نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان

2 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران

چکیده

گیاه سنبل‌الطیب یکی از گیاهان دارویی مهم در ایران است. با توجه به اهمیت دارویی این گیاه در استفاده سنتی و داروسازی صنعتی، در این پژوهش، بهینه‌سازی کشت بافت، پینه‌زایی و باززایی گیاه کامل از دو نوع ریزنمونه برگ و دمبرگ روی محیط‌های حاوی ترکیبات مختلف هورمونی ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که ریزنمونه برگ برای پینه‌زایی در دو شرایط نوری تاریکی و روشنایی مناسب‌تر است. بیشترین مقدار پینه از ریزنمونه برگی در شرایط روشنایی و روی محیط حاوی 5/0 میلی‌گرم در لیتر BAP و 1 میلی‌گرم در لیتر‌BAP بدست آمد. پینه‌های القا شده در تاریکی، قدرت باززایی ساقه روی محیط‌های باززایی حاوی غلظت‌های مختلف BAP و TDZ را نداشتند و تنها رشد پینه و تولید اندام ریشه مشاهده شد. پینه‌های بدست آمده از ریزنمونه‌های برگی در شرایط روشنایی، قابلیت خوبی برای باززایی ساقه در محیط باززایی داشتند. حداکثر میانگین تعداد شاخه در محیط باززایی حاوی سه میلی‌گرم در لیتر BAP مشاهده گردید. این نتایج، علاوه بر فراهم نمودن اطلاعات پایه در مورد اثر برخی فاکتورهای فیزیکی و شیمیایی روی پینه‌زایی و باززایی گیاه سنبل‌الطیب، یک سیستم کارآمد برای باززایی این گیاه را معرفی می‌نماید که می‌تواند در برنامه‌های اصلاح مولکولی با استفاده از مهندسی ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Optimization of tissue culture and regeneration in Valerian (Valeriana officinalis) medicinal plant

نویسندگان [English]

  • Narges Pashmforoosh 1
  • Mohammad Ahmadabadi 2

1 Biotechnology Dep., Fac of Agriculture, Azarbaijan Shahid Madani University

2 Biotechnology Dep., Faculty of Agriculture, Azarbaijan Shahid Madani University

چکیده [English]

Valerian is one of the most important herbs in Iran. Regarding the importance of this plant in traditional and industrial medicine, in this research, optimization of tissue culture, callus induction, and regeneration of whole plant from two types of leaf and petiole explants were evaluated on various hormone combinations. The results showed that the leaf segment is more suitable for callugenesis in both light and dark conditions. The highest amount of callus was obtained in light conditions for the leaf explant cultured on the medium containing 0.5 mg/L BAP and 1 mg/L BAP. Dark-induced calli did not show the potential to shoot regeneration on tested media containing different concentrations of BAP and TDZ, and only callus growth and root formation was observed. The light-induced calli from the leaf explants had a good potential to regenerate shoots on the regeneration medium. Maximum mean number of shoots was observed in the regeneration medium containing 3 mg/L BAP. These results provided basic information on the effects of some physical and chemical factors on the tissue culture and regeneration of Valerian. Also, we introduce an efficient system for shoot regeneration in this plant that can be used in molecular breeding programs using genetic engineering techniques.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Valerian
  • callus induction
  • in vitro regeneration
  • Valeriana officinalis

بهینه­سازی کشت بافت و باززایی گیاه دارویی سنبل­الطیب (Valeriana officinalis)

نرگس پشم­فروش و محمد احمدآبادی*

ایران، تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 27/3/97                تاریخ پذیرش: 25/10/97

چکیده

گیاه سنبل­الطیب یکی از گیاهان دارویی مهم در ایران است. باتوجه به اهمیت دارویی این گیاه در استفاده سنتی و داروسازی صنعتی، در این پژوهش، بهینه­سازی کشت بافت، پینه­زایی و باززایی گیاه کامل از دو نوع ریزنمونه برگ و دمبرگ روی محیط­های حاوی ترکیبات مختلف هورمونی ارزیابی گردید. نتایج نشان داد که ریزنمونه برگ برای پینه­زایی در دو شرایط نوری تاریکی و روشنایی مناسب­تر است. بیشترین مقدار پینه از ریزنمونه برگی در شرایط روشنایی و روی محیط حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP و 1 میلی­گرم در لیتر­BAP بدست آمد. پینه­های القا شده در تاریکی، قدرت باززایی ساقه روی محیط­های باززایی حاوی غلظت­های مختلف BAP و TDZ را نداشتند و تنها رشد پینه و تولید اندام ریشه مشاهده شد. پینه­های بدست آمده از ریزنمونه­های برگی در شرایط روشنایی، قابلیت خوبی برای باززایی ساقه در محیط باززایی داشتند. حداکثر میانگین تعداد شاخه در محیط باززایی حاوی سه میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده گردید. این نتایج، علاوه بر فراهم نمودن اطلاعات پایه در مورد اثر برخی فاکتورهای فیزیکی و شیمیایی روی پینه­زایی و باززایی گیاه سنبل­الطیب، یک سیستم کارآمد برای باززایی این گیاه را معرفی می­نماید که می­تواند در برنامه­های اصلاح مولکولی با استفاده از مهندسی ژنتیک مورد استفاده قرارگیرد.

