نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد علوم گیاهی

2 دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری گروه علوم پایه

3 دانشگاه ازاد اسلامی واحد تنکابن- گروه زیست شناسی

چکیده

مقدمه: شوری یکی از مهمترین تنش‌های غیر زنده ای است که با تولیدگونه‌های فعال اکسیژن(ROS) بر روی تولید و کیفیت محصول گیاهان تاثیر می گذارد. گیاهان از سیستم‌های آنتی اکسیدانی چون آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز برای مقابله با انواع مختلف این رادیکال‌ها استفاده می‌کنند. همچنین تنش‌ شوری، میزان کلروفیل را تحت تاثیر قرار می‌دهد و باعث به هم زدن هموستازی یونهای سدیم، پتاسیم، کلر و کلسیم می شود.
هدف: به همین منظور این پارامتر‌ها در گیاه اسفناج در مقاومت به تنش شوری مورد بررسی قرار گرفتند.
روش: در این مطالعه، تنش شوری در چهار سطح 0، 200، 400 و600 میلی مولار کلرید سدیم در بازه زمانی 14 روز بعد از اعمال تنش و به فاصله متناوب 72 ساعت در آزمایشی در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی به صورت فاکتوریل در نظر گرفته شد. فعالیت آنزیم‌های آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز مطابق روش استاندارد اندازه‌گیری شد. همچنین میزان یون‌های سدیم، پتاسیم و محتوای کلروفیل و کاروتنوئید اندازه‌گیری شدند. داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار آماری SAS و MSTATC مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
نتیجه: نتایج حاکی از آن بود که اثر تنش شوری بر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز معنی دار بودند. نتایج نشان داد که با افزایش سطوح شوری میزان یون سدیم و یون پتاسیم در برگ نسبت به شاهد به ترتیب افزایش و کاهش معنی داری داشته است. غلظت رنگدانه‌های کلروفیل و کارتنوئید با افزایش سطح شوری کاهش یافت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The Study of Activity of Antioxidant Enzymes, Guaiacol Peroxidase and Ascorbate Peroxidase and the amount of Na, K and pigment content in Spinach oleracea L under NaCl Salinity Stress

چکیده [English]

Salinity is one of the most important abiotic stresses which with produce a reactive oxygen species affect on production and quality of herbal products. Plants are using antioxidant systems such as ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase to deal with different types of free radicals.Also, salinity stress, affect on chlorophyll content and causes ions to disrupt the homeostasis of sodium, potassium, chloride, and calcium. For this purpose, these parameters in spinach in resistance to salt stress were studied. In this study, Salinity at four levels( 0,200,400 and 600 Mm) in a period of 14 days after the stress and intermittent interval (72 hours)in a factorial and completely randomized experiments with the model of base design were considered. Ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase activities were measured using standard method. Also, Ions of sodium, potassium and chlorophyll and carotenoid content in the treatment of salinity stress were measured. Data obtained from this study using the statistical software SAS and MSTATC were analyzed.
Our results indicated that the effect of salinity stress on the activity of anti-antioxidant enzymes, ascorbate peroxidase, and guaiacol peroxidase was significant. The results showed that with increasing salinity level, the sodium and potassium ions in leaf compare to control has been significantly increased and reduced, respectively. The concentration of chlorophyll and carotenoid pigments decreased with increasing salinity level.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "Oxygen radicals"
  • "peroxidase enzymes"
  • "Spinach"
  • " Stress"

بررسی فعالیت آنزیم­های گایاکول پراکسیداز و آسکوربات پراکسیداز و میزان سدیم، پتاسیم و محتوای رنگدانه در گیاه هالوفیت اسفناج (Spinacia oleracea L.) نسبت به تنش کلریدسدیم

زهرا محسنی تنکابنی1، فاطمه مرادیان2* وپروانه راهداری1

1 ایران، تنکابن، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تنکابن، گروه زیست شناسی

