نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تبریز

2 گروه زیست شناسی گیاهی دانشکده علوم طبیعی دانشگاه تبریز، ایران.

3 گروه زیست شناسی گیاهی دانشکده علوم طبیعی دانشگاه تبریز، ایران

چکیده

شکل‌گیری دانه یکی از مراحل مهم تولید مثل در گیاهان دانه‌دار به شمار می‌رود. در این پژوهش بررسی تکوین تخمک، اندوسپرم و رویان زایی گیاه قیچ با استفاده از تکنیک‌های میکروسکوپی مدنظر قرار گرفته است. نمونه‌ها از مراحل مختلف نموی جمع‌آوری و تثبیت گردیدند، نمونه‌های تثبیت‌شده با روش-های رنگ‌آمیزی مختلف هیستولوژیکی و سیتوشیمیایی مطالعه شدند. مشاهدات اولیه نشان داد که تخمک از نوع واژگون و دو پوسته‌ای است. پوشش خارجی تخمک در طی تکوین، به تزئینات پوسته دانه تبدیل می‌گردد؛ بنابراین دانه از نوع تستایی است. در دانه قیچ آندوسپرم ابتدا از نوع هسته‌ای می‌باشد؛ این امر ارتباط رویان با بافت اندوسپرم را سهولت می‌بخشد. با ادامه نمو دانه روند سلولی شدن آندوسپرم دیده می‌شود. آندوسپرم سلولی شده در این گیاه به-تدریج به سمت فضاهای مرکزی کیسه جنینی توسعه پیدا می‌کند و کل فضای کیسه جنینی را اشغال می‌نماید. درواقع دانه از نوع اندوسپرم دار بوده و بافت اندوسپرم تا مرحله رویان بالغ باقی مانده و تحلیل نمی‌رود. همچنین مراحل رویان کروی، قلبی، اژدری و رویان بالغ به همراه بخش‌های مریستم انتهای ریشه، هیپوکوتیل، مریستم انتهای ساقه و لپه‌ها مشخص مشاهده شد. نتایج سیتوشیمیایی نشان داد که با رشد بیشتر دانه، تشکیل دانه‌های انبوه نشاسته و به دنبال آن ضخیم‌شدگی دیواره‌ها اتفاق می‌افتد که موجب کاهش شدید حفره‌های سلولی و نیز سخت شدن این بافت می‌گردد. از طرفی مشخص شد که فراوانی مواد ذخیره‌ای لیپیدی در بافت اندوسپرم نسبت به مواد پروتئینی بیشتر است. بر خلاف اندوسپرم، در بافت رویان بالغ مواد کربوهیدراتی با رنگ آمیزی PAS تشخیص داده نشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Histological and Cytochemical Study of Embryogenesis stages in Zygophyllum fabago

نویسندگان [English]

  • Mina Kazemian 1
  • Fatemeh Majidzadeh 2
  • Mahbubeh Aliasgharpour 3

2 Department of Plant Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Iran

3 Department of Plant Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Iran

چکیده [English]

The formation of the seed is part of the process of reproduction in seed plants. The study of the ontogeny of endosperm and embryogenesis was considered in current research using microscopic techniques. The samples were collected from different developmental stages. Then, the fixed samples were studied by different histochemical methods. The observations indicated that the ovule was of the anatropous and bitegmic type. The outer layers were removed in the early stages. Thus, the seeds of Z. fabago were categorized of testal type. During the early developmental stages, the endosperm was of nuclear type and then changed into the cellular type. This makes it easier for the embryo to connect with endosperm tissue in early stages. The endosperm develops gradually toward the central spaces and occupies the entire space of the embryo sac. In fact, the endosperm tissue remains until mature embryo stage and was not degenerated. Also globular, heart-shaped, torpedo-shaped and mature embryo stages along with the RAM, hypocotyl, and SAM were observed. Cytochemical tests indicated that in the later stage of seed development, the formation of starch grains and the strongly thickening of cell walls were occurred, causing considerable reduction of cell cavities as well as hardening of this tissue. In the other hand, the cell storage in the endosperm tissue was more lipid-based than proteinaceous compounds. But in mature embryo no carbohydrate was detected.

کلیدواژه‌ها [English]

  • bitegmic
  • embryo
  • histological techniques
  • nuclear endosperm

بررسی بافت شناختی و سیتوشیمیایی مراحل مختلف رویانزایی گیاه قیچ

الهام محجل کاظمی1*، مینا کاظمیان1، فاطمه مجیدزاده1 و محبوبه علی اصغرپور1

۱ ایران،دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی گروه زیست گیاهی.

تاریخ دریافت: 12/09/1397          تاریخ پذیرش: 26/01/1398

چکیده

شکل­گیری دانه یکی از مراحل مهم تولید مثل در گیاهان دانه­دار به شمار می­رود. در این پژوهش بررسی تکوین تخمک، اندوسپرم و رویان زایی گیاه قیچ (Zygophyllum fabago) با استفاده از تکنیک­های میکروسکوپی مدنظر قرار گرفته است. نمونه­ها از مراحل مختلف نموی جمع­آوری و تثبیت گردیدند، سپس نمونه­های تثبیت­شده با روش­های رنگ­آمیزی مختلف هیستولوژیکی و سیتوشیمیایی مطالعه شدند. مشاهدات اولیه نشان داد که تخمک از نوع واژگون و دو پوسته‌ای است. پوشش خارجی تخمک در طی تکوین، به تزئینات پوسته دانه تبدیل می­گردد؛ بنابراین دانه از نوع تستایی است. در دانه قیچ آندوسپرم ابتدا از نوع هسته­ای می­باشد؛ این امر ارتباط رویان با بافت اندوسپرم را سهولت می­بخشد. با ادامه نمو دانه روند سلولی شدن آندوسپرم دیده می­شود. آندوسپرم سلولی شده در این گیاه به­تدریج به سمت فضاهای مرکزی کیسه جنینی توسعه پیدا می­کند و کل فضای کیسه جنینی را اشغال می­نماید. درواقع دانه از نوع اندوسپرم دار بوده و بافت اندوسپرم تا مرحله رویان بالغ باقی مانده و تحلیل نمی­رود. همچنین مراحل رویان کروی، قلبی، اژدری و رویان بالغ به همراه بخش­های مریستم انتهای ریشه، هیپوکوتیل، مریستم انتهای ساقه و لپه­ها مشخص مشاهده شد. نتایج سیتوشیمیایی نشان داد که با رشد بیشتر دانه، تشکیل دانه­های انبوه نشاسته و به دنبال آن ضخیم­شدگی دیواره­ها اتفاق می­افتد که موجب کاهش شدید حفره­های سلولی و نیز سخت شدن این بافت می­گردد. از طرفی مشخص شد که فراوانی مواد ذخیره­ای لیپیدی در بافت اندوسپرم نسبت به مواد پروتئینی بیشتر است. بر خلاف اندوسپرم، در بافت رویان بالغ مواد کربوهیدراتی با رنگ آمیزی PAS تشخیص داده نشد.