واژه­های کلیدی: سنبل­الطیب، پینه­زایی، باززایی درون­شیشه­ای، Valeriana officinalis

* نویسنده مسئول، تلفن: 34327500-041 پست الکترونیکی: ahmadabadiir@yahhoo.com

مقدمه

 

سنبل­الطیب (Valeriana officinalis) یکی از گونه­های مهم جنس والریانا است که بومی اروپا و آسیا بوده و به طور سنتی و گسترده در صنایع داروسازی ایران مورد استفاده قرار می­گیرد (18). عصاره این گیاه حاوی ترکیبات دارویی مختلفی شامل روغن­های فرار (از قبیل والریک اسید)، آلکالوئیدها و اسیدهای آمینه آزاد (از قبیل گاما آمینوبوتیریک اسید، آرژنین، تیروزین و گلوتامین) می­باشد. والرنیک اسید و مشتقات آن از قبیل هیدروکسی والرنیک اسید از قوی­ترین ترکیبات آرام­بخش موجود در این گیاه است که به بصورت تجاری مورد توجه هستند (15). خواص دارویی دیگری نیز از این گیاه شامل خاصیت ضد اسپاسم، ضداضطراب، ضدتشنج و ضدباکتری گزارش شده و برای درمان برخی از بیماری­ها از قبیل سردرد، تپش قلب، فشارخون بالا، اختلالات رفتاری و یادگیری کودکان و ... استفاده شده است (4، 5، 6، 8، 10و 12). باوجود اهمیت دارویی گونه­های مختلف این گیاه، مطالعات کشت بافت اندکی بر روی آن­ها انجام شده است. در این مطالعات، از ریزنمونه­های مختلفی چون برگ (3، 20و 23)، ساقه (23)، ریشه (23) و جوانه جانبی (21) استفاده شده است. در این پژوهش، پینه­زایی و باززایی از دو نوع ریزنمونه برگ و دمبرگ گیاه سنبل­الطیب با استفاده از ترکیبات مختلف هورمونی در شرایط نوری مختلف مورد ارزیابی قرارگرفت.

مواد و روشها

تهیه مواد گیاهی و ریزنمونه: دراین پژوهش، بذرهای گیاه سنبل­الطیب از منطقه خسروشاه تبریز جمع­آوری شدند. جهت ضدعفونی، بذرها در یک تیوپ آزمایشگاهی به مدت یک دقیقه با اتانول 70 درصد و سپس به مدت پنج دقیقه با هیپوکلریت کلسیم 6 درصد (حاوی یک قطره توئین 20) تیمار شدند. پس از سه مرتبه شستشو با آب مقطر استریل، بذور جهت جوانه­زنی و تهیه گیاهچه­های استریل در محیط MS پایه (14) حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز کشت شدند. نمونه­ها پس از کشت در فیتوترون با شرایط نوری 16 ساعت روشنایی (حدود 35 میکرومول فوتون بر مترمربع در ثانیه) و هشت ساعت تاریکی و دمای 25 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. رطوبت نسبی روی 5±45 درصد تنظیم گردید. برای تهیه ریزنمونه، قطعات دمبرگ به‌اندازه 5/0 سانتی­متر مربع، و برگ حقیقی به‌اندازه 3-2 میلی­متر مربع از گیاهچه­های استریل شش هفته­ای برش داده شدند.

محیط­های پینه­زایی و باززایی و تیمارهای هورمونی: جهت بررسی اثر هورمون­ها و نیز نوع ریزنمونه­ها در القاء پینه و تولید پینه­های جنین­زا، آزمایشی فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی با ترکیب دو نوع هورمون 6-بنزیل آمینو پورین (BAP) با سه غلظت (0، 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر) و تو-فور-دی (2,4-D) با سه غلظت (0، 1 و 2 میلی­گرم در لیتر) در 3 تکرار و در شرایط تاریکی بررسی شد. ریزنمونه­ها برای القاء پینه بر روی محیط­های مختلف قرارداده شدند. کشت­ها در فیتوترون در شرایط تاریکی قرارگرفتند. پس از هشت هفته، صفات درصد پینه­زایی، طول پینه و وزن پینه­های به دست آمده از ریزنمونه­ها ارزیابی شدند.