2 ایران، ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، گروه علوم پایه

تاریخ دریافت: 16/9/95                تاریخ پذیرش: 15/8/97

چکیده

شوری یکی از مهمترین تنش­های غیر زنده ای است که با تولیدگونه­های فعال اکسیژن(ROS) بر روی تولید و کیفیت محصول گیاهان تاثیر می گذارد.  گیاهان از سیستم­های آنتی اکسیدانی چون آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز برای مقابله با انواع مختلف این رادیکال­ها استفاده می­کنند. همچنین تنش­ شوری، میزان کلروفیل را تحت تاثیر قرار می­دهد و باعث به هم زدن هموستازی یونهای سدیم، پتاسیم، کلر و کلسیم می شود. هدف: به همین منظور این پارامتر­ها در گیاه اسفناج در مقاومت به تنش شوری مورد بررسی قرار گرفتند. در این مطالعه، تنش شوری در چهار سطح 0، 200، 400 و600 میلی مولار کلرید سدیم در بازه زمانی 14 روز بعد از اعمال تنش و به فاصله متناوب 72 ساعت در آزمایشی در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی به صورت فاکتوریل در نظر گرفته شد. فعالیت آنزیم­های آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز مطابق روش استاندارد اندازه­گیری شد. همچنین میزان یون­های سدیم،  پتاسیم و محتوای کلروفیل و کاروتنوئید اندازه­گیری شدند. داده­ها با استفاده از نرم­افزار آماری SAS و MSTATC مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج حاکی از آن بود که اثر تنش شوری بر فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز معنی دار بودند. نتایج نشان داد که با افزایش سطوح شوری میزان یون سدیم و یون پتاسیم در برگ نسبت به شاهد به ترتیب افزایش و کاهش معنی داری داشته است. غلظت رنگدانه­های کلروفیل و کارتنوئید با افزایش سطح شوری کاهش یافت.

واژه های کلیدی: اسفناج،  پراکسیداز، تنش شوری، انواع  اکسیژن فعال

* نویسنده مسئول، تلفن: 33687655-011، پست الکترونیکی:  f.moradian@sanru.ac.ir

مقدمه

 

تنش­های محیطی غیر زیستی از جمله خشکی و شوری از تنش­های شاخص گیاهی هستند که تاثیر مهمی در تکامل و تکثیر گیاهان دارند بنابراین به طور جدی سبب از بین رفتن محصولات کشاورزی می­شوند (1). در میان موارد ذکر شده، شوری مهمترین تهدید کننده کشاورزی در جهان به شمار می­رود (32). در هنگام تنش­های محیطی یک­سری تغییرات شیمیایی و بیوشیمیایی در گیاه صورت می­گیرد که از آن جمله می‌توان به شکسته شدن زنجیرۀ انتقال الکترون و تولید اکسیژن فعال همانند O2، H2O2   و OHاشاره کرد (16). فعالیت گونه­های فعال اکسیژن (ROS=Reactive oxygen species) ممکن است سبب بروز صدماتی همچون اکسید شدن لیپیدهاکه منجر به تغییر ساختار غشاء شده و در نتیجه یکپارچگی غشاء از بین می­رود، تغییر ساختمان پروتئین­ها و اکسید شدن گروه­های سولفیدریل (SH)، غیرفعال شدن آنزیم­ها، بی­رنگ شدن و یا از بین رفتن رنگدانه­هایی مانند کلروفیل و سایر ترکیبات رنگیزه­ای و هم چنین حمله مداوم به مولکول­های آلی مثل DNA و در نتیجه اختلال در رشته های DNA گردد(19,21,28).

همچنین واکنش رادیکال­های آزاد و نیمه آزاد اکسیژن می­توانند در پیری مؤثر باشد (3). مکانیسم­های دفع سمیت انواع اکسیژن فعال که بیشتر در کلروپلاست، میتوکندری و میکروبادی­ها به­وجود می­آیند، توسط آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی از جمله سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، آسکوربات­پراکسیداز (APX)، گایاکول ­پراکسیداز (GPX)، گلوتاتیون ­ردوکتاز (GR)، دهیدروآسکوربات ­ردوکتاز (DHAR) و گلوتاتیون S-­ترانسفراز انجام می­گیرد(4,5).

