل شد که سطح بالایی برگ در تماس با محیط ‏MS‏ حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر ‏‎2,4-D‏ و در تاریکی قرار ‏گرفت. نتایج نشان داد که تاریکی به طور معنی‌داری در سطح احتمال 5 درصد بر تحریک و افزایش تولید ‏کالوس تأثیر داشته و اکسین ‏‎2,4-D‏ با اختلاف معنی‌داری نسبت به ‏NAA، اکسین مناسب‌تری جهت کالوس‌زایی ‏و ریشه زایی بوده است. ‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of auxin type, explant orientation and light condition on induction of callus and the ‎formation of hairy roots on leaf explants of medicinal plant Bitter melon(Momordica charantia)

نویسندگان [English]

  • Mojdeh Shafaei 1
  • Arash Mokhtari 2
  • Morteza Ebrahimi 3

1 Department of Agriculture and Natural Resources(FANR) , Science and Research Branch of the Islamic Azad University (SRBIAU), Tehran, Iran

2 Department of Plant Tissue Culture, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran-Central ‎Branch- Isfahan; Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, I.R. of Iran

3 Department of Plant Tissue Culture, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran-Central ‎Branch- Isfahan; Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Tehran, I.R. of Iran

چکیده [English]

Karela (Momordica charantia), is one of the most commonly used vegetable that contains ‎polypeptide-p and is used to control diabetes naturally. Polypeptide-p or p-insulin is an ‎insulin-like hypoglycemic protein, shown to lower blood glucose levels in gerbils, langurs and ‎humans when injected subcutaneously. Momordica Anti-HIV Protein (MAP30), alpha- and ‎beta-momorcharins inhibit HIV replication in acutely and chronically infected cells and thus ‎are considered potential therapeutic agent in HIV infection and AIDS. Related to these ‎valuable properties, the present study outlines the in vitro callus induction of Momordica ‎charantia which be fundamental for various purposes such as indirect regeneration, ‎suspension culture or hairy root culture systems. The effects of the orientation of leaf ‎explant, type of auxins and light conditions were evaluated on percentages of callus induction ‎on MS basal medium. Results showed that the best callus induction (95.40%) was achieved ‎when the leaf segments were culture up side on MS medium supplemented by 2 mg/l 2, 4-D ‎and kept in dark condition for 1 week. ‎

کلیدواژه‌ها [English]

  • "Momordica charantia"
  • "Callus"
  • "Light"
  • "Explant Orientation"‎

بررسی تأثیر نوع اکسین، جهت استقرار ریزنمونه و نور بر کالوس‌زایی و تشکیل ریشه مویین گیاه دارویی خربزه تلخ(Momordica charantia)

مژده شفائی1*، آرش مختاری2 و مرتضی ابراهیمی2

1 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، گروه بیوتکنولوژی و به نژادی

2 ایران، اصفهان، آموزش و ترویج کشاورزی، سازمان تحقیقات، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، مدیریت بیوتکنولوژی کشاورزی منطقه مرکزی کشور-اصفهان، بخش تحقیقات کشت بافت گیاهی

تاریخ دریافت:16/8/96                 تاریخ پذیرش: 15/8/97

چکیده

خربزه تلخ (Momordica charantia) گیاه دارویی از خانواده کدوییاناست. این گیاه به‌عنوان داروی سنتی برای درمان دیابت به کار می‌رود. این پژوهش باهدف بررسی تأثیر جهت‌ استقرار ریزنمونه برگ، نوع اکسین و شرایط نوری بر درصد کالوس­­زایی و تشکیل ریشه مویین از کالوس گیاه دارویی خربزه تلخ انجام شد. ریزنمونه برگ در دو جهت (سطح بالایی/ سطح زیرین) در تماس با محیط کشت حاوی دو نوع اکسین در غلظت 2 میلی­گرم در لیتر NAA (نفتالین استیک اسید (Naphthaleneacetic acid)) و 2,4-D (دی کلروفنوکسی استیک اسید(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)) کشت و تحت دو شرایط تاریکی و نور قرارگرفت. بالاترین میزان کالوس‌زایی (40/95%) و ریشه‌زایی (60/40%) در شرایطی حاصل شد که سطح بالایی برگ در تماس با محیط موراشیگ و اسکوگ( MS )حاوی 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و در تاریکی قرارگرفت. نتایج نشان داد که تاریکی به‌طور معنی‌داری در سطح احتمال 5 درصد بر تحریک و افزایش تولید کالوس تأثیر داشته و اکسین 2,4-D با اختلاف معنی‌داری نسبت به NAA، اکسین مناسب‌تری جهت کالوس‌زایی و ریشه‌زایی بوده است.