انتقال پینه­های به دست آمده در شرایط تاریکی به محیط باززایی: برای بررسی پتانسیل باززایی و القاء شاخه­زایی در پینه­های تشکیل شده در شرایط تاریکی، پینه­هایی که شکل ظاهری آن­ها زرد تیره بود و به نظر جنین­زا می­رسید، جهت القاء شاخه­زایی به محیط باززایی انتقال داده شدند. برای این منظور، در یک آزمایش، پینه­هایی به‌اندازه سه میلی­متر مربع برش داده شده و در محیط MS حاوی دو نوع هورمون سیتوکنینی بنزیل آمینو پورین (BAP) و تیدیازورون (TDZ) در 4 تیمار (بدون هورمون، mg/l 1 BAP، mg/l 2 BAP و mg/l 1 TDZ، mg/l 2 TDZ) و سه تکرار انتقال داده شده و نمونه­ها در فیتوترون قرار داده شدند. پس از چهار هفته، پارامترهای رشد پینه، درصد ریشه­زایی و درصد شاخه­زایی ارزیابی شدند.

در ادامه این آزمایش، تیمارهایی که تولید پینه­هایی به رنگ سبز تیره کرده بودند گزینش، و جهت القاء باززایی به محیط­های هورمونی دیگری حاوی غلظت­های بالاتر تیدیازورون (0، 3، 4، 5 و 10 میلی­گرم در لیتر) منتقل شدند.

القاء پینه­های جنین­زا در شرایط روشنایی: دراین آزمایش از سه نوع ریزنمونه­ دمبرگ (P)، برگ حقیقی (L) و ریشه (R) استفاده شد. ریزنمونه دمبرگ و ریشه به اندازه 5/0 سانتی­متر مربع و برگ حقیقی به اندازه 3-2 میلی­متر مربع برش داده شدند. برای راحتی مقایسه بافت­های مختلف با همدیگر، پتری­ها به سه قسمت مساوی تقسیم، و در هر قسمت سه ریزنمونه از هر نوع بافت کشت گردید. هر تیمار حداقل شامل سه تکرار بود. کشت­ها در فیتوترون در شرایط روشنایی قرار داده شدند.

انتقال پینه­های به دست آمده در شرایط روشنایی به محیط باززایی: پینه­های حاصل از بهترین تیمارها در شرایط روشنایی، جهت القاء شاخه­زایی، به محیط باززایی انتقال داده شدند. به همین منظور، قطعات سه میلی­متری از پینه­های حاصل، در محیط MS حاوی هورمون BAP با دو غلظت یک و سه میلی­گرم در لیتر کشت شده و در فیتوترون قرار داده شدند. پس از شش هفته، صفاتی از قبیل درصد باززایی و تعداد شاخسار­ها ارزیابی شدند.

بهینه­سازی ریشه­زایی در گیاهچه­های حاصل از باززایی: برای طویل شدن و نیز ریشه­دار شدن، گیاهچه­های حاصل از باززایی به محیط MS پایه فاقد هورمون و حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز منتقل شدند. پس از سه هفته، درصد ریشه­دهی ارزیابی گردید.

انتقال گیاهچه­های ریشه­دار شده به خاک و سازگاری گیاهان به شرایط طبیعی: پس از رشد و ریشه­دار شدن گیاهچه­ها در شرایط درون­شیشه­ای، جهت انتقال و سازگاری آنها به شرایط طبیعی، ابتدا گیاهچه­ها از محیط کشت خارج و ریشه­ها با آب جاری شسته شدند. سپس گیاهچه­ها به خاک (خاک زراعی- خاک برگ- پیت ماس به نسبت1:1:1) انتقال داده شدند.

روش تجزیه‌وتحلیل داده­ها: برای تجزیه‌وتحلیل داده­ها از نرم­افزار SPSS ver 21° استفاده شد و مقایسه میانگین­ها توسط آزمون دانکن مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

القاء پینه و تولید پینه­های جنین­زا در شرایط تاریکی: در آزمایش پینه­زایی در شرایط تاریکی، پینه­زایی از هفته چهارم به بعد در محل برش ریزنمونه­ها مشاهده شد. پینه­های به دست آمده از ریزنمونه برگی حالت فشرده­تری داشته و بیشتر مایل به زرد بودند. در صورتی­که پینه­های مشتق شده از ریزنمونه دمبرگ بیشتر سفید مایل به کرم و دارای ظاهری آبکی (شیشه­ای) بودند. برای هر دو نوع ریزنمونه در تیمار کنترل هیچ‌گونه آثاری از پینه­زایی مشاهده نشد. در تیمارهای هورمونی حاوی هورمون 2,4-D و نیز ترکیب هورمون 2,4-D و BAP، پینه­زایی تقریباً به مقدار مساوی (ازنظر حجم) مشاهده شد. آثار اندام­زایی (تولید ریشه) در پینه­های حاصل از تیمارهای هورمونی حاوی هورمون 2,4-D و ترکیب دو هورمون مشاهده گردید (شکل 1).