واژه های کلیدی: اندوسپرم هسته­ای، دو پوسته­ای، رویان، روش­های بافت­شناسی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 04132808955 ، پست الکترونیکی: e.mohajelkazemi@tabrizu.ac.ir

مقدمه

 

تیره زیگوفیلاسه به 5 زیرتیره تقسیم می­شود و شامل 27 جنس و 285 گونه است که معمولاً گیاهان این تیره علفی و یا به صورت درختچه و درختی هستند (29). یکی از بزرگترین زیر خانواده­های این تیره، Zygophilloideae است که جنس­های Zygophyllum،  Roeper،Melocarpum، Fagonia، Augea و Tetraena را شامل می شود (2)، هرچند همچنان مطالعات مولکولی در زمینه ی ارتباط فیلوژنتیکی و رده­بندی این تیره وجود دارد (1). جنس Zygophyllum متعلق به این تیره می‌باشد که دارای دو گونه Z. album , Z. fabago است و به‌طور گسترده‌ای در مناطق مدیترانه‌ای رویش دارد. تعداد برچه­های مادگی بین 2 تا 12 عدد  در این تیره متغیر بوده و هر خانه‌ی تخمدان محتوی تخمک­های غالباً واژگون با میوه کپسول است. Z. fabago (گیاه قیچ) گیاهی پایا و چندساله، علفی یا چوبی، به ارتفاع 40 تا 90 سانتی‌متر، تخمدان دارای 4 تا 5 خانه، محتوی دو یا چند تخمک و شامل دانه‌های مسطح و ناصاف می­باشد (4).

فرآیند تشکیل دانه در گیاهان به عنوان یک مرحله مهم محسوب می­گردد زیرا این فرآیند برای ایجاد گیاه جوان به طریق تولیدمثل جنسی و ادامه حیات گونه الزامی می­باشد (6). دانه از تخمک لقاح یافته حاصل می­شود و از سه بخش پوسته­ی دانه، اندوسپرم و رویان تشکیل شده است (25). پوسته دانه پوشش خارجی احاطه‌کننده‌ی رویان در گیاهان به شمار می‌آید که از پوشش یا پوشش‌های تخمک حاصل می‌گردد (8). در اغلب دانه‌ها بافت‌های ساختمانی پوشش تخمک در طی نمو دانه تخریب ‌شده و پوسته دانه صرفاً از بقایای پوشش‌های تخمک حاصل می‌شود (19)  و ممکن است این سلول‌ها با تغییرات مورفولوژیکی به تزئینات متفاوتی دست یابند (9). در تکوین مادگی در ابتدا تخمک‌ها به شکل برجستگی کوچک در جدار تخمدان پدیدار می‌شوند. در رایج­ترین نوع نمو تخمک، پس از شکل‌گیری تخمک‌ها به دنبال رشد سریع یکی از یاخته‌های خورش، یاخته مادر مگاسپور تمایز می‌یابد که با تقسیم میوزی موجب تشکیل تتراد می­شود . یک سلول، به تقسیمات میتوزی ادامه می‌دهد و کیسه رویانی را می‌سازد که پس از تندش دانه گرده، لوله گرده روی کلاله نفوذ کرده و یکی از آنتروزوئید­ها با تخمزا ترکیب شده و سلول تخم را تشکیل می‌دهند (8). درنهایت با ادامه تقسیمات رویان شانزده سلولی و کروی شکل می‌گیرد. مرحله‌ی رویان کروی با تشکیل لپه‌ها در دو طرف مریستم رأسی ساقه، رویان قلبی را ایجاد کرده و پس از تمایزات سلولی رویان اژدری و در انتها رویان لپه‌ای پدیدار می‌گردد (8).

 شاخص‌های مربوط به دانه مانند مورفولوژی، رنگ و اندازه دانه، ساختار و ترکیبات پوسته دانه، شکل رویان، نوع ذخایر دانه و وجود یا فقدان اندوسپرم دارای ارزش تاکسونومیکی به ویژه در سطح جنس می‌باشند (10). این شاخص‌ها به خصوص با کاهش ویژگی‌های رویشی و کاهش گل که تعیین روابط فیلوژنتیکی را مشکل می‌نماید، موردتوجه قرار می‌گیرند (13). در حال حاضر از الگوهای تکوینی دانه جهت اهداف مختلفی استفاده می­شود: حل مشکلات رده‌بندی، ایجاد رابطه خویشاوندی تکاملی و کاربرد آن به عنوان مارکرهای ژنتیکی جهت تعیین ژنوتیپ (28).

اندوسپرم گیاهان گل‌دار درنتیجه‌ی لقاح مضاعف و به دنبال الحاق هسته‌های قطبی سلول مرکزی کیسه رویانی با اسپرم حاصل شده است (16). به‌طورمعمول سلول‌های اندوسپرمی تریپلوئید و یا پلی پلوئید می‌باشند (14). ساختار کیسه جنینی و فرایند لقاح مضاعف در تعیین درجه پلوئیدی اندوسپرم نقش دارند (25) عموماً بر اساس روند تکوین، اندوسپرم به سه نوع تقسیم می‌شود: اندوسپرم هسته‌ای، اندوسپرم سلولی و اندوسپرم هلوبیال. اندازه و ساختار اندوسپرم در دانه‌های بالغ تیره‌های مختلف گیاهی متفاوت است (15).