واژه‌های کلیدی: خربزه تلخ، کالوس‌زایی، تاریکی، جهت ریزنمونه، 2,4-D

* نویسنده مسئول، تلفن: 09132361667، پست الکترونیکی: m.shafaee@srbiau.ac.ir

مقدمه

 

خربزه تلخ (Momordica charantia) گیاه دارویی مهمی از خانواده کدوییان (Cucurbitacea) بوده که منشأ آن هند و مالایا است (12و 23). این گیاه حاوی مقادیر فراوانی اسید آسکوربیک و آهن بوده و به‌عنوان داروی سنتی برای درمان دیابت در بسیاری از کشورهای گرمسیری به کار می‌رود (20). اثرات بازدارندگی آن بر روی ویروس HIV نیز اثبات ‌شده است (12و 23). تحقیقات نشان می‌دهد که ترکیبات اولیه مسئول کاهش قندخون در گیاه خربزه تلخ شامل شبه انسولین حیوانی موسوم به پلی‌پپتید P، کوکوربیتوئید، مموردیسین و اولینولیک اسید است. پلی پپتید P ازلحاظ ساختاری و دارویی شبیه انسولین گاوی است (12). امروزه بسیاری از ترکیبات شیمیایی در بدن انسان عوارض جانبی بسیاری ایجاد می‌نماید. به همین دلیل استخراج و بهره‌گیری از این ترکیبات طبیعی بسیار حائز اهمیت است. امروزه بیوتکنولوژی برای انتخاب، تکثیر و حفظ ژنوتیپ‌های درخطر گیاهان دارویی و استخراج متابولیت‌های ثانویه ‏گیاهی ابزار مهمی محسوب می‌شود‏ (4). تکثیر سنتی گیاه خربزه تلخ به علت وجود پوسته سخت بذر و عدم جذب آب و گاز و نیز بازدارنده‌های موجود در آن با مشکلاتی مواجه بوده و ازدیاد آن از طریق قلمه ساقه و ریشه نیز بسیار دشوار است (9 و 25). از طرف دیگر، تکثیر رویشی این گیاه به کمک روش‌های مرسوم و سنتی علاوه بر بازده پایین، عموماً موجب ضعف گیاه می‌شود (8 و 15). دراین راستا، کشت بافت این گیاه، روش تکثیر مهمی محسوب است و می‌تواند برای تکثیر انبوه گیاهان بکار رود (2، 8، 9، 10، 12، 15 ،17، 23، 29و 31).

یکی از روش‌های تولید گیاه درون شیشه‌ای، استفاده از سیستم باز زایی غیرمستقیم است. از این روش می‌توان به‌طور مستقیم برای تکثیر یا تهیه مواد اولیه موردنیاز برای ریز ازدیادی از طریق سایر روش‌ها، برنامه‌های انتقال ژن و تولید گیاهان تراریخت استفاده کرد. سیستم باز زایی غیرمستقیم گیاه اگرچه معایبی ازنظر احتمال وقوع تنوع ژنتیکی دارد، اما این احتمال را با مدیریت روش تولید ازجمله نوع و غلظت تنظیم‌کننده‌های رشد می‌توان کاهش داد. از طرف دیگر و به‌منظور افزایش تنوع ژنتیکی و استفاده ازاین تنوع در برنامه‌های اصلاحی و تولید متابولیت‌های ثانویه، می‌توان با اعمال تیمارهایی این احتمال را افزایش داد.

در مطالعه‌ دوندرا و همکاران (2009) (12) بر روی گونه Momordica dioica (Roxb)، از ریزنمونه برگ و گره برای تولید کالوس استفاده شد و بیشترین میزان کالوس (80 درصد) از ریزنمونه برگ روی محیط MS حاوی mg/l) 1)   2, 4-Dو BAP (mg/l 2) گزارش گردید. در بررسی مالیک و همکاران (15)، تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد بر کالوس‌زایی و اندام‌زایی مستقیم و غیرمستقیم موردبررسی قرارگرفت. کشت ریز نمونه‌های برگ، ساقه و کوتیلدون‌های خربزه تلخ در محیط MS حاوی غلظت‌های مختلف از اکسین و سیتوکینین به‌تنهایی یا در ترکیب باهم انجام شد. بهترین پاسخ کالوس‌زایی از هر سه ریزنمونه (برگ، ساقه، کوتیلدون) در محیط MS حاوی(mg/l 1-5/1) BAP،  NAA (mg/l 5/1) و  2,4-D (mg/l 1) به دست آمد و کالوس حاصل سفت، سبز و فشرده بود. بر اساس مطالعه‌ دوندرا و همکاران (12) نیز ریز نمونه‌های برگی بیش‌ترین میزان کالوس‌زایی را در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 2 میلی‌گرم در لیتر BAP نشان دادند. در مشاهدات ولی خان و همکاران (26) مشخص شد که تاریکی سبب افزایش فراوانی تولید کالوس گیاه آناتو (Bixa Orellana) می‌شود. به‌طور مشابه، عثمان و همکاران (25) با بررسی کشت دانه گرده گیاه خربزه تلخ در شرایط تاریکی نشان دادند که عدم وجود نور به‌طور معنی‌دار در تحریک کالوس مؤثر بوده است (27). مطالعه شفائی (5) در زمینۀ امکان باز زایی غیرمستقیم گیاه دارویی خربزه تلخ نشان داد که بهترین غلظت 2,4-D جهت کالوس‌زایی این گیاه 2 میلی‌گرم در لیتر است. مطالعه حاضر در ادامه پژوهش پیشین و باهدف بررسی تأثیر جهت‌ استقرار ریزنمونه برگ، نور و تنظیم‌کننده‌های رشد جهت بهینه‌سازی شرایط تشکیل کالوس حاصل از برگ گیاه دارویی خربزه تلخ و انجام مطالعات آتی در خصوص بهینه‌سازی شرایط کشت بر طبق نتایج فوق می‌تواند جهت پایه‌ریزی تولید کالوس جهت باز زایی غیرمستقیم، کشت سوسپانسیون سلولی و نیز کشت ریشه مویین برای تولید متابولیت‌های ثانویه خاص در مطالعات آتی مورد بهره‌برداری قرار‌گیرد. 