 در هنگام تنش، آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مثل آسکوربات­ پراکسیداز، دهیدروآسکوربات رودکتاز، گلوتاتیون­ رودکتاز و سوپراکسید­دیسموتاز در برگ افزایش می­یابند. البته میزان ساخته شدن این مواد به شدت و مدت تنش بستگی دارد. همچنین گونه و مرحلة رشد و نمو گیاه نیز در میزان تنش و در نهایت ساخته شدن این مواد مؤثرند (8). آنزیم گایاکول پراکسیداز در سیتوسول فعالیت داشته و از گلوتاتیون به عنوان کوفاکتور خود استفاده می‌کند (11). این آنزیم پراکسید هیدروژن را تجزیه و به آب تبدیل می‌کند. افزایش فعالیت این آنزیم به همراه سایر مکانیسم‌های دفاعی در سیتوسول به حفظ پایداری در این بخش کمک شایانی می‌نماید (2). آسکوربات پراکسیداز نقش حیاتی در مکانیسم‌های دفاعی گیاه در مقابل تنش‌اکسیداتیو دارد. این آنزیم، پر­اکسید هیدروژن را در کلروپلاست، سیتوسول، میتوکندری و پراکسی­زوم سلول‌های گیاهی از بین می­برد(4,29). علاوه بر ایجاد گونه­های فعال اکسیژن، تنش شوری باعث بر هم خوردن تعادل یونی می­شود. وجود مقدار زیادی NaCl، شایع ترین نوع تنش شوری می­باشد که باعث به هم زدن هموستازی  Na و Cl و همچنین  Kو Ca می شود. سلول­های گیاهی برای حفظ واکنش­­های کتابولیکی نرمال خود به حفظ یون پتاسیم احتیاج دارند. همچنین تجمع یون سدیم در سیتوپلاسم سلول گیاه سمی است. یکی از مکانیسم­های اجتناب از اثرات مضر تنش شوری دفع و کاهش یون سدیم از سیتوپلاسم سلول می­باشد. از جمله تنش اکسیداتیو باعث کاهش میزان کلروفیل و سایر رنگدانه­ها می شود. این کاهش باعث محدودیت فتوسنتز و رشد گیاه می­گردد.

اسفناج (Spinacia Oleracea L.) که 2n=12 است یک سبزی برگی مهم است که برگ­ها و ساقه ظریف آن به صورت تازه و یا فرآوری شده مصرف می­شود. اسفناج به تیره اسفناجیان (Chenopodiaceae) تعلق دارد که برای تولید برگ یکساله و برای تولید دانه دو ساله است. گیاهان این جنس می توانند شوری (NaCl) را تا سطح M m500 تحمل کند و به­عنوان دهنده ژن­های متحمل به تنش شوری در برنامه­های اصلاح سبزیجات مورد استفاده قرار گیرد(1).

یکی از مهم­ترین جنبه­های مطالعاتی برای مقاوم­سازی گیاهان نسبت به تنش شوری مطالعه و شناسایی فرآیند­های فیزیولوژیکی متأثر از تنش شوری می­باشد. به این ترتیب بررسی فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان که در خنثی­سازی انواع رادیکال­های آزاد اکسیژن درگیر می­باشند، از اولویت­های مهم تحقیقاتی محسوب می­شود. در اکثر مطالعات ارتباط مستقیمی میان فعالیت این آنزیم­ها و مقاومت گیاهان نسبت به تنش­های محیطی و بویژه تنش شوری مشاهده شده است. تاکنون مطالعه­ای پیرامون واکنش آنتی­اکسیدانی اسفناج نسبت به تنش شوری ارائه نگردیده است. به همین منظور فعالیت دو آنزیم آنتی­اکسیدانی و میزان یون­های سدیم و پتاسیم و محتوای کلروفیل و کارتنوئید درگیاه اسفناج در مقاومت به تنش شوری مورد مطالعه قرار گرفت.

مواد و روشها

آماده سازی خاک و کاشت گیاه: بذر اسفناج از بانک بذر مؤسسه تحقیقات کشاورزی ساری تهیه گردید. بذر اسفناج پس از آن که چندین بار با آب مقطر شستشو داده شد به­مدت2 ساعت برای انجام عمل خیساندن درون آب مقطر قرار داده شد. در ابتدا خاک پیت موس از گلخانه تهیه گردید و توسط دستگاه اتوکلاو استریل شد. پس از استریل خاک بذر­های اسفناج در دمای 25 درجه سانتی­گراد و در دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در گلدان کاشته شدند. سپس 45 روز پس از کاشت (مرحله چهار برگی) به محیط کشت هوگلند انتقال داده شدند. چهارده روز بعد از انتقال به محیط کشت هوگلند، تنش شوری به صورت پاساژ دهی اعمال گردید، یعنی روزانه 100 mM از نمک NaCl به محیط رشد گیاهان اضافه شد. مطالعات آنزیمی بر روی گیاهان تحت تنش 0 mM،
200 mM، 400 mM و 600 mM NaCl و در قالب طرح بلوک کامل تصادفی با 3 تکرار انجام شد.