با توجه به اهمیت بافت اندوسپرم به عنوان بافتی مغذی برای تغذیه رویان در گیاهان گلدار و نیز نحوه تقسیمات سلولی متفاوت این بافت، نحوه نمو و تغییراتی که در مراحل مختلف تکوینی آن اتفاق می­افتند ضرورت مطالعه این بافت را تبیین می­کنند. ناهمگنی در تیره زیگوفیلاسه زیاد بوده در نتیجه مطالعه هر یک از گونه ها از دیدگاه آناتومی می تواند بعدها در تفکیک جنس های این تیره کمک کند و این امر اهمیت مطالعه ی جنس های این تیره از لحاظ تاکسونومی را نشان می دهد. از آنجاییکه گیاه Z. fabago در نواحی شمال ایران، آذربایجان، خراسان و اطراف تهران می­روید و گلدهی گیاه به مقدار فراوان در مدت زمان نسبتاً طولانی از سال (از اواخر بهار تا تقریباً اواخر تابستان) انجام می­گیرد، همچنین هر تخمدان محتوی تعداد زیادی از دانه (حدود 30 عدد) می­باشد، در نتیجه موجب گردیده تا این گیاه به عنوان نمونه مطلوب در تحقیق حاضر مورد استفاده قرار گیرد. مطالعه تخمک، مراحل تکوینی اندوسپرم و رویان و همچنین تغییرات هیستولوژیکی و سیتولوژیکی آنها از اهداف این پژوهش به شمار می­روند.

مواد و روشها

نمونه های گیاهی مورد استفاده در این پژوهش در مراحل مختلف نموی (مادگی غنچه­های نشکفته تا دانه­های بالغ) جهت بررسی های بافت شناسی، سیتوشیمیایی و تکوینی از محوطه دانشگاه تبریز جمع آوری شدند.

تهیه نمونه های Whole mount : به منظور مطالعه مقدار فضای اشغال شده توسط جنین در دانه، ابتدا دانه ها در محلول هیپوکلریت سدیم 0.5 درصد 60 درجه سانتیگراد قرار گرفتند و بعد از زایل شدن رنگ آنها بلافاصله به داخل آب مقطر منتقل شدند، برای شفاف شدن ابتدا 15 دقیقه در داخل الکل 97 درصد قرار گرفته و سپس به داخل محلول الکل-گزیلول منتقل شدند و با لوپ مناسب مطالعه و عکس­برداری گردیدند(7).

مطالعه بافت شناسی: نمونه­ها پس از تثبیت در فیکساتور (FAA) و فرمال کلسیم (جهت شناسایی ترکیبات فنولی و لیپید­ها)، گذراندن مراحل آب‌گیری با درجات رو به افزایش الکل، شفاف سازی با گزیلول، قالب گیری در پارافین، برش گیری با میکروتوم و درنهایت  نمونه‌ها با رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و سافرانین-فست گرین برای مطالعه با میکروسکوپ نوری آماده شدند (7).

مطالعه سیتوشیمیایی: شناسایی پلی ساکارید ها به روش Periodic Acid Schiff (PAS) با رنگ آمیزی هماتوکسیلن، لایت گرین و تولوئیدین بلو 2 درصد (7) صورت گرفت. جهت شناسایی لیپیدها با روش Gahan (1984) ، لامها پس از طی مراحل پارافین زدایی و آبدهی، با  Sudan Black Bرنگ آمیزی شدند. شناسایی پروتئین ها با روش کوماسی برلیانت بلو Gahan (1984) انجام شد.

نتایج

تکوین تخمک و اندوسپرم: برش­های تهیه شده از تخمدان­های گل­های گرده­افشانی نشده (غنچه­های 3 میلی­متری)، ویژگی­های تخمک واژگون گیاه
Zygophyllum fabago را آشکار نمود. تخمک در این گیاه دارای دو پوشش است (شکل 1-A, B) که در داخل سلول­های ردیف دوم پوشش خارجی تخمک، با انجام تست سیتوشیمیایی PAS دانه­های متعدد نشاسته مشخص گردید (شکل 1-C).

پوشش داخلی تخمک از سه تا چهار ردیف سلول تشکیل شده است و در ایجاد میکروپیل نقش دارند. لایه سلول اپیدرم و یک تا دو ردیف سلول پارانشیمی در فاصله میان آنها قرار دارد که همگی دورتا دور کیسه رویانی را احاطه کرده اند. دانه­های نشاسته در سلول­های اپیدرم خارجی به مقدار فراوان وجود دارد که با فلش مشخص شده است (شکل 1-C).

 

 

 

شکل 1- برش طولی تخمک رنگ­آمیزی شده با روش هماتوکسیلن. A, B: پوشش داخلی و خارجی تخمک. C: هسته­های آزاد اندوسپرم که هسته­ها

با فلش زرد رنگ و دانه­های نشاسته با فلش آبی مشخص شده است.D: شروع تقسیمات آندوسپرم قبل از نمو رویان. mi : میکروپیل، fu: فونیکول،  ii: پوشش داخلی تخمک، oi: پوشش خارجی تخمک، ch: شالاز، en: اندوسپرم، N: هسته، s: نشانسته.

 

با رشد بیشتر تخمدان، اندازه تخمک­ها نیز بزرگتر می­شود. در طول این مراحل و تکوین اندوسپرم، به تدریج لایه ­های پوشش تخمک دچار تغییر می­گردد. به گونه ای که کیسه جینی با سلول­های اندوسپرم پر می­شود (شکل 2-B, C).

با توجه به نمونه های مطالعه شده، بعد از لقاح در فضای کیسه جنینی هسته های آزاد اندوسپرم قابل مشاهده می باشد. در این مرحله هیچ­گونه دیواره­ای در اطراف هسته­ها دیده نمی­شود و تنها مقداری سیتوپلاسم اطراف هسته­های آزاد را فراگرفته است. بنابراین اندوسپرم تشکیل یافته در این گیاه در این مرحله از نوع اندوسپرم هسته­ای می­باشد. این هسته­ها به ­شکل رشته­ای در فضای کیسه جنینی قرار می­گیرند که با فلش نمایش داده شده است  (شکل1-C). در واقع هرچند تقسیم هسته­های آزاد اندوسپرم نسبت به سلول تخم سریعتر آغاز می­شود اما به نظر می­رسد فرآیند سیتوکینز به کندی ادامه پیدا می­کند. سپس هسته ها به حاشیه کیسه جنینی نقل مکان می­کنند و به صورت منظم در ردیفی قرار میگیرند ( شکل 2-A).