مواد و روشها

بذور گیاه خربزه تلخ از شهرستان چابهار تهیه شد. پس از شستشوی بذور با آب شهری، ضدعفونی با اتانل 70 درصد به مدت 1 دقیقه و سپس وایتکس 20 درصد به مدت 15 دقیقه و آبکشی با آب مقطر استریل در زیر لامینار فلو انجام گرفت. تعداد 6 بذر در شیشه‌های حاوی 25 سی‌سی محیط کشت MS فاقد تنظیم‌کننده رشد کشت گردید. به‌منظور جوانه‌زنی، ظروف کشت در اتاق رشد با دمای 25 درجه سانتی‌گراد و فتوپریود 8/16 (نور/ تاریکی)، شدت نور حدود μmol m-2 s-1  250 نگهداری شدند. بعد از جوانه‌زنی، از برگ‌های گیاهچه‌های درون شیشه به‌عنوان منبع ریزنمونه استفاده شد. قطعاتی با اندازه تقریبی cm 2 از پهنک‌برگ تهیه و در دو جهت بر روی محیط کشت MS حاوی دو نوع هورمون 2,4-D یا NAA در غلظت mg/l  2 کشت شد. تعداد 6 ریزنمونه از سطح بالایی برگ گیاه خربزه تلخ (ریزنمونه 1) و6 ریزنمونه از سطح زیرین برگ گیاه خربزه تلخ (ریزنمونه 2) در هر پتری دیش‌های حاوی تنظیم‌کننده‌های فوق کشت شد. درب پتری‌دیش‌ها با پارافیلم مسدود و در دو شرایط نوری فتوپریود 16/8 (نور/ تاریکی، شدت نور حدود μmol m-2 s-1 250) و تاریکی مطلق در دمای 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. پس از گذشت 2 هفته از کشت، درصد تشکیل کالوس و اندام‌زایی احتمالی برای هر تیمار یادداشت شد. به‌منظور آنالیز آماری صفات کالوس‌زایی و ریشه‌زایی با استفاده از فرمول‌های زیر مورد ارزیابی قرارگرفت (1).

 

100× (تعداد کل قطعات جدا کشت) / (میانگین میزان تولید کالوس × تعداد قطعات کالوس داده) = درصد کالوس‌زایی

100× (تعداد کل قطعات جدا کشت) / (میانگین میزان تولید ریشه کالوس × تعداد قطعات ریشه داده) = درصد ریشه‌زایی

 

این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی و به‌صورت فاکتوریل و با 5 تکرار (پتری‌دیش) به اجرا در آمد. تجزیه واریانس داده‌های حاصل و مقایسه میانگین‌ها به ترتیب بااستفاده از نرم‌افزار آماری SAS ver. 9.2 و با آزمون چند دامنه دانکن (0.05 Duncan's multiple range test, P≤) انجام شد.

نتایج

نتایج حاصل از تجزیه واریانس داده‌های مربوط به درصد تشکیل کالوس و ریشه بر روی ریزنمونه گیاه خربزه تلخ (جدول 1) نشان داد که تأثیر منفرد هریک از تیمارهای آزمایش شامل جهت استقرار ریزنمونه بر روی محیط کشت، تنظیم‌کننده‌های رشد و شرایط نوری در سطح احتمال ‏5 درصد (‏0.05P≤)‏ بر درصد تشکیل کالوس معنی‌دار می‌باشد. همین روند در خصوص اثرات متقابل دو و سه‌گانه نیز مشاهده شد. در خصوص صفت دوم (درصد تشکیل ریشه از کالوس)، جهت استقرار ریزنمونه، نوع اکسین، شرایط نوری، اثر متقابل بین جهت ریزنمونه × اکسین و اکسین × شرایط نوری در سطح 1 درصد و اثر متقابل بین جهت ریزنمونه × شرایط نوری و اثرات متقابل سه‌گانه بین جهت ریزنمونه × اکسین × شرایط نوری در سطح احتمال 5 درصد ‏‎(‏0.05P≤)‏ تأثیر معنی‌دار نشان ‏داده‌اند (جدول 1).‏

 

جدول 1- تجزیه واریانس داده‌های مربوط به تأثیر جهت استقرار ریزنمونه، اکسین و شرایط نوری بر درصد کالوس‌زایی و ریشه‌زایی در گیاه دارویی خربزه تلخ