استخراج آنزیمی: جهت استخراج گایاکول پراکسیداز، 5/0 گرم از نمونه برگی با استفاده از هاون چینی کاملاً سرد و نیتروژن مایع هموژن شده و سپس به آن 5 میلی­لیتر از بافر فسفات سردpH=7.5) ) محتوی EDTA 5/0 میلی­مولار اضافه گشت. هموژن­ها پس از انتقال به لوله‌های آزمایش درg × 15000 دور در دقیقه و دمای 4 درجه سانتی­گراد به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ (Sigma 3-30K، امریکا) گردید. جهت پیشگیری از اثرات مضر انجماد و ذوب متوالی نمونه‌ها روشناور حاصل، به سه قسمت تقسیم و تا زمان اندازه‌گیری آنزیم‌های فوق در دمای 20–  درجه سانتی­گراد نگهداری شد. جهت استخراج آنزیم آسکوربات پراکسیداز همانند استخراج گایاکول پراکسیداز عمل گردید. با این تفاوت که این آنزیم  دوام کمی در محیط خارج از سلول دارد. به­طوری­که برخی از ایزوزیم­های آن، نیمه­عمر کمتر از 2 دقیقه در محیط‌هایی با غلظت پائین آسکوربات دارند. به همین دلیل جهت حفظ ساختار و پایداری آن به محلول استخراج آنزیمی پلی­وینیل­پیرولیدین (5 درصد) و آسکوربات2 میلی­مولار اضافه گشته و در سایر موارد استخراج آنزیم آسکوربات پراکسیداز مشابه آنزیم­های فوق می‌باشد (29).

تعیین فعالیت آسکوربات پراکسیداز: کمپلکس واکنشی (یک میلی‌لیتر) شامل 250 میکرولیتر از محلول بافر فسفات 100 میلی­مولار (7= pH)، 250 میکرولیتر از آسکوربات یک میلی­مولار، 250 میکرولیتر از EDTA 4/0 میلی­مولار، 190 میکرولیتر آب دو بار تقطیر، 10 میکرولیتر از پراکسید هیدروژن 10 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر از محلول آنزیمی استخراج شده ‌بود. جذب  واکنش آنزیمی در طول موج 290 نانومتر در زمان شروع و پس از یک دقیقه از شروع واکنش قرائت گشت. واحد فعالیت آنزیم بر حسب میکرومول آسکوربات  اکسیدشده بر دقیقه
 ) min/ (unit = OD290محاسبه شد (36).

تعیین فعالیت گایاکول پراکسیداز: کمپلکس واکنشی(دو میلی لیتر) شامل یک میلی­لیتر بافر فسفات 100 میلی­مولار (7pH=)،250 میکرولیتر از  EDTA 1/0 میلی­مولار، یک میلی­لیتر گایاکول 5 میلی­مولار، یک میلی­لیتر پراکسید هیدروژن 15 میلی‌مولار و50 میکرولیتر از محلول آنزیمی استخراج شده ‌بود. میزان جذب واکنش آنزیمی در طول موج 470 نانومتر در زمان شروع واکنش و یک دقیقه پس از آن قرائت شد. واحد فعالیت آنزیمی براساس میزان تتراگایاکول تشکیل شده پس از زمان یک دقیقه
) min/   (unit= OD470محاسبه شد (31).

اندازه­گیری میزان یون­های سدیم و پتاسیم برگ­ها: به منظور سنجش عناصر سدیم و پتاسیم 2 گرم نمونه گیاه خشک شده توزین و در بوته چینی ریخته و در کوره تا 550 درجه سانتی گراد به مدت 4 ساعت حرارت داده شد. خاکستر حاصل را با آب مقطر کمی خیس کرده و  10 میلی­لیتر اسید هیدروکلریک 2 مولار اضافه و سپس محلول صاف شد. عصاره نهایی به حجم 100 میلی­لیتر رسانده شد. در پایان اندازه­گیری سدیم و پتاسیم به روش نشر شعله­ای(فلیم فوتومتر) انجام شد. محلول حاصل از عصاره گیری  را به نسبت 1+9 با کلرور سزیم رقیق کرده و جذب با دستگاه فلیم فوتومتر (شروود 410، انگلستان) و در طول موج 5/766 نانومتر برای پتاسیم و 589 نانومتر برای سدیم خوانده شد(34).