در مرحله بعد، در فضای کیسه جنینی دیواره­های متعددی مابین هسته­های آزاد تشکیل می­گردد ( شکل 2-B) و اندوسپرم به تدریج از سمت قطب میکروپیلی، سلولی می­شود. در نهایت در مرحله رویان کروی، فضای کیسه جنینی به­طور کامل با سلول­های اندوسپرم پر می­گردد ( شکل 2-C و شکل3-A). نتایج نشان می­دهد که بافت اندوسپرم تا مراحل پایانی تکوین دانه تحلیل نمی­رود، در نتیجه دانه از نوع اندوسپرم دار معرفی می­گردد (شکل 3-C,D).

با ادامه رشد جنین تا رسیدن به مرحله لپه­ای شکل، دانه­های نشاسته در سلول­های اندوسپرم تجزیه می­شوند (شکل 3-E). زمانیکه دانه زرد رنگ است، ضخیم­شدگی دیواره­های سلول­های اندوسپرم به حداکثر میزان خود می­رسد (شکل 2-D). تست­های سیتوشیمیایی نشان داد که ذخایر سلول در دانه بالغ، بیشتر لیپیدی است (شکل 2-E و F).

 

 

شکل 2- تکوین اندوسپرم و مواد ذخیره­ای آن در گیاه قیچ. A: مهاجرت هسته­های آزاد به حاشیه کیسه جنینی. B: سلولی شدن اندوسپرم (en) در بخش میکروپیلی. C: نمای کلی تخمک حاوی رویان کروی (em) که کامل شدن مرحله سلولی اندوسپرم را نیز نشان می­دهد. D: افزایش ضخیم

شدگی دیواره­های سلول­های آندوسپرم رنگ­آمیزی شده با روش PAS. E,F: وجود ذرات پروتئینی (pr) و ذرات لیپیدی (li) در اندوسپرم.

 

 

در واقع به طور کلی مراحل تکوین آندوسپرم گیاه قیچ در چند مرحله مشخص به شرح زیر است:

1- تقسیمات اولیه آندوسپرم و تشکیل آندوسپرم هسته­ای، 2- سلولی­شدن آندوسپرم، 3- ظهور دانه­های نشاسته در بافت آندوسپرم، 4- هیدرولیز دانه­های نشاسته، 5- ضخیم­شدگی غیریکنواخت دیواره­های سلول­های بافت آندوسپرم و درنتیجه ایجاد حفره­های سلولی کوچک یا نامنظم در این بافت (شکل 2-D)، 4- ذخیره­شدن مواد لیپیدی و پروتئینی در بافت آندوسپرم.

در آندوسپرم قیچ از آنجایی که در طول نمو رویان، کاهش دانه­های نشاسته دیده نمی­شود، به نظر می­رسد در گیاه قیچ دانه­های نشاسته در تغذیه رویانی نقش ندارند. از طرف دیگر با کاهش تدریجی آنها در اواخر مرحله رویانی، که همزمان با ضخیم شدن دیواره­ سلول­های آندوسپرم می­باشد، به نظر می­رسد که این دانه­ها درجهت ضخیم­شدن دیواره­ها به مصرف می­رسند(شکل 3-F). شاهد برای این امر مشاهده  دانه­های نشاسته­ای است که بخش­هایی از آن به­مصرف رسیده است. دیواره­های ضخیم آندوسپرم، حتی پس از بلوغ نیزباقی می­مانند(شکل 3-D).

رویان زایی: از تغییرات دانه طی رویان زایی می‌توان به سلولی شدن اندوسپرم در مرحله رویان کروی اشاره کرد (شکل 3-A). همچنین در مرحله رویان قلبی سلول­های ردیف اول اندوسپرم نسبت به سایر سلول­های بافت اندوسپرم کوچک‌ترند و این حالت تا پایان رشد دانه حفظ می­گردد (شکل 3-B). سپس با ادامه رشد رویان و رسیدن به مرحله اژدری شکل، دانه­های نشاسته در سلول­های اندوسپرم در حاشیه کیسه جنینی اندازه کوچک‌تری نسبت به دانه­های نشاسته سلول­های سایر بخش­های بافت اندوسپرم دارند (شکل 3-C). در ادامه نمو رویان، با تشکیل لپه­های کشیده، محور جنینی کامل می­شود. سلول­های درشت مرکزی بافت اندوسپرم توسط لپه­های رشد یافته جنین جایگزین شده و بافت اندوسپرم به­طور یکنواخت، به صورت 5-6 لایه فشرده اطراف جنین را احاطه می­کنند. بنابراین رویان بخش اعظم فضای کیسه جنینی را اشغال می­کند اما اندوسپرم به مقدار کمی تحلیل می­رود و تا انتهای تکوین دانه باقی می­ماند (شکل 3-C,D).

 

 

شکل 3- رویان گیاه قیچ. A: رویان کروی شکل. B: رویان قلبی شکل. C: رویان اژدری. D: رشد و گسترش لپه‌ها. E: آغاز ضخیم شدن دیواره­های سلول­های آندوسپرم و وجود دانه­های نشاسته بزرگتر (فلش زرد) در مرکز و دانه نشاسته کوچکتر در حاشیه بافت اندوسپرم (فلش مشکی). F: افزایش

هیدرولیز دانه­های نشاسته و ضخیم شدن دیواره­های سلول­های آندوسپرم همراه با نمو رویان. S: دانه نشاسته.

 

تمامی سلول­ها هنوز مملو از دانه­های نشاسته می­باشند و اندازه این دانه­ها نیز نسبت به مرحله جنین اژدری شکل درشت­تر شده است. رویان بالغ در این گیاه دارای هیپوکوتیل نسبتاً طویل بوده و لپه‌ها اندازه بزرگی دارند (شکل 4-A).