منابع تغییرات

درجه آزادی

درصد کالوس‌زایی

درصد ریشه‌زایی

تیمار

7

**4394

**13/785

جهت ریزنمونه

1

**10/1716

**62/455

اکسین

1

**60/18835

**22/3294

شرایط نوری

1

**60/3459

**62/455

جهت ریزنمونه × اکسین

1

**10/3572

**62/455

جهت ریزنمونه × شرایط نوری

1

**90/448

*02/207

اکسین × شرایط نوری

1

**60/1537

**62/455

جهت ریزنمونه × اکسین × شرایط نوری

1

**60/1537

*22/172

خطا

32

55/36

18/54

کل

39

 

 

             ns: عدم تفاوت معنی‌دار *: تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد        **: تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد


بررسی اثرات منفرد تیمارها: همانگونه که در شکل 1- الف مشاهده می‌شود، درصد کالوس‌زایی و ریشه‌زایی تحت تأثیر جهت استقرار ریزنمونه بر روی محیط کشت میانگین‌های متفاوتی ازلحاظ آماری (‏0.05P≤)‏ داشته‌اند. در خصوص هر دو صفت فوق، بیشترین درصد کالوس‌زایی (15/32) و ریشه‌زایی (60/12) زمانی رخ‌داده که سطح بالایی برگ در تماس با محیط کشت بوده است. نوع اکسین بکار رفته در این آزمایش منجر به اختلاف معنی‌دار بر روی(‏0.05P≤)‏ صفات مورد بررسی شده است. طبق شکل 1- ب، 2,4-D ازلحاظ درصد تشکیل کالوس و تولید ریشه از کالوس به ترتیب با 30/47 و 35/18 درصد بیشترین تأثیر را داشته و پاسخ بهتری نسبت به NAA ایجاد کرده است. شکل 1- ج، مقایسه میانگین تأثیر شرایط نوری مختلف را بر درصد کالوس‌زایی و ریشه‌زایی نشان می‌دهد. درصد تشکیل کالوس و ریشه حاصل از کالوس در شرایط تاریکی بهتر از استقرار کشت‌ها در نور بوده و بیشترین میزان کالوس (90/34 درصد) در شرایط یک هفته تاریکی و سپس انتقال به شرایط نوری حاصل شده است. این میزان با درصد کالوس‌زایی (30/16) تحت شرایط نوری ازلحاظ آماری (‏0.05P≤)‏ تفاوت معنی‌دار نشان داده است.

 

 

شکل 1- مقایسه میانگین ‎(‏0.05P≤)‏ مربوطه به تأثیر جهت استقرار برگ بر روی محیط کشت (الف) نوع اکسین (ب) و شرایط نوری ج) بر درصد کالوس‌زایی و ریشه‌زایی گیاه خربزه تلخ


بررسی اثرات متقابل تیمارها: در جدول شماره 2، نتایج مقایسه میانگین مربوط به اثرات متقابل بین 3 تیمار بکار رفته روی درصد کالوس‌زایی و ریشه حاصل از کالوس ارائه شده است. همانگونه که مشاهده می‌شود، بهترین تأثیر ازلحاظ درصد تشکیل کالوس و ریشه حاصل از کالوس زمانی حادث می‌شود که سطح بالایی برگ در تماس با محیط کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D بوده و کشت‌ها به مدت 1 هفته اول کشت در تاریکی نگهداری شده باشند. تحت این شرایط بیشترین درصد کالوس‌زایی و تشکیل ریشه به ترتیب به میزان 40/95 و 60/40 درصد اندازه‌گیری شد. طبق جدول 2، تاریکی نقش تعیین‌کننده داشته چنانچه ریزنمونه از سطح بالایی در محیط حاوی 2,4-D قرار گیرد میانگین درصد کالوس و ریشه با اختلاف معنی‌دار (‏0.05P≤)‏ نسبت به تیمار تاریکی تغییر کرده و در رتبه دوم قرار می‌گیرد. سودمندی 2,4-D نسبت به NAA مشهود بوده به نحوی که کمترین میزان تشکیل کالوس و ریشه را می‌توان در بین محیط‌های حاوی NAA جستجو نمود. در حضور نور و فارغ از جهت استقرار ریزنمونه، در محیط‌های حاوی NAA نشانه‌ای از تشکیل کالوس گزارش نشد. اشکال 2 و 3 کالوس و ریشه حاصل از برگ در حالتی که سطح بالایی ریزنمونه در تماس با محیط به ترتیب حاوی 2,4-D و NAA بوده را طی مراحل مختلف زمانی از نمای ماکرو و میکروسکوپی نشان می‌دهد.