 

شکل 1- پینه­های مشتق شده از ریزنمونه­های برگی با ساختار فشرده (سمت راست) و متمایل به تولید اندام ریشه (سمت چپ)

نتایج تجزیه آماری نشان داد که غلظت­های مختلف هورمون 2,4-D و BAP تأثیر معنی­داری روی پینه­زایی و به­ویژه صفت وزن پینه­های بدست آمده از هر دو نوع ریزنمونه دارد (جدول 1).

 

جدول 1- پینه­زایی از ریزنمونه­های برگ و دمبرگ گیاه سنبل­الطیب در شرایط تاریکی روی محیط حاوی غلظت­های مختلف هورمون 2,4-D و BAP. داده­ها میانگین حداقل سه تکرار می­باشند.

شماره محیط

غلظت BAP

غلظت 2,4.D

درصد پینه­زایی

از برگ

میانگین وزن پینه­های برگ (gr)

درصد پینه­زایی

از دمبرگ

میانگین وزن پینه­های دمبرگ (gr)

1

0

0

0 ± 0 c

0 ± 0 d

0 ± 0 b

0 ± 0 h

2

5/0

0

5/12 ± 75  b

006/0 ± 01/0  d

0 ± 100 a

012/0 ± 02/0  f

3

1

0

25/6 ± 75  b

006/0 ± 01/0 d

0 ± 100 a

0 ± 01/0 g

4

0

1

0 ± 100 a

035/0 ± 1/0 c

5/12 ± 67/91 a

01/0 ± 07/0 e

5

5/0

1

0 ± 100 a

051/0 ± 19/0 b

0 ± 100 a

006/0 ± 12/0 c

6

1

1

0 ± 100 a

012/0 ± 19/0 b

0 ± 100 a

015/0 ± 17/0 a

7

0

2

0 ± 100 a

01/0 ± 11/0 c

0 ± 100 a

006/0 ± 09/0 d

8

5/0

2

0 ± 100 a

015/0 ± 17/0 b

0 ± 100 a

047/0 ± 16/0 b

9

1

2

0 ± 100 a

026/0 ± 28/0 a

5/12 ± 67/91 a

021/0 ± 16/0 b

حروف متفاوت روی داده­ها نشان­دهنده اختلاف معنی­دار آنها در مقایسه با داده­های همان ستون در سطح احتمال 0.05 P< می­باشند. غلظت هورمون­ها براساس میلی­گرم بر لیتر نشان داده شده است.

 

در ریزنمونه برگ، تمام ریزنمونه­ها در محیط­های حاوی 2,4.D پینه­زایی نشان دادند و بطور کلی، اضافه کردن BAP در غلظت­های مورد آزمایش، تأثیر مثبت روی رشد پینه و افزایش وزن آنها داشت (جدول 1). در ریزنمونه دمبرگ، درصد پینه­زایی در محیط­های حاوی هر دو نوع هورمون اختلاف معنی­داری نشان نداد، اما بالاترین وزن پینه در محیط حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4.D و یک میلی­گرم در لیتر BAP بدست آمد (جدول 1). بطور کلی، بیشترین درصد پینه­زایی و وزن پینه در ریزنمونه برگی حاوی دو میلی­گرم در لیتر 2,4.D و یک میلی­گرم در لیتر BAP مشاهده گردید (جدول 1). از جمع­بندی این نتایج، به نظر می­رسد که در دمبرگ غلظت اکسین­های طبیعی گیاه سنبل­الطیب نسبت به برگ بالا بوده و ازاین‌رو در سطوح پایین­تری از اکسین خارجی به حد اشباع رسیده و غلظت­های بالاتر، تأثیر منفی روی رشد پینه داشته است.

انتقال پینه­های به دست آمده در شرایط تاریکی به محیط باززایی: جهت بررسی باززایی پینه­های بدست آمده در شرایط تاریکی، نمونه­های پینه از هر دو نوع ریزنمونه و از تیمارهایی که شکل ظاهری پینه­ها زرد تیره و به نظر جنین­زا بود (محیط­های شماره 4، 5، 6، 8 و 9 براساس جدول شماره 1)، به محیط باززایی (حاوی دو میلی­گرم در لیتر هورمون BAP یا TDZ به تنهایی، و یا یک میلی­گرم در لیتر از هرکدام) جهت القاء شاخه­زایی انتقال داده شدند. پس از حدود یک هفته، رشد محسوس پینه­ها قابل‌مشاهده بود و ظاهر آنها در اکثر تیمارها فشرده و به رنگ سبز تیره بودند (شکل 2). از هفته دوم به بعد، آثار اندام­زایی در تیمارها مشاهده گردید. بااین‌حال، اکثر اندام­های تشکیل شده، ریشه­های سفید و یا سبز تیره بوده و تشکیل اندام­های هوایی تنها در تیمار دو میلی­گرم بر لیتر TDZ به مقدار بسیار کم (6 درصد) مشاهده شد.