شکل 4 رویان بالغ را درگیاه قیچ نشان می دهد که تمام بخش­های آن شامل مریستم انتهای ریشه، هیپوکوتیل، مریستم انتهای ساقه و لپه­ها مشخص می باشد. مریستم راسی ریشه در قطب میکروپیلی رویان قرار گرفته و مریستم راسی ساقه درست در مقابل مریستم ریشه واقع شده است. مریستم راسی ریشه در این گیاه مریستمی فعال می­باشد که چندین لایه سلول کلاهک ریشه تولید کرده است. این سلول­ها در نتیجه تقسیمات مماسی مریستم ریشه حاصل شده اند. سلول­های کلاهک در اندازه کوچک و بسیار منظم در زیر مریستم راسی ریشه دیده می­شوند (شکل 4-B). همچنین سلول­های پروکامبیومی در بخش محوری میانی قابل مشاهده می­باشند. این سلول­ها درست از محل مریستم راسی ریشه شروع شده و تا انتهای لپه­ها امتداد می­یابند. مریستم راسی ساقه در این گیاه گنبدی شکل، فاقد ساختار لایه لایه (تونیکا) و منطقه بندی شده است. مریستم انتهایی ساقه در این گیاه فعالیت نکرده زیرا آغازه­های برگی مشاهده نمی­شوند (شکل 4-c). همچنین سطوح خارجی پروتودرم را در تمام قسمت­های رویان، لایه کوتیکول پوشانده است که بعد از رنگ آمیزی با معرف سودان سیاه  قابل تشخیص است (شکل 4-E). به طور کلی در هیپوکوتیل و لپه ها سه دسته سلول قابل تشخیص است که عبارتند از:

1- سلول­های پروتودرمی که این سلول­ها اندازه کوچک داشته، در یک ردیف قرار گرفته اند.

2- سلول­های پارانشیمی که در زیر سلول­های پروتودرمی

قرار گرفته، اندازه درشتری نسبت به سلول­های پروتودرمی داشته و بیشترین ذخایر را دارا می باشند.

3- دسته سوم سلول­های پروکامبیومی می باشند که سلول­هایی کشیده و باریک می باشند. مجموعه سلول­های پروکامبیومی در برش­های طولی به صورت استوانه ای یا در حقیقت محوری در هیپوکوتیل و در هر کدام از لپه ها دیده می شوند، که تا راس لپه کشیده می­شوند.

 شکل 4-D رویان­ گیاه قیچ را که با روش کوماسی برلیانت بلو رنگ آمیزی شده اند نشان می دهد. دانه های پروتئینی به رنگ آبی در شکل دیده می شوند. سلول­های پارانشیمی دارای اجسام پروتئینی با تراکم بیشتر می باشند، در حالیکه در سلول­های پروتودرمی و پروکامبیومی اجسام پروتئینی با تعداد کمتر دیده می شوند. سلول­های مریستم انتهای ساقه نیز فاقد اجسام پروتئینی می­باشند (شکل 4-D). شکل 4- E مربوط به رویان­ بالغ  است که با معرف سودان سیاه رنگ آمیزی شده است. این معرف علاوه بر لیپیدهای ذخیره ای، غشاها و لایه کوتیکول را نیز مشخص می­نماید. با توجه به شکل مشخص می­شود رویان بالغ در گیاه مورد مطالعه فاقد ذخایر لیپیدی می­باشد. در بررسی مقاطع طولی رنگ آمیزی شده با روش PAS، هیچ نوع انباشتگی از دانه­های نشاسته در بافت­های ساختاری جنین اعم از پروتودرم، پارانشیم و پروکامبیوم مشاهده نشد (شکل 4-F). یکی از ویژگی­های دانه موقعیت رویان در داخل آن است. مطالعه دانه های روشن سازی شده نشان داد که در این گیاه دانه از نوع قاشقکی بوده و رویان با اندازه 4 میلی متری،  حدود 3:4 دانه را اشغال می کند که از این جهت جزء دانه های غالب تقسیم بندی می شوند (شکل 4-G).

بحث و نتیجه گیری

با مشخص شدن ویژگی‌های دانه، بسیاری از جنس‌های گیاهی در خانواده‌ی جداگانه‌ای قرار گرفته­اند (22).

 

 

شکل 4- مرحله رویان لپه­ای و ذخایر آن. A: رویان لپه ای. B: مریستم راس ریشه. C: مریستم راس ساقه. D: اجسام پروتئینی در بافت­ رویان، رنگ آمیزی شده با روش کوماسی برلیانت بلو، فلش­ها اجسام پروتئینی را نشان می­دهند. E: فلش­ها اجسام پروتئینی را نشان می­دهند که دارای غشای لیپیدی می باشند. لایه کوتیکول سطح رویان را پوشانده است. F: بافت رویان رنگ آمیزی شده با روش PAS، دانه­های شفاف اجسام پروتئینی هستند که با معرف پلی ساکاریدها رنگ آمیزی نشده اند. G: موقعیت رویان در دانه شفاف شده قیچ و حجم اشغال شده توسط آن. Em: رویان، sa: مریستم راسی ساقه، pc: پروکامبیوم،  ra: مریستم ریشه، rc: کلاهک ریشه، c: لپه، hy: هیپوکوتیل،  cu: لایه کوتیکول.

 

همچنین روشن شدن این اطلاعات در مقایسه‌ی فیلوژنی گیاهان نیز مؤثر است (20). دانه قیچ با شکل بیضی- لوزی مانند و برآمدگی‌هایی که تزئینات پوسته دانه را ایجاد می‌کنند، شناخته می‌شود (17). شروع شکل‌گیری پوسته دانه به لقاح بستگی دارد، زیرا سیگنال‌هایی از محصول لقاح ارسال می شوند که برای تکوین پوسته دانه موردنیاز هستند(5). همچنین تکوین اندوسپرم نیز با تکوین پوسته دانه مرتبط است، به طوری که سیگنال‌های آغازه کننده­ی تکوین پوسته دانه توسط سلول‌های مرکزی لقاح یافته/ اندوسپرم ایجاد می‌شود (24). نقش تنظیم کنده­های رشد نیز در شکل‌گیری پوسته تخمک و درنهایت پوسته دانه مؤثر بوده و موجب رشد و گسترش سلول‌ها می‌گردند، علاوه بر این با تنظیم مولکولی منجر به کنترل سیگنال‌های تکوین پوسته‌ی دانه می‌شوند (12). مطالعات نشان داد که پوسته‌ی تخمک سیگنال‌هایی (ازجمله اکسین) را از اندوسپرم دریافت می‌کند که بر ضخیم شدن دیواره سلولی آن تأثیر می‌گذارند، احتمالاً ضخیم شدگی دیواره پوسته دانه قیچ با این امر قابل توجیه می‌باشد (3).