 

جدول 2- مقایسه میانگین تأثیر جهت استقرار ریزنمونه، نوع اکسین و شرایط نوری بر درصد کالوس‌زایی و ریشه‌زایی در ریزنمونه برگ گیاه دارویی خربزه تلخ(Momordica charantia)

تیمار

درصد کالوس‌زایی

درصد ریشه‌زایی

سطح بالایی برگ+‏NAA‏+تاریکی

c60/13

c00/1

سطح زیرین برگ +‏NAA‏+تاریکی

dc 20/6

c80/1

سطح زیرین برگ+‏‎2,4-D‏+ تاریکی

c00/10

c00/2

سطح بالایی برگ+ ‏‎2,4-D‏+ تاریکی

a40/95

a60/40

سطح بالایی برگ+ ‏‎2,4-D‏+ نور‏

b00/39

b 00/8

سطح بالایی برگ+‏NAA‏+نور‏

d0

d0

سطح زیرین برگ+‏‎2,4-D‏+ نور‏

c00/12

bc00/4

سطح زیرین برگ+NAA+نور

d0

d0

      میانگین‌هایی که دارای حداقل یک حرف مشترک هستند براساس آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد فاقد اختلاف معنی‌دار می‌باشند.

 

شکل 2- مراحل مختلف تشکیل کالوس و ریشه بر روی ریزنمونه قطعات برگ در حالتی که سطح بالایی ریزنمونه برگ خربزه تلخ در تماس با محیط کشت MS حاوی 2,4-D بوده است. تصاویر IV, III, II, I نمای ماکروسکوپی مربوط به استقرار سطح بالایی برگ بروی محیط کشت حاویmg/l 2، 2,4-D تحت شرایط تاریکی که به ترتیب از هفته دوم، چهارم، ششم و هشتم تهیه شده است. (نمای ماکروسکوپی با دوربین دیجیتال کانن مدل ‏Powershot SX60 HS‏ تهیه شده است)‏ و تصاویر VIII, VII, VI, V نمای میکروسکوپی مربوط به استقرار سطح بالایی برگ بروی محیط کشت حاوی ‏mg/l‏ 2، ‏‎2,4-D ‏تحت شرایط تاریکی که به ترتیب ‏از هفته دوم، چهارم، ششم و هشتم تهیه شده است. (نمای میکروسکوپی با دوربین ‏Color Video Camera Sony‏ مدل ‏SSD-DC58AP‏ که روی بیناکولار ‏Olympus‏ ‏قرارگرفته و در بزرگنمایی ‏‎100x‎‏ تهیه شده است).

 

شکل3- مراحل مختلف تشکیل کالوس و ریشه بر روی برگ در حالتی که سطح بالایی ریزنمونه برگ خربزه تلخ در تماس با محیط کشت MS حاوی NAA بوده است. تصاویر IV, III, II, I نمای ماکروسکوپی مربوط به استقرار سطح بالایی برگ بروی محیط کشت حاوی mg/l‌‌‌‌‌  2، NAA تحت شرایط تاریکی که به ترتیب از هفته دوم، چهارم، ششم و هشتم تهیه شده است. (نمای ماکروسکوپی با دوربین دیجیتال کانن مدل‏Powershot SX60 HS‏ تهیه شده است)‏ و تصاویر VIII, VII, VI, V نمای میکروسکوپی مربوط به استقرار سطح بالایی برگ بروی محیط کشت حاوی ‏mg/l‏ 2، ‏‎NAA ‏تحت شرایط تاریکی که به ترتیب ‏از هفته دوم، چهارم، ششم و هشتم تهیه شده است. (نمای میکروسکوپی با دوربین‏Color Video Camera Sony‏ مدل ‏SSD-DC58AP‏ که روی بیناکولار ‏Olympus‏ ‏قرارگرفته و در بزرگنمایی ‏‎100x‎‏ تهیه شده است).


بحث

اکسین‌ها به‌خصوص 2,4-D منجر به تقسیم سلولی شده، در تشکیل کالوس نقش داشته و از رشد جوانه‌های جانبی جلوگیری می‌کنند (11). معمولاً در بیشتر مطالعات، 2,4-D برای تمایز زدایی و تولید کالوس مؤثرتر از سایر اکسین‌ها است (13و 14). در مطالعه حاضر، بهترین درصد القاء کالوس (40/95 درصد) در گیاه خربزه تلخ در محیط کشت حاوی 2 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D حاصل شد. به‌طور مشابه سومارت و همکاران (2008) (21) نیز در بررسی کالوس‌زایی از بذور واریته‌هایی از برنج معطر تایلندی، بهترین محیط کشت جهت کالوس‌زایی را محیط کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم بر لیتر 2,4-D گزارش نمودند. هم‌چنین نتایج شفاهی (1394) (5) و نتایج سگلام و همکاران (2017) (19) در بررسی باز زایی غیرمستقیم گیاه خربزه تلخ و تکثیر درون شیشه این گیاه، این موضوع را تأیید نموده به نحوی که بهترین غلظت برای کالوس‌زایی غلظت 2 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D بوده و افزایش غلظت تا4 میلی‌گرم بر لیتر سبب کاهش رشد کالوس شده است. بالاترین میزان کالوس‌زایی از گیاه Linum glaucum در محیط کشت MS حاوی 2,4-D رخ داده و محققین نشان دادند که NAA تأثیری بر روی تشکیل و رشد کالوس ندارد (24). به‌طور مشابه، حضرتی و همکاران (1396) (2) که پژوهش خود را روی بررسی تأثیر تنظیم کننده‌های رشد گیاهی بر رشد درون شیشه‌ای فندق و تولید تاکسول در کالوس انجام دادند، بهترین غلظت 2,4-D جهت تولید کالوس را 2 میلی‌گرم در لیتر گزارش نمودند.