اندازه­گیری میزان کلروفیل برگ: 14روز پس از اعمال تنش­ شوری از برگ اول هر بوته نمونه برگی تهیه و در فویل‏های آلومینیومی قرار گرفتند و بلافاصله در نیتروژن مایع غوطه­ور شده و تا زمان اندازه­گیری کلروفیل در دمای 20 درجه زیر صفر نگهداری شدند. هنگام اندازه­گیری از هر نمونه برگی 6 دیسک به قطر 5 میلی­متر برداشته و در 8 میلی­لیتر متانول غوطه­ور شده در تاریکی و دمای اتاق به مدت 24 ساعت قرار گرفتند. لازم به ذکر است که به دلیل حساسیت کلروفیل به نور و تجزیه آن در شدت‌های نور بالا، در تمامی مراحل استخراج و اندازه‌گیری نمونه‌ها در شدت‌های ضعیف نور نگهداری شدند. سپس محتوی کلروفیل a، b و کاروتنوئید در طول موج­های 470، و 4/652 و 2/665  نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر مدل (Spekol 1300, Japan)، قرائت گردید. برای محاسبه میزان کلروفیل و کاروتنوئید از فرمول­های: Chl a (µg/ml)= 16.72A665.2 – 9.16A652.4، Chl b (µg/ml)= 36.92A652.4–15.28A665.2 و C(x+c)(µg/ml) = (1000A470–1.63Chla – 104.96Chl b)/221 استفاده شد. Chla  برای کلروفیل آ ، Chl b برای کلروفیل بی، C(x+c)برای کارتنوئید تام و  A دانسیته نوری می­باشد (22).

تجزیه و تحلیل آماری: داده­های به­دست آمده از این پژوهش با استفاده از نرم­افزار آماری SASوMSTATC مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و میانگین­ها با استفاده از آزمون LSD در سطح احتمال 1 درصد مورد مقایسه قرار گرفتند. برای رسم نمودارها و جداول از نرم­افزار Excel استفاده شد. آزمون نرمال بودن داده­ها با استفاده از نرم­افزار SPSS انجام گرفت.

نتایج

با توجه به مقایسه میانگین داده­ها با افزایش تنش شوری از میزان صفات مورفولوژیک کاسته شد. حداکثر وزن تر برگ در سطح 200 mM مشاهده شد و با افزایش سطح تنش از میزان وزن تر برگ کاسته شد. حداکثر وزن تر ریشه در سطح 400mM مشاهده شد و حداقل وزن تر ریشه  در سطح 600 mM  مشاهده شد. حداکثر وزن خشک برگ در سطح 200mM مشاهده شد و کمترین میزان آن نیز در سطح 400mM مشاهده گردید. بیشترین وزن خشک ریشه به سطح 200mM تعلق داشت و کمترین وزن خشک ریشه به سطح600mM  تعلق داشت(جدول1).

جدول1- مقایسه میانگین صفات مرفولوژیکی درگیاه هالوفیت اسفناج تحت تأثیر تیمار شوری

 

در این آزمایش فعالیت دو آنزیم آسکوربات پراکسیدازو گایاکول پراکسیداز در چهار سطح صفر، دویست،‌ چهارصد و ششصد میلی مولار NaCl، طی 21 روز اندازه گیری شد. فعالیت این آنزیم­ها تقریباً در تمامی سطوح شوری افزایش یافت. نتایج حاصل نشان دادند که با افزایش سطوح تنش شوری میزان آنزیم­های آسکوربات پراکسیداز(شکل1) و گایاکول پراکسیداز(شکل2) افزایش می­یابد و تا سطح اول تنش افزایش یافته سپس روند کاهشی نشان می دهد.

در اندازه­گیری یون سدیم٬ با افزایش سطح شوری بر میزان یون سدیم در برگ افزوده شد. بیشترین میزان یون سدیم در سطح 600 میلی مولار مشاهده شده است(شکل3).

 

شکل1- فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز تحت تنش شوری در اسفناج. تنش شوری از صفر تا 600 میلی مولار کلرید سدیم. واحد فعالیت آنزیم=  جذب میکرومول آسکوربات اکسیدشده بر دقیقه. حروف متفاوت، تفاوت معنی­دار را نشان می­دهند(p<0.05).