چگونگی نمو آندوسپرم هسته ای به طور گسترده ای در گیاهان مختلف بررسی شده است. در غلات نمو آندوسپرم هسته ای به 4 مرحله شامل مرحله سنوسیتی، مرحله سلولی شدن، مرحله تمایز یابی و بلوغ، و مرحله مرگ سلولی برنامه ریزی شده تقسیم می­شود. در آرابیدوپسیس نمو آندوسپرم به گونه دیگری است. کمی بعد از سلولی شدن، آندوسپرم از بین می­رود و تنها یک لایه آندوسپرم اطراف جنین بالغ باقی می­ماند (18).

بر اساس مطالعه حاضر نمو اندوسپرم در قیچ ابتدا از نوع هسته‌ای می‌باشد و سپس به نوع سلولی تبدیل می­گردد. در واقع در گیاه قیچ سلولی­شدن از بخش میکروپیلی و حاشیه­های کیسه رویانی شروع شده و به­تدریج پر شدن سلول­ها به طرف مرکز کیسه رویانی ادامه می­یابد.زمانی که سلول تخم در مرحله استراحت قرار گرفته است، سلول مادر اندوسپرم تقسیمات میتوزی سریعی را انجام  می­دهد و تعدادی هسته آزاد در سیتوپلاسم سلول مرکزی تولید می‌شود(11).

بررسی­های بافت­شناسی در رابطه با نمو آندوسپرم قیچ نیز نشان داد که اولین هسته­های آزاد در بخش مرکزی کیسه جنینی تشکیل می­گردد. پس از انتقال این هسته­ها به حاشیه کیسه جنینی، اولین دیواره­ها در بین هسته­های بخش میکروپیلی تشکیل می­شود. تشکیل اولین دیواره­ها در این گیاه قابل مقایسه با سلولی­شدن می­باشد. مطالعات نشان داده که آندوسپرم هسته­ای بعدها با تشکیل دیواره بین هسته­های آزاد سلولی می­گردد، که این امر حالت خاصی از تکوین آندوسپرم است و می­تواند به­عنوان نوعی سازش دو مرحله­ای و مناسب با توجه به نقش تغذیه­ای آن در جهت نمو رویان، محسوب گردد(16). در واقع زمانی که آندوسپرم در فاز هسته­ای می­باشد، مواد مغذی که از طریق بافت­های مادری کسب می­گردد، بدون گذر از دیواره­های سلولی به سرعت به داخل بافت آندوسپرم وارد می­شود و در اختیار رویان جوان و درحال رشد قرار می­گیرد. در مراحل بعد که رویان رشدیافته، تخریب فیزیکی و آنزیمی آندوسپرم به­وسیله رویان می­تواند اتفاق بیافتد و بنابراین در هنگام رشد رویان بین هسته­های آزاد دیواره تشکیل می­گردد و آندوسپرم به سلول­هایی انفرادی تبدیل می­شود تا از تجزیه و تخریب بی­رویه توسط رویان درامان بماند (11). وجود آندوسپرم هسته­ای یا حداقل ایجاد این مرحله قبل از سلولی­شدن آندوسپرم، در مواردی که سلولی شدن پس از تکمیل مراحلی از نمو رویان (که نیاز به مواد غذایی بسیار بالاست)، احتمالا به این دلیل است که انتقال مواد مغذی به رویان در این مراحل بسیار سریع می­باشد. بنابراین به­نظر می­رسد هسته­های آزاد آندوسپرم در این مراحل به­عنوان یک واسطه برای انتقال مواد غذایی به جنین عمل می­کنند (18).

دانه ها بر اساس وجود و یا عدم وجود آندوسپرم به دو دسته دانه های دارای آندوسپرم و دانه های فاقد آندوسپرم تقسیم می شوند(21). با توجه به نتایج مشخص شده که آندوسپرم در این گیاه از سلول­هایی با دیواره ضخیم تشکیل شده است. ضخیم شدگی دیواره موجب کاهش شدید فضای درون سلولی می شود. همچنین دانه از نوع اندوسپرم دار معرفی می­گردد و بافت اندوسپرم تا مراحل پایانی تکوین دانه باقی می­ماند.

مطالعات سیتوشیمیایی بافت اندوسپرم نشان داده که پروتئین ماده مهم ذخیره‌ای به شمار می­رود که در اندوسپرم یافت می‌شود (26و 24). از دیگر مواد ذخیره‌ای در اندوسپرم لیپیدها می‌باشند که غالب مواد ذخیره ای دانه‌های روغنی را به خود اختصاص داده‌اند (18). این اجسام به وسیله  نیم غشای فسفولیپدی احاطه شده اند. علاوه بر این ترکیبات که جزو مواد مهم ذخیره‌ای به شمار می‌روند، مواد معدنی و کاروتنوئیدها هم در اندوسپرم انباشته می شوند (11). این بافت همانند سوسپانسور رویان دارای زندگی کوتاهی است(21) و می­تواند تغیراتی را متحمل شده و نقش های متعددی از جمله تغذیه جنین درحال رشد، مشارکت فعال در جوانه زنی و تحمیل خفتگی بر رویان از طریق عوامل فیزیکی و شیمیایی ایفا کند (18). در واقع اجسام پروتئینی از متداولترین مواد ذخیره ای دانه ها محسوب می شود که هم در رویان و هم در آندوسپرم بسیاری از تیره های گیاهی مشاهده می شود. از نظر ساختاری اجسام پروتئینی از بخشی تحت عنوان ماتریکس پروتئینی و بخش دیگری به نام گلوبوئید و یا کریستالوئید تشکیل شده اند که بخش ماتریکس منبع ذخیره کننده نیتروژن برای گیاه محسوب شده و بخش گلوبوئیدی منبع ذخیره کننده عناصر می باشد. این اجسام بوسیله غشایی فسفولیپیدی احاطه شده اند و در برخی از گیاهان به وسیله دانه های لیپیدی محصور می شوند(21). با توجه به نتایج این تحقیق، در رویان بالغ سلول­های پارانشیمی دارای اجسام پروتئینی با تراکم بیشتر می باشند، در حالیکه در سلول­های پروتودرمی و پروکامبیومی اجسام پروتئینی با تعداد کمتر دیده می شوند. سلول­های مریستم انتهای ساقه نیز فاقد اجسام پروتئینی می­باشند. در حالیکه مشخص شد رویان در گیاه مورد مطالعه فاقد ذخایر لیپیدی می باشد.