تأثیر 2,4-D و عدم وجود نور در هفته اول کشت نیز افزایش چشم‌گیری در بهینه‌سازی کالوس‌زایی نشان داد. تحریک و شدت تکثیر کالوس در حضور 2,4-D و تاریکی به حدی بود که پس از گذشت دو هفته بافت کالوس تمام قطعات ریزنمونه را در برگرفته و به دنبال آن ریشه‌زایی آغاز شد. در مطالعه عثمان و همکاران (2015) (26) در خصوص کشت درون شیشه دانه گرده گیاه خربزه تلخ مشخص شد که نگهداری کشت‌ها به مدت 48 ساعت در شرایط تاریکی سبب افزایش کالوس‌زایی (71 درصد) شده است. به طور مشابه در مطالعه توکل و همکاران (2011) (24) نتایجی در تأیید نتایج حاصل این پژوهش گزارش کردند که تاریکی و محیط کشت MS به همراه 2,4-D به‌منظور تولید کالوس کلزا بهینه خواهد بود. طبق نتایج این بررسی، تاریکی سبب بالاترین میزان کالوس‌زایی (3/47 درصد) در ریز نمونه‌های برگی شد. نتایج مطالعه زاره و همکاران (2015) (28) در مورد اثر نور، نوع ریزنمونه و غلظت‌های اکسین و سیتوکینین‌ها روی کالوس‌زایی گیاه دارویی Linum glaucum این موضوع را تأیید می‌کند به نحوی که تاریکی سبب افزایش تشکیل کالوس و افزایش وزن‌تر کالوس شده است. همچنین نتایج مطالعات ولی خان و همکاران (27) در خصوص بررسی اثر تاریکی و تنظیم کننده‌های رشد بر کالوس‌زایی گیاه آناتو
(Bixa orellana) نیز ثابت کرده که تاریکی به طور معنی‌داری سبب افزایش تشکیل کالوس‌ نسبت به شرایط نوری خواهد شد. نتایج رضا نژاد و طراحی (1392) (3) نیز تأثیر منفی نور بر رشد کالوس را تأیید نمود. این در حالی است که برخلاف نتایج تحقیق حاضر، سیدیک و همکاران (2015) (22)، پایین‌ترین میزان کالوس‌زایی (40/24 درصد) را در شرایط تاریکی از ریزنمونه ریشه در واریته ویرجینا تنباکو بدست آوردند. کالوس حاصله آبکی بوده و اثراتی از جنین‌زایی نشان نداد که این موضوع به اهمیت نوع ریزنمونه مورد استفاده و جهت قرارگیری نمونه روی محیط کشت و تأثیر آن روی کالوس‌زایی اشاره دارد.

گزارشی از جهت قرارگیری ریزنمونه و تأثیر آن روی کالوس­زایی در مطالعه ژنگ و همکاران (2017) (30) وجود دارد به نحوی که کالوس‌زایی حاصل از لیزماخیا (Lismachia davurica) زمانی به بالاترین میزان خواهد رسید که سطح بالایی برگ در تماس با محیط کشت قرار گیرد و این موضوع مؤید نتایج مطالعه حاضر می‌باشد که تماس سطح بالایی برگ با محیط ‌کشت سبب تحریک و افزایش تولید کالوس‌ و ریشه‌ شد. همچنین مطالعه مازومدار و همکاران (2010) (16) در ارتباط با بررسی جهت قرارگیری ریزنمونه گیاه جاتروفا (Jatropha curas) نشان داد زمانی که سطح­رویی قطعات برگ در تماس با محیط کشت باشد، کالوس‌زایی بهتری صورت خواهد گرفت. مطالعه سنتارم و همکاران (1997) (18) که باهدف بررسی جهت قرارگیری برگ کوتیلدونی بر روی محیط کشت صورت پذیرفت نیز مؤید این است که وقتی قسمت انتهایی کوتیلدون در تماس با محیط باشد، مسیر باز زایی غیرمستقیم و تشکیل کالوس تحریک‌شده و کالوس باکیفیت‌ بهتری به دست خواهد آمد.