باتوجه به اثر بهتر TDZ روی رشد پینه­های سبزرنگ (شکل 2)، تأثیر افزایش غلظت آن روی بهینه­سازی باززایی اندام ساقه بررسی گردید. نتایج نشان داد که افزایش غلظت این هورمون، تأثیری روی باززایی اندام نداشته و تنها باعث افزایش سرعت رشد و حجم پینه­ها می­شود.

 

شکل 2- رشد و اندام­زایی از پینه­های القا شده در تاریکی روی
محیط­های باززایی حاوی هورمون­های BAP (mg/l 2) (الف)، ترکیب BAP (mg/l 1) و  TDZ (mg/l 1) (ب)، و TDZ (mg/l 2) (ج).

القاء پینه و تولید پینه­های جنین­زا در شرایط روشنایی: برای بررسی اثر نور روی القای پینه و باززایی از سه نوع ریزنمونه گیاه سنبل­الطیب (ریشه، برگ و دمبرگ)، آزمایشی دیگر با استفاده از همان نه نوع ترکیب هورمونی ذکر شده در جدول یک انجام شد.

نتایج آزمایش القای پینه در روشنایی نشان داد که در ریزنمونه برگی، محیط­های حاوی تنها BAP قادر به القای کارآمد پینه در روشنایی نیستند (جدول 2)، در صورتیکه، تمام ریزنمونه­ها در محیط­های حاوی 2,4.D و صرف­نظر از وجود BAP، پینه­زایی داشتند (جدول 2). البته، رشد پینه در تیمار­های مختلف تفاوت معنی­داری نشان داد (جدول 2)، که بیشترین مقدار آن (4/0 گرم) در محیط حاوی یک میلی­گرم در لیتر 2,4.D و 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP بدست آمد.

در نمونه دمبرگ، در غلظت­های بالای 2,4.D القای پینه انجام نشد (جدول 2). این نتایج، موافق با نتایج بدست آمده از آزمایش تاریکی، نشان می­دهد که احتمالاً تجمع اکسین­های داخلی گیاه در دمبرگ بیشتر از برگ بوده، و به همین دلیل، زودتر از برگ به حالت اشباع ازنظر نیاز به اکسین خارجی برای تکثیر سلولی می­رسد. برای این ریزنمونه، بیشترین پینه­زایی و وزن پینه، در تیمار حاوی تنها 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP بدست آمد. بااین‌حال، رشد پینه در ریزنمونه دمبرگ به‌مراتب ضعیف­تر از رشد پینه­های بدست آمده از نمونه­های برگی بود (جدول 2) و بنابراین، ریزنمونه برگی برای ادامه کار مناسب­تر تشخیص داده شد.

 

جدول 2- پینه­زایی از ریزنمونه­های برگ و دمبرگ گیاه سنبل­الطیب در شرایط روشنایی روی محیط حاوی غلظت­های مختلف هورمون 2,4-D و BAP. داده­ها میانگین حداقل سه تکرار می­باشند.

شماره محیط

غلظت BAP

غلظت 2,4.D

درصد پینه­زایی

از برگ

میانگین وزن پینه­های برگ (gr)

درصد پینه­زایی

از دمبرگ

میانگین وزن پینه­های دمبرگ (gr)

1

0

0

0 ± 0 c

0 ± 0e

0 ± 0 b

0 ± 0c

2

5/0

0

0 ± 0 c

0 ± 0 e

6/9 ± 89/88 a

012/0 ± 03/0  a

3

1

0

17 ± 22/22  b

002/0 ± 005/0 e

6/9 ± 89/88 a

0 ± 02/0 b

4

0

1

0 ± 100 a

008/0 ± 15/0 b

6/9 ± 11/11 b

0 ± 0 c

5

5/0

1

0 ± 100 a

025/0 ± 4/0 a

6/16 ± 67/66 a

0 ± 0 c

6

1

1

0 ± 100 a

005/0 ± 13/0 b

6/9 ± 23/22 b

015/0 ± 01/0 bc

7

0

2

0 ± 100 a

005/0 ± 05/0 d

0 ± 0 b

0 ± 0 c

8

5/0

2

0 ± 100 a

003/0 ± 01/0 e

0 ± 0 b

0 ± 0 c

9

1

2

0 ± 100 a

008/0 ± 11/0 c

0 ± 0 b

0 ± 0 c

حروف متفاوت روی داده­ها نشان­دهنده اختلاف معنی­دار آنها در مقایسه با داده­های همان ستون در سطح احتمال 0.05 P< می­باشند. غلظت هورمون­ها براساس میلی­گرم بر لیتر نشان داده شده است.