 

شکل2- فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز تحت تنش شوری دراسفناج. تنش شوری از صفر تا 600 میلی مولار کلرید سدیم. واحد فعالیت آنزیم= جذب میکرومول تتراگایاکول تشکیل شده بر دقیقه. حروف متفاوت، تفاوت معنی­دار را نشان می­دهند(p<0.05).

 

شکل3- میزان یون سدیم در تنش شوری در اسفناج. تنش شوری از 0 میلی مولار تا 600 میلی مولار کلرید سدیم. حروف متفاوت، تفاوت معنی­دار را نشان می­دهند(p<0.05).

با افزایش سطوح شوری از میزان یون پتاسیم جذب شده در برگ کاسته شد. بیشترین میزان یون پتاسیم جذب شده در برگ در سطح 200 میلی مولار مشاهده گردید و کمترین میزان در سطح 600 میلی مولار مشاهده شده است (شکل4). نتایج نشان داد که با افزایش سطوح شوری میزان یون سدیم در برگ افزایش و مقدار یون پتاسیم برگ کاهش معنی داری داشته است.

 

شکل 4- میزان یون پتاسیم در تنش شوری دراسفناج. تنش شوری از 0 میلی مولار تا 600 میلی مولار کلرید سدیم. حروف متفاوت، تفاوت معنی­دار را نشان می­دهند(p<0.05).

 

در اندازه گیری میزان کلروفیل، غلظت کلروفیل a با افزایش سطوح شوری کاهش یافت. در سطح 200 میلی­مولار نسبت به سایر سطوح معنی­دارتر بود. کمترین غلظت آن در سطح 600 میلی­مولار مشاهده شد. غلظت کلروفیل b با افزایش سطوح شوری کاهش یافت. کمترین غلظت کلروفیل b نیز در تیمار 600 میلی­مولار بدست آمد. غلظت کاروتنوئید با توجه به مقایسه میانگین داده­ها، در سطوح مختلف شوری نسبت به سطح عدم تنش (صفر میلی­مولار) کاهش یافته به­طوری­که بیشترین غلظت آن در سطح صفر میلی­مولار مشاهده شده است. همچنین بین سطوح اختلاف چشمگیری وجود نداشت. کمترین غلظت کاروتنوئید در سطح 600 میلی­مولار مشاهده شد(جدول2).

 

جدول 2- مقایسه میانگین پارامترهای رنگدانه­ای درگیاه هالوفیت اسفناج تحت تأثیر تیمار شوری

 

بحث و نتیجه گیری

نتایج نشان داد که با افزایش سطوح تنش شوری میزان آنزیم­های آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز افزایش یافته و در 600 میلی مولار کاهش می­­یابد. تحقیقات مختلف نشان داده است که یک ارتباط قوی بین تحمل به تنش­های اکسیداتیو که به دلیل تنش­های محیطی ایجاد می شود و افزایش در غلظت آنزیم­های آنتی­اکسیدان در گیاهان فتوسنتز کننده وجود دارد (29). افزایش فعالیت آنزیم پراکسیداز تحت تنش شوری در چغندرقند توسط بور و همکاران (7) و برنج توسط دیونیسیوسس (10) و دمیرال و همکاران (9) نیز گزارش شده است. حیدری و مصری (17) گزارش کردند که در ارقام مختلف گندم تحت تنش شوری بر میزان فعالیت هر دو آنزیم آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز افزوده می­شود. در بررسی 5 رقم کلزا تحت تنش شوری کلرید سدیم تا سطح 300 میلی­مولار تنش، میزان فعالیت آسکوربات پراکسیداز در اندام هوایی و ریشه افزایش یافته ولی میزان فعالیت گایاکول پراکسیداز کاهش یافت(18).ترابی و همکاران گزارش کردند که در گیاه زعفران اثر تنش شوری در پایین تر از 300 میلی مولار باعث افزایش فعالیت آسکوربات پراکسیداز می­شود اما در 300 میلی مولار فعالیت آنزیم کاهش می­باید که این کاهش نشانه حساسیت گیاه نسبت به غلظت بالای شوری می­باشد(33). مرآتی و همکاران اثر تنش شوری از 25 تا 75 میلی مولار را در گیاه پونه معطر بررسی کردند و نشان دادند که فعالیت آسکوربات پراکسیداز همراه با افزایش غلظ شوری افزایش می­یابد. آنها توضیح دادند که افزایش فعالیت این آنزیم می­تواند نقش کلیدی در حذف H2O2تولید شده هنگام تنش شوری بازی کند  ومنجر بهتحمل بیشتر گیاه در تنش شوری شود (23).