صفت تولید ریشه مویین از کالوس باهدف ادامه تحقیقات مرتبط با بررسی قابلیت تولید متابولیت‌های ثانویه درکشت ریشه مویین از گزینه‌های مورد علاقه بسیاری از تحقیقات کنونی است. در آزمایش حاضر، ریشه نیز از ‏کالوس حاصل از برخی تیمارهای مورد استفاده به دست آمد‏. سودمندی 2,4-D در این خصوص با نتایج ‏آزمایشات قبلی تأیید می‌شود.‏ ‏براساس مطالعات قدیری و همکاران (1391) (6) از ریز نمونه‌های برگ کوتیلدونی، ریشه و ساقه گیاه Eucalyptus rubida در محیط کشت MS حاوی 9 تیمار هورمونی مختلف TDZ و 2,4-D جهت کالوس­زایی و متعاقب آن اندام‌زایی از کالوس استفاده شد. بهترین نتیجه کالوس‌زایی در ترکیب 1 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و 1/0 میلی‌گرم در لیتر TDZ به دست آمد و تولید کالوس‌های ریشه زا نمود. طبق نتایج امیری و همکاران (2013) (7) در خصوص تأثیر سطوح مختلف 2,4-D در محیط کشت MS بر روی کالوس‌زایی حاصل از ریز نمونه‌های برگ و شاخه دو لاین بذر حقیقی سیب‌زمینی مشخص شد که غلظت 3 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D بالاترین میزان تشکیل کالوس و باز زایی ریشه از کالوس را در تمامی ریز نمونه‌های برگ، شاخه داشته است. به‌طورکلی و برطبق نتایج این تحقیق، کشت ریزنمونه برگ به نحوی که سطح بالایی آن در تماس با محیط ‌کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر 2,4-D و استقرار کشت‌ها به مدت 1 هفته تحت رژیم تاریکی بهترین میزان تولید کالوس و ریشه حاصل از کالوس را در پی خواهد داشت. بهینه‌سازی شرایط کشت بر طبق نتایج فوق می‌تواند جهت پایه‌ریزی تولید کالوس جهت باز زایی غیرمستقیم، کشت سوسپانسیون سلولی و نیز کشت ریشه مویین برای تولید متابولیت‌های ثانویه خاص در مطالعات آتی مورد بهره‌برداری قرار ‌گیرد.

1- پیروز، م.، امیری، ح.، و دوستی، ب.، 1395. بررسی کالزایی و باز زایی گیاه دارویی آویشن دنایی (Thymus daenensis Celak)، دوماهنامه علمی-پژوهشی تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، جلد 32 ، شماره 6، صفحات 958-967.

2- حضرتی­جهان، ر.، زارع، ر.، دژستان، س.، شیخ‌زاده مصدق، پ.، و فرجامی‌نژاد، م.، 1396. تأثیر تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بر رشد درون شیشه‌ای فندق (Corylus avellana) و تولید تاکسول در کالوس، مجله پژوهش‌های گیاهی (مجله زیست‌شناسی ایران)، جلد 30، شماره3، صفحات 559-541.

3- رضانژاد، ف.، و طراحی، ر.، 1392. اثر نور و تنظیم‌کننده‌های رشد گیاهی بر کالوس‌زایی و تجمع آنتوسیانین در کالوس‌های حاصل از جداکشت‌های مختلف در رز گالیکا (Rosa gallica L.)، مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست‌شناسی ایران)، شماره 2، صفحات 195-184.

4- شفایی، م.، اطرشی، م.، و مختاری، آ.، 1393. مروری بر نقش امواج فراصوت در استخراج متابولیت‌های ثانویه، اولین کنگره ملی زیست‌شناسی و علوم طبیعی ایران، تهران، مرکز راهکارهای دستیابی به توسعه پایدار، انجمن حمایت از طبیعت ایران، https://www.civilica.com/Paper-BSCONF01-BSCONF01_064.htm

5- شفائی، م.، 1394. بررسی امکان باز زایی غیرمستقیم گیاه دارویی خربزه تلخ (Momordica charantia) در شرایط درون شیشه، پایان‌نامه برای دریافت مدرک کارشناسی ارشد، دانشگاه پیام نور، اصفهان، صفحات 100-1.

6- قدیری سردرود، س.، قمری‌زارع، ع.، عصاره، م.، شهرزاد، ش.، و بخشی خانیکی، غ.، 1391. تأثیر هورمونهای TDZ و 2,4-D بر تولید کالوس و اندام‌زایی در گونه Eucalyptus rubida، دو فصلنامة علمی-پژوهشی تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران، جلد 20، شماره 2، صفحات 304-313.

 

7-    Amiri, M., Gerdakaneh, M., Mamghani, R., and Nouri, F., 2013. Effect of Different Concentrations of 2,4-D on Callus Induction and Callus root Indication in 2 Explants from True Potato (Solanum tuberosum L.) Seeds, Scientific Journal of Agronomy and Plant Breeding, 1(2), PP: 56-63

8-    Balkhande, S. V., Kure, S. R., and Surwase, B. S., 2013. Influence of silver nitrat on shoot regeneration from excised meristems of Momordica cymbalaria Hook: A diminishing species, Research Journal of Biotechnology, Vol 8(2). PP: 42-27.

9-    Bharathi, L. K., and John, K. j., 2013. Momordica Genus in Asia: An overview, Description and crop production, Springer, India. PP: 1-147

10-          Das, J. A., Paratap, M., and Handique, J., 2013. Callus-mediated organagenesis and effect of growth regulators on production of different valepotriates in Indian valerian (Valeriana jatamansi Jones). Acta Physiol Plant. Ashiho Das, 35, PP: 55-63

11-          DeKlerk, G. J., 2006. Plant hormone and tissue culture. Plant cell and tissue culture phytopathology Biochemical, PP: 17-25.