 

در خصوص ریزنمونه ریشه، نتایج قابل‌توجهی از القای پینه بدست نیامد و تنها محیط حاوی 5/0 میلی­گرم در لیتر BAP بصورت ضعیف (حدود 33 درصد) پینه­زایی نشان داد و بنابراین، نتایج آن در جدول 2 نیامده است.

انتقال پینه­های به‌دست‌آمده در شرایط روشنایی به محیط باززایی: برای بررسی باززایی اندام ساقه از پینه­های بدست­آمده در روشنایی، قطعات 5/0 سانتی­متری از پینه­ها به محیط باززایی حاوی هورمون BAP با دو غلظت یک و سه میلی­گرم در لیتر انتقال داده شدند. پس از چهار هفته، شاخه­زایی در نمونه­های کشت شده مشاهده شد (شکل 3). درصد باززایی در محیط حاوی سه میلی­گرم در لیتر BAP (100 درصد) بطور معنی­داری بیشتر از درصد باززایی در محیط حاوی یک میلی­گرم در لیتر BAP (30 درصد) بود. در هفته پنجم تا ششم، گیاهچه­ها برای رشد بیشتر به ظرف شیشه­ای حاوی محیط MS فاقد هورمون منتقل شدند (شکل 3-الف). پس از دو هفته، گیاهچه­ها رشد کرده و ریشه­های کافی برای انتقال به خاک تولید کردند (شکل 3-ب و ج). گیاهچه­های منتقل شده به خاک دارای فنوتیپ عادی بوده و بصورت طبیعی در گلخانه رشد کردند (شکل 3-د).

 

شکل 3- باززایی ساقه و انتقال گیاهچه­های تشکیل شده در محیط درون­شیشه­ای به محیط خاک. (الف) اندام­زایی از پینه­های القا شده در روشنایی روی محیط­های باززایی حاوی سه میلی­گرم در لیتر هورمون BAP. (ب) رشد و ریشه­زایی گیاهچه­های باززایی شده در محیط درون­شیشه­ای. (ج) گیاهچه رشد کرده حاوی ریشه، مناسب برای انتقال به خاک. (د) سازگاری گیاهچه­های منتقل شده به خاک در گلخانه.

ازنظر تعداد سرشاخه­های تشکیل شده به ازای هر ریزنمونه، اختلاف معنی­داری بین دو تیمار دیده شد، و تیمار 3 میلی­گرم در لیتر با میانگین تعداد سرشاخه هفت عدد، بیشتر از تیمار یک میلی­گرم در لیتر BAP با میانگین 5/3 بود.

بحث و نتیجه­گیری

گیاه دارویی سنبل­الطیب بانام علمی Valeriana officinalis به‌صورت سنتی و به طور گسترده در صنایع داروسازی ایران مورد استفاده قرار می­گیرد(18). تکنیک­های کشت بافت و باززایی درون­شیشه­ای، علاوه بر ایجاد ابزار لازم برای تکثیر سریع و کم­هزینه گیاهان دارویی، نقش بسیار مهمی، در نژادی مولکولی آنها با استفاده از تکنولوژی DNAی نوترکیب به‌ویژه در جهت بهبود بیوسنتز متابولیت­های ثانویه دارویی دارند. تا بحال چندین گزارش از پینه­زایی و اندام­زایی از گیاه سنبل­الطیب گزارش شده است که اکثراً تولید پینه و اندام­زایی ریشه (7، 20و 23) و در موارد محدودی تولید شاخه و اندام هوایی بوده است (3). باتوجه به اهمیت دارویی این گیاه در ایران، بهینه­سازی پینه­زایی و باززایی اندام ساقه از ریزنمونه­های برگ و دمبرگ (با توجه به دسترسی آسان به این ریزنمونه­ها) این گیاه در دو شرایط نوری (تاریکی و فتوپریود 16 ساعت روشنایی/8 ساعت تاریکی) بررسی شد. در شرایط تاریکی، تمام نمونه­های برگ و دمبرگ در محیط­های حاوی دو نوع هورمون BAP و 2,4.D پینه­زایی نشان دادند (جدول1). بااین‌حال، رشد پینه در تیمارهای مختلف متفاوت بود (شکل 1). اثر هورمون­های اکسین و سیتوکنین در تقسیم سلولی و تولید توده سلولی پینه شناخته شده است (17و 19). نکته جالب اینکه، رشد پینه­های حاصل از ریزنمونه دمبرگ در محیط حاوی یک میلی­گرم در لیتر BAP و یک میلی­گرم در لیتر 2,4.D حداکثر بود و برخلاف ریزنمونه برگی، با افزایش غلظت اکسین در دمبرگ افزایش رشد و افزایش وزن پینه­ها مشاهده نشد (جدول 1). این مشاهده، توزیع قطبی و نامتقارن اکسین در اندام­های دمبرگ و برگ گیاه را نشان می­دهد که قبلاً در مطالعات دیگر برای کنترل صفات مختلف نیز به اثبات رسیده است (9، 11و 22). پینه­های ایجاد شده در تاریکی، قدرت باززایی ساقه روی محیط­های مورد آزمایش را نداشتند. بااین‌حال، تولید ریشه و رشد پینه در تعدادی از محیط­ها مطلوب بود (شکل 2)، و از آنجا که در زمان باز کردن درب پتری­دیش بوی غلیظی از نمونه­ها احساس می­شد، به نظر تولید متابولیت­های ثانویه فرار با کارآیی بالایی در این پینه­ها ایجاد شده بود، پدیده­ای که در پژوهش­های قبلی نیز گزارش شده (1، 2و 7) و نیاز به مطالعه بیشتر دارد.