پراکسیداز یک اکسید­و­ردوکتاز می­باشد که در پراکسی­زوم­ها قرار دارد. و دارای یک هم نوع b به­عنوان گروه پروستاتیک می­باشد که اکسیداسیون ترکیبات پروتون­دهنده را با H2O2 کاتالیز می­کند و در نتیجه باعث تجزیه H2O2 می­گردد. (15، 25). آنزیم آسکوربات پراکسیداز از آسکوربات به­عنوان دهنده الکترون در ابتدای سیکل گلوتاتیون– آسکوربات استفاده می­کند و نقش مهمی در سمیت­زدایی  H2O2در سلول دارد (26). از آنجایی­که تجمع پراکسید هیدروژن ناشی از واکنش سوپراکسید دیسموتاز نیاز به فعالیت ترکیبی دو آنزیم پراکسیداز و کاتالاز به­منظور حفاظت سلول­های گیاهی خواهد داشت، لذا این آنزیم­ها نقش مهمی را در حذف پراکسید هیدروژن ایفاء می­نمایند. چرخه گلوتاتیون-آسکوربات نقش مهمی در ایجاد سیستم دفاعی در برابر تنش اکسیداتیو دارد و افزایش فعالیت آنزیم­های آن باعث کاهش اثرات تنش اکسیداتیو می­شود (20). به­طوری­که امروزه بسیاری از محققین بر این باورند که این چرخه اصلی­ترین نقش را در جمع­آوری H2O2 ایفا می­کند. لذا فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز به­عنوان آنزیم نهایی این چرخه، از اهمیت بالایی برخوردار بوده و کاهش فعالیت آن می­تواند سبب تجمع اکسیدان­ها گردد (12).

نتایج این تحقیق نشان داد که با افزایش سطوح تنش، میزان سدیم برگ افزایش در حالی­که میزان یون پتاسیم کاهش می­یابد. قولام و همکاران(13) ضمن بررسی افزایش شوری در پنج رقم چغندر­قند نشان دادند که یون­های معدنی، بیشتر در برگ­ها نسبت به ریشه­ها انباشته می­شوند و غلظتCl-  و Na+ افزایش می­یابد، در حالی­که غلظت K+ با تیمار شوری کاهش می­یابد. این یافته­ها با نتایج این پژوهش در مورد مقدار بالاتر یون­ها به خصوص کاتیون­ها در برگ­ها همخوانی دارد در بررسی تنش شوری در گیاهان اندازه­گیری یون­های سدیم و پتاسیم می­تواند به عنوان شاخصی از تحمل به شوری مورد استفاده قرار گیرد. تجمع سدیم در گیاه فشار اسمزی را افزایش می­دهد و گیاه از این راه با کاهش پتانسیل اسمزی محیط ریشه مقابله می­کند. پتاسیم یک عنصر ضروری برای رشد گیاه است، با افزایش کلرید سدیم در محیط، جذب میزان یون سدیم افزایش یافته و از جذب یون پتاسیم جلوگیری به­عمل می­آید که به­دنبال آن گیاه را با کمبود این عنصر ضروری روبه­رو می­کند. در محیط­های شور، گیاهان مقادیر زیادی از یون سدیم را به­جای یون­های کلسیم و پتاسیم جذب می­کنند که این امر سبب کمبود عناصر کلسیم و پتاسیم در گیاه می­شود و رشد را کاهش می­دهد (35).

در تحقیق حاضر میزان رنگدانه­های کلروفیل و کاروتنوئید با افزایش تنش­ شوری کاهش یافت. شوری باعث تخریب کلروپلاست­ها و عدم پایداری ترکیبات رنگیزه­ای و پروتئین می­شود. همچنین کاروتنوئیدها تحت تأثیر قرار گرفته و کاهش می­یابد(27). همچنین در اثر شوری میزان کلروفیل کاهش می­یابد که به دلیل فعالیت بیشتر کلروفیلاز در شرایط تنش شوری می­باشد. البته برخی مواد تنظیم­کننده رشد نظیر آبسیزیک، اتیلن و هترواکسین­ها موجب تحریک فعالیت این آنزیم می­شوند (24).