12-          Devendra, N. k., Subhas, B., and Seetharam, Y. N., 2009. Callus growth and plant regeneration in Momordica dioica (Roxb.) willd. Cucurbitaceae, American-Eurasian Journal of sustainable agriculture (AENSI), 3(4), PP: 743-748.

13-          Dixon, R. A., and Gonzales, R. A., 1996. Plant Cell Culture: A Practical Approach. 2nd Ed. IRL Press, PP: 1–230.

14- Konate, S., Kone, M., Kouakou, H. T., Kouadiob, J. Y., and Zouzou, M., 2013. Callus induction and proliferation from cotyledon explants in Bamvara groundnut, African Crop Science Journal, Vol. 21, No. 3, PP: 255 - 263

15-          Malik, S., Zia, M., Rehman, R., and Chaudhary, M. F., 2007. In vitro plant regeneration from direct and indirect organogenesis of Momordica charantia, Pakistan Journal of biological Science, 10 (22), PP: 4118-4122.

16-          Mazumdar, P., Basu, A., Paul, A., Mahanta, C., and Sahoo, L., 2010. Age and orientation of the cotyledonary leaf explants determine the efficiency of de novo plant regeneration and Agrobacterium tumefaciens mediated transformation in Jatropha curcas, L., South African Journal of Botany, 76, PP: 337–344.

17-          Ray, R., Raychoudhuri, B. A., Steele, R., and Nerurkar, P., 2010. Bitter melon (Momordica charantia) Extract inhibits Breast Cancer cell proliferation by modulating cell cycle Regulatory Genes and Promotes Apoptosis, Journal of cancer Research(Cancer Res),70, PP: 1925-1931.

18-          Santarem, E. R., Pelissier, B., and Finer, J. J., 1996. Effect of explant orientation, pH, solidifying agent and wounding on initiation of soybean somatic embryos, In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant, January 1997, Volume 33, Issue 1, PP: 13-19.

19-          Sagalam, S., 2017. In Vitro Propagation of Bitter Gourd (Momordica charantia L.), Scientifc Bulletin. Series F. Biotechnologies, Vol. XXI, 2017 p.

20-          Shafaei, M., 2016. Bitter Gourd: A Natural Green Gold, Lambert Academic Publishing, Germany, PP: 1-50. (In English)

21-          Summart, J., Panichajakul, S., Prathepha, P., and Thanonkeo, P., 2008. Callus Induction and Influence of Culture Condition and Culture Medium on Growth of Thai Aromatic Rice, Khao Dawk Mali 105, Cell Culture, World Applied Sciences Journal 5 (2), PP: 246-251

22-          Siddigue, A., and Shahinul Islam, S., 2015. Effect of light and dark on callus induction and Regeneration in (Nicotiana tabacum L.), Bangladesh, J., Bot. 44(4), PP: 643-651.

23-          Tang, Y., Liu, J., Liu, B., Li, X. M., Li, J., and Li, H. X., 2010. Endogenous hormone concentrations in explants and calluses of bitter melon (Momordica charanitiae L.), Journal of science and technology (INTERCIENCIA), Vol 35, 9 p.

24-          Tavakkol Afshari, R., Angoshtari, R., and Kalantari, S., 2011. Effects of light and different plant growth regulators on induction of callus growth in rapeseed (Brassica napus L.) genotypes, Plant Omics Journal (POJ), 4(2), PP: 60-67.

25-          Thiruvengadam, M., Praveen, N., and Chung, I. M., 2012. In vitro regeneration from intermodal explants of bitter melon (Momordica charantiae L.) via indirect organogenesis, African journal of Biotechnology, Vol: 11, PP: 8218-8224.

26-          Usman, M., Bakhsh, K., Fatima, B., Zaman, Q., and Shah, M. H., 2015. Exploring embryogenic competence in anthers of bitter gourd (Momordica charantia L.) cultivar faisalabad long, J. Anim. Pla The Journal of Animal & Plant Sciences, 25(1), PP: 181-188.

27-          Valli Khan, S., Prakash, E., and Rao, K. R., 2002. Callus induction and plantlet regeneration in Bixa oreliana L., an annatto-yielding tree, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, March 2002, Volume 38, Issue 2, PP: 186–190.

28-          Zare, K. H., Movafeghi, A., Nazemiyeh, H., and Mohammad, S. A., 2015. Effect of Culture Conditions on Callus Induction in Linum glaucum Boiss. and Noë, Russian Agricultural Sciences, 2015, Vol. 41, No. 5, PP: 311–316.

29-          Zhang, M., Zhao, D., Ma, Z., Li, X., Xiao, Y., 2009. Growth and Photosynthesis capability of Momordica Grosvenori plantlets grown photoautotrophically in response to the light intensity, Hrt Science, 44(3), PP: 757-763.

30-          Zhang, Y., Sun, D., and Hu, S., 2017. In vitro propagation of medicinal and ornamental plant Lysimachia davurica, Eur. J. Hortic. Sci. 82(1), PP: 54–60.

31-          Zhe, H., Yuan, L., and Xinmei, J., 2009. Effects of differenets soaking time on seed germination in Balsam pear (Momordia charantiae L.) after dry heat treatment, Journal of Northeast Agriculture university, PP: 1-2009.