برخلاف پینه­های بدست آمده در تاریکی، پینه­های القا شده در روشنایی روی همان محیط­ها، قابلیت باززایی خوبی روی محیط­های مورد آزمایش به‌ویژه محیط حاوی سه میلی­گرم در لیتر BAP نشان دادند (شکل 3). این نتایج نشان می­دهد که تیمار روشنایی، در زمان پینه­زایی، سیگنال­هایی را، راه­اندازی می­کند که در ادامه راه برای باززایی ساقه مهم می­باشند (13و 16). حداکثر تعداد شاخه به ازای نیم سانتی­متر مربع از پینه­های القا شده از نمونه­های برگی در شرایط روشنایی، هفت شاخه بود که در تیمار سه میلی­گرم در لیتر BAP بدست آمد. تمام گیاهچه­های باززایی شده، به‌راحتی در محیط فاقد هورمون قادر به ریشه­زایی بودند (شکل 3) و استقرار و سازگاری آنها در محیط خاک و گلخانه با قابلیت بالایی (100 درصد) انجام گرفت.

این نتایج، علاوه بردادن اطلاعات خوبی در خصوص تأثیر فاکتورهای شیمیایی (از قبیل هورمون­ها) و فیزیکی (از قبیل نور) روی پتانسیل پینه­زایی و اندام­زایی از ریزنمونه­های مختلف گیاه سنبل­الطیب، یک سیستم کارآمد باززایی کامل برای این گیاه معرفی می­کند که می­تواند در تکثیر سریع رویشی، نگهداری ژرم­پلاسم، و برنامه­های اصلاح مولکولی از طریق مهندسی ژنتیک مورد استفاده قرار گیرد.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله از دانشگاه شهید مدنی آذربایجان برای حمایت مادی و معنوی این پژوهش قدردانی می­نمایند.

1- مفید بجنوردی، م.، اقدسی، م.، میان­آبادی، م.، و نداف، م.، 1395. بهینه­سازی تولید کالوس و تولید افدرین در گیاه افدرا (Ephedra major)، مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست­شناسی گیاهی ایران)، جلد 29، شماره 1، صفحات 209-199.

2- رحمتی، ز.، پیام­نور، و.، قاسمی بزدی، ک.، و ابراهیمی، پ.، 1396. مقایسه میزان تاکسول تولید شده در شرایط درون­شیشه­ای با بافتهای طبیعی گیاه. مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست­شناسی گیاهی ایران)، جلد 30، شماره 1، صفحات 172-159.

 

3- Abdi, G. H., and Khosh‐Khui, M., 2007. Shoot regeneration via direct organogenesis from leaf segments of valerian (Valeriana officinalis L.). International Journal of Agricultural Research, 2, PP: 877-882.

4- Caudal, D., Guinobert, I., Lafoux, A., Bardot, V., Cotte, C., Ripoche, I., Chalard, P., and Huchet, C., 2018. Skeletal muscle relaxant effect of a standardized extract of Valeriana officinalis L. after acute administration in mice. Journal of Traditional and Complementary Medicine, 8, PP: 335-340.

5- de Oliveria, D. M., Barreto, G., De Andrade, D. V., Saraceno, E., Aon-Bertolino, L., Capani, F., Dos Santos, E., Bacha, R., and Giraldez, L. D., 2009. Cytoprotective effect of Valeriana officinalis extract on an in vitro experimental model of Parkinson disease. Neurochemical Research, 34, PP: 215-220.

6- Dugaheh, M. A., Meisami, F., Torabian, Z., and Sharififar, F., 2013. Antioxidant effect and study of bioactive components of Valeriana sisymbriifolia and Nardostachys jatamansii in comparison to Valeriana officinalis. Pakistan journal of pharmaceutical sciences, 26, PP: 53-58.