در مورد دانه قیچ نیز این فرضیه که دانه­های نشاسته پیش ساز پلی­ساکارید­های دیواره هستند می­تواند صحیح باشد زیرا انطباق زمانی نزدیکی بین تخریب دانه­های نشاسته و تشکیل دیواره­های اولیه توسعه­یافته در سلول­های اپیدرم خارجی وجود دارد. فرضیه دیگری که مطرح می­شود جذب ترکیبات حاصل از هیدرولیز دانه­های نشاسته توسط جنین و اندوسپرم درحال‌ نمو می­باشد، زیرا متابولیسم مواد قندی یکی از مکانیسم­های کنترل نمو جنین می­باشد. نقش این ذخایر پلی­ساکاریدی به عنوان تأمین‌کننده مواد غذایی جنین در حال نمو پیشنهاد شده است (23). در این گیاه با توجه به ویژگی­های نموی جنین و اندوسپرم به نظر می­رسد دانه­های نشاسته پوسته نقشی در کنترل نمو جنین ایفا نمی­کنند.

در بافت اندوسپرم مواد ذخیره­ای به شیوه­های مختلفی به‌عنوان‌ مثال از بخش حاشیه­ای به سمت مرکز ( مانندگیاه Z. fabago) و از قسمت میکروپیل به سمت شالاز شروع به انباشته شدن می­کند. در گندم سنتز نشاسته ابتدا در سلول­های بخش مرکزی اتفاق می­افتد و درنهایت نیز تجمع نشاسته در این سلول­ها نسبت به سلول­های حاشیه­ای بیشتر است (27). در اندوسپرم قیچ ازآنجایی‌که در طول نمو جنین، کاهش دانه­های نشاسته دیده نمی­شود، به نظر می­رسد در گیاه قیچ دانه­های نشاسته در تغذیه جنین نقش کمتری دارند. از طرف دیگر با کاهش تدریجی آنها هم‌زمان با ضخیم شدن دیواره­های نازک سلول­های اندوسپرم، به­ نظر می­رسد که این دانه­ها درجهت ضخیم­شدن دیواره­ها به مصرف می­رسند. دیواره­های ضخیم اندوسپرم، حتی پس از بلوغ نیز باقی می­مانند، بنابراین به نظر می­رسد این دیواره­ها پس از جوانه زنی دانه هیدرولیز شده و به مصرف دانه­رست جوان می­رسند، نتایج فوق با Figueiredo and Kohler (2016) مطابقت دارد.

به طور کلی مطالعه دانه­ی قیچ مشخص کرده است که تخمک از نوع واژگون و دو پوسته‌ای است. مقایسه تکوین اندوسپرم با تکوین رویان قیچ نشان داد که مراحل اولیه نمو بافت­های همراه رویان، بسیار سریع­تر اتفاق می­افتد و رشد رویان به سرعت کامل می­شود. درحالی‌که نمو اندوسپرم از مرحله گل­های گرده­افشانی شده آغاز می­شود اما به کندی ادامه می­یابد. آندوسپرم سلولی شده در این گیاه به­تدریج در کیسه جنینی توسعه پیدا می­کند و کل فضای کیسه جنینی را اشغال می­نماید. درواقع دانه از نوع اندوسپرم دار بوده و بافت اندوسپرم تا مرحله رویان بالغ باقی مانده و تحلیل نمی­رود. درواقع از مرحله رویان کروی که اندوسپرم شروع به سلولی شدن می­کند، تا پایان رشد لپه­ها و بلوغ جنین، تنها رویداد مهمی که در اندوسپرم اتفاق می­افتد، تشکیل دانه­های نشاسته و تا حدودی افزایش حجم این دانه­ها می­باشد که به نظر می­رسد توسط جنین درحال رشد مصرف می­گردند. درعین‌حال در سلول­های اپیدرم خارجی نیز تنها افزایش حجم این سلول­ها و تحلیل رفتن دانه­های نشاسته در این سلول­ها اتفاق می­افتد. در پایان رشد رویان، که درواقع اساسی­ترین مراحل تکوین بافت­های همراه رویان می­باشد، رویان متحمل تغییر چشمگیری نمی­گردد. در این مراحل در سلول­های اندوسپرم، ضخیم شدگی دیواره­ها و ذخیره شدن مواد لیپیدی و پروتئینی اتفاق می­افتد. در رویان بالغ گیاه قیچ تمام بخش­ها شامل مریستم انتهای ریشه، هیپوکوتیل، مریستم انتهای ساقه و لپه­ها قابل تشخیص می باشد. رویان بالغ در این گیاه دارای هیپوکوتیل نسبتاً طویل بوده و لپه‌ها اندازه بزرگی دارند. همچنین بررسی سیتوشیمی رویان بالغ نشان داد که تمامی سلول­ها مملو از دانه­های نشاسته می­باشند، سلول­های پارانشیمی دارای اجسام پروتئینی با تراکم بیشترند در حالیکه در سلول­های پروتودرمی و پروکامبیومی اجسام پروتئینی با تعداد کمتر دیده می شوند. بر خلاف اندوسپرم، در بافت رویان بالغ مواد کربوهیدراتی تشخیص داده نشد.

در انتها بررسی تزئینات سطحی و تغییرات مورفولوژیکی

سلول­های اپیدرم خارجی پوسته دانه با جریان مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلولی در مراحل مختلف نموی به ‌وسیله میکروسکوپ الکترونی گذاره جهت تکمیل مطالعات تکوینی و روشن شدن ویژگی­های سیتولوژیکی پیشنهاد می­شود.

سپاسگزاری

از همکاری صمیمانه مسئولان آزمایشگاه سلولی تکوین گیاهی دانشکده علوم طبیعی دانشگاه تبریز تشکر و سپاسگزاری می­شود.

1.   Behnke, H.D., Hummel, E., Hillmer, S., Sauer-Gurth, H., Gonzalez, J., Wink, M. 2013. A revision of African Velloziaceae based on leaf anatomy characters and rbcL nucleotide sequences. Botanical Journal of the Linnean Society 172, 22–94.