7- Ekhteraei, T. S., Radjabian, T., Ebrahimzadeh, H., and Niknam, V., 2010. Enhanced production of valerenic acids and valpotriates by in vitro cultures of Valeriana officinalis L. International Journal of Plant Production, 4, PP: 209-222.

8- Fernandez, S., Wasowski, C., Paladini, A. C., and Marder, M., 2004. Sedative and sleep-enhancing properties of linarin, a flavonoid-isolated fromValeriana officinalis. Pharmacology Biochemistry and Behavior, 77, PP: 399-404.

9- Grant, M. R., and Jones, J. D., 2009. Hormone (dis)harmony moulds plant health and disease. Science, 324, PP: 750-752.

10- Hattesohl, M., Feistel, B., Sievers, H., Lehnfeld, R., Hegger, M., and Winterhoff, H., 2008. Extracts of Valeriana officinalis L. s.l. show anxiolytic and antidepressant effects but neither sedative nor myorelaxant properties. Phytomedicine, 15, PP: 2-15.

11- Immanen, J., Nieminen, K., Smolander, O. P., Kojima, M., Alonso Serra, J., Koskinen, P., Zhang, J., Elo, A., Mähönen, A. P., Street, N., Bhalerao, R. P., Paulin, L., Auvinen, P., Sakakibara, H., and Helariutta, Y., 2016. Cytokinin and auxin display distinct but interconnected distribution and signaling profilesto stimulate cambial activity. Current Biology, 26, PP: 1990-1997.

12- Jung, H. Y., Yoo, D. Y., Kim, W., Nam, S. M., Kim, J. W., Choi, J. H., Kwak, Y. G., Yoon, Y. S., and Hwang, I. K., 2014. Valeriana officinalis root extract suppresses physical stress by electric shock and psychological stress by nociceptive stimulation-evoked responses by decreasing the ratio of monoamine neurotransmitters to their metabolites. BMC Complementary and Alternative Medicine, 14, 476 p.

13- Motte, H., Vereecke, D., Geelen, D., and Werbrouck, S., 2014. The molecular path to in vitro shoot regeneration. Biotechnology Advances, 32, PP: 107-121.

14- Murashige, T., and Skoog, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum, 15, PP: 473-497.

15- Nam, S. M., Choi, J. H., Yoo, D. Y., Kim, W., Jung, H. Y., Kim, J. W., Kang, S. Y., Park, J., Kim, D. W., Kim, W. J., Yoon, Y. S., and Hwang, I. K., 2013. Valeriana officinalis extract and its main component, valerenic acid, ameliorate D-galactose-induced reductions in memory, cell proliferation, and neuroblast differentiation by reducing corticosterone levels and lipid peroxidation. Experimental Gerontology, 48, PP: 1369-1377.

16- Nameth, B., Dinka, S. J., Chatfield, S. P., Morris, A., English, J., Lewis, D., Oro, R., and Raizada, M. N., 2013. The shoot regeneration capacity of excised Arabidopsis cotyledons is established during the initial hours after injury and is modulated by a complex genetic network of light signalling. Plant, Cell & Environment, 36, PP: 68-86.

17- Pernisova, M., Kuderova, A., and Hejatko, J., 2011. Cytokinin and auxin interactions in plant development: metabolism, signalling, transport and gene expression. Current Protein & Peptide Science, 12, PP: 137-147.

18- Safaralie, A., Fatemi, S., and Sefidkon, F., 2008. Essential oil composition of Valeriana officinalis L. roots cultivated in Iran. Comparative analysis between supercritical CO2 extraction and hydrodistillation. Journal of Chromatography A, 1180, PP: 159-164.

19- Schaller, G. E., Bishopp, A., and Kieber, J. J., 2015. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell, 27, PP: 44-63.

20- Shekarchian, A., Rahmani, G. H., Kudori, M. R., and Zeidabadi, D. D., 2016. Direct embryogenesis of Valerian (Valeriana officinalis L.) using leaf segments. Journal of Biodiversity and Environmental Sciences, 9, PP: 113-120.

21- Tansaz, M., Zamani, A., and Otroshy, M., 2014. Rapid in vitro shoot regeneration of Valeriana officinalis. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 24, PP: 263‐271.

22- Teribia, N., Tijero, V., and Munne-Bosch, S., 2016. Linking hormonal profiles with variations in sugar and anthocyanin contents during the natural development and ripening of sweet cherries. New Biotechnology, 33, PP: 824-833.

23- Zebarjadi, A. R., Najafi, S. H., Ghasempour, H. R., and Motamedi, J., 2011. Establishment of a practical tissue culture for producing hairy roots of Valeriana officinalis L. via Agrobacterium rhizogenes. Journal of Medicinal Plants Research, 5, PP: 4984‐4992.