2.   Bellstedt, D.U., Van-Zyl, L., Marais, E.M., Bytebier, B., De-Villiers, C.A., Makwarela, A.M., Dreyer, L.L. 2008. Phylogenetic relationships, character evolution and biogeography of southern African members of Zygophyllum (Zygophyllaceae) based on three plastid regions. Molecular Phylogenetics and Evolution 47, 932-949.

3.   Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. 2015. A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat. Nature Communications 6, 63-82.

4.   Erdemoglum N, Kusmenoglu S. 2003. Fatty Acid composition of Zygphyllum fabago seeds. Chemistry of Natural compounds 39, 595-596.

5.   Figueiredo, DD., Batista, RA., Roszak, P.J., Kohler, C. 2015. Auxin production couples endosperm development to fertilization. Nature Plants 1, 15184.

6.   Figueiredo, DD., Kohler, C. 2016. Bridging the generation gap: communication between maternal sporophyte, female gametophyte and fertilization products. Current Opinion in Plant Biology 29, 16–20.

7.   Gahan, P.B. 1984. Plant histochemisry and cytochemistry Plant Histochemistry and Cytochemistry: An Introduction. Academic Press, London.

8.   Galek, R., Kozak, B., Biela, A., Zalewskid, D., Sawickasienkiewize, E., Spychala, K., Stawinski, S. 2016. Seed Coat Thickness Differentiation and Geneticpolymorphism for Lupinus mutabilis Sweet breeding. Turkish Journal of Field Crops 21, 305-312.

9.   Ghazanfar, Sh., Osborne, J. 2015. Typification of Zygophyllum propinquum Decne. and Z. coccineum. (Zygophyllaceae) and a key to Tetraena in SW Asia. Kew bulletin 70, 1-9.

10. Jensen, W.A. 1962. Botanical histochemistry. Freeman, W.H. and Company.

11. Lersten, N. R. 2004. Flowering Plant embryology. Blackwell publishing, New Jersey.

12. Liao, CY., Smet, W., Brunoud, G., Yoshida, S., Vernoux, T., Weijers, D. 2015. Reporters for sensitive and quantitative measurement of auxin response. Nature Methods 12, 207–210.

13. Patil, P., Malik, S.K., Sutar, S.,Yadav, S.R., John, J., Bhat, K.V. 2015. Taxonomic Importance of Seed Macro- and Micro-Morphology in Abelmoschus (Malvaceae). Nordic Journal Botany 33, 696–707.

14. Queiroz, R.T., De, A.M., Tozzi, G.A., Lewis, G. P. 2013. Seed morphology: An addition to the taxonomy of Tephrosia (Leguminosae Papilionoideae, Millettieae) from South America. Plant Systematics and Evolution 299,459 – 470.

15. Schenk, J.J., Hodgson, W., Hufford, L. 2013. Mentzelia canyonensis sp. nov.: a new species endemic to the Grand Canyon, Arizona, U.S.A. Brittonia 65, 408–416.

16. Schenk, J.J., Sullivan, M., Washburn, G., Franta, R., Chambers, M. 2016. Allometric Relationships Better Explain Seed Coat Microsculpture Traits In Mentzella Section Bartonia (loasaceae) Than Ecology Or Dispersal. International journal of plant science 177, 263–276.

17. Semerdjieva, IB., Yankova-Tsvetkova, E. 2017. Pollen and seed morphology of Zygophylum fabago and Peganum harmala (Zygophyllaceae) from Bulgaria. Phyton 86, 318-324.

18. Sousa-Baena, M., De Meneze, N. 2014. Seed Coat Development In Velloziaceae: Primary Homology assessment and Insight On Seed Coat evolution. American Journal of Botany 101 (9): 1409 – 1422.

19. Szkudlarz, P., Celka, z. 2016. Morphological Characters Of The Seed Coat In Selected Species Of The Genus Hypericum L. And Their Taxonomic Value. Biodiversity Research and Conservation 44, 1-9.

20. Takahashi, Y., Somta, P.,  Muto, C., Iseki, K., Naito, K., Pandiyan, M., Natesan, S., Tomooka N. 2016. Novel Genetic Resources in the Genus Vigna Unveiled from Gene Bank Accessions. PLoS ONE 11, e0147568.

21. Terziyski, D. 1981. SEM microscopy-problems, application, prospects for development in the biological sciences in the country. Scientific Works Agricultural Institute, Plovdiv 26, 115-121.

22. Umdale, S.D., Aitawade, M.M., Gaikwad, N.B., Madhavan, L., Yadav, S.R., Rao, S.R., Bhat, K.V. 2017. Pollen Morphology of Asian Vigna Species (Genus Vigna; Subgenus Ceratotropis) from India and Its Taxonomic Implications. Turkish Journal of Botany 41, 75–81.

23. Voiniciuc, c., Yang, B., Heinrich-Wilhelm Schmidt, M., Günl, M., Usadel, B. 2015. Starting to Gel: How Arabidopsis Seed Coat Epidermal Cells Produce Specialized Secondary Cell Walls. International Journal of Molecular Sciences16, 3452-3473.

24. Weijers, D., Wagner, D. 2016. Transcriptional responses to the auxin hormone. Annual Review of Plant Biology 67, 539–574.

25. Windsor, J.B., Symonds, V.V., Mendenhall, J., Lyoid, A.L. 2000. Arabidopsis seed coat development: morphological differentiation of the outer integument. The plant journal 22, 483-493.

26. Wu, Sh., Lin, L., Li, H., Yu, Sh., Zhang, L., Wang, W. 2015. Evolution of Asian Interior Arid-Zone Biota: Evidence from the Diversification of Asian Zygophyllum (Zygophyllaceae). PLoS ONE 10, 1-17.

27. Xu, X.Y., Fan, R., Zheng, R., Li, C.M., Yu, D.Y. 2011. Proteomic analysis of seed germination under salt stress in soybeans. Journal of Zhejiang University Science 12, 507–517.

28. Zeng, C.L., Wu, X.M., Wang, J.B. 2006. Seed Coat Development And Its Evolutionary Implication in Diploid And Amphidiploid Brassica Species. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 48, 15-22.

29. Zhang, F., Fu, P.Ch., Gao, C.B., Chen, Sh.L. 2013. Comparative study on plant seed morphological characteristics of Zygophyl Zygophyllaceae and two new families separated from it. Plant Diversity and Resources 35, 280-284.