نتیجه گیری

با توجه به نتایج این آزمایش، در تنش شوری این گیاه قادر است تا حد شوری 400 میلی­مولار را بدون آسیب جدی به رشد گیاه تحمل کند. مطابق انتظار، میزان سدیم برگ افزایش و پتاسیم و رنگدانه­ها کاهش پیدا کردند که نتیجه اثر تنش شوری درگیاه می­باشد. در تنش شوری آنزیم آسکوربات پراکسیداز نسبت به آنزیم گایاکول پراکسیدازفعالیت بیشتری از خود نشان داد.. با توجه به مکانیسم دفاعی گیاه برای مقاومت در برابر تنش­­های اکسیداتیو و مداخله آنزیم­های پراکسیداز جهت دفع سمیت انواع اکسیژن فعال، میزان فعالیت این دو آنزیم تا 400 میلی مولار افزایش یافت. پس از آن با افزایش مولاریته نمکی میزان فعالیت آنزیم­ها کاهش پیدا کرد در نتیجه دامنه فعالیت این آنزیم­ها تا غلظت 400 میلی مولار بوده است و در مولاریته بالاتر غلظت نمک می تواند باعث بر هم زدن تعادل یونی محیطی که آنزیم فعالیت می­نماید وکاهش فعالیت این آنزیم­ها گردد. با توجه به اهمیت آنزیم­های پراکسیداز که اولین سد دفاعی یک گیاه هالوفیت تحت شرایط تنش می­باشند، بررسی فعالیت این آنزیم­ها و مقایسه آنها با فعالیت همان آنزیم­ها در گیاهان زراعی، در شرایط یکسان می­تواندگامی برای اصلاح و مقاوم سازی گیاهان زراعی باشد.

سپاسگزاری

آزمایش حاضر، در سال1390 در آزمایشگاه پژوهشکده ژنتیک طبرستان دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری انجام شد. از پژوهشکده ژنتیک و زیست فن آوری طبرستان (ساری) جهت فراهم نمودن تسهیلات و امکانات آزمایشگاهی و از دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری جهت فراهم نمودن تسهیلات مالی تشکر می نماییم.

1- احمدی، ع. احسان زاده، پ. و جباری، ف. 1383. مقدمه ای بر فیزیولوژی گیاهی. جلد اول. انتشارات دانشگاه تهران. صفحه653.

2- اسفندیاری، ا. و محبوب، س. و شکاری،ف. 1388. اصول فیزیولوژی گیاهی. انتشارات عمیدی تبریز. صفحه 156-159.

 

3- Ames,  BN., Shigena, MK., Hegen, TM.,1993. Oxidants, antioxidants and the degenerative disease of aging. Proceeding of Natural Academic USA. 90,7915-7922.

4- Asada, K.,2006.Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions, Plant Physiol,141, 391–396.

5- Blokhina, O., Fagerstedt, K.V., 2010. Oxidative metabolism, ROS and NO under oxygen deprivation, Plant Physiology and Biochemistry .1-14.

6- Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72,248-254.

7- Bor, M., Özdemir, F., Türkan, I., 2003. The effect of salt stress on lipid peroxidation and antioxidants in leaves of sugar beet Beta vulgaris L. and wild beet Beta maritima L. Plant Science. 164,77–84.

8- Chaves, MM., Maroco, JP., Pereira, JS., 2003. Understanding plant responses to drought –from genes to the whole plant. Function of Plant Biology. 30,239-264.

9- Demiral, T., Turkan, I., 2005. Comparative lipid peroxidation, antioxidant defense systems and proline content in roots of two rice cultivars differing in salt tolerance. Environmental and Experimental  Botany. 53, 247–257.

10- Dionisio-Sese, ML., Tobita, S., 1998. Antioxidant responses of rice seedlings to salinity stress. Plant Science (Limerick). 11135, 11–19.

11- Dixon, D. P., Cummins, I., Cole, D. J., and Edwards, R., 1998. Glutathione-mediated detoxification systems in plants. Current Opinion in Plant   Biology. 1, 258-266.

12- Foyer,  C.H., Harbinson, J., 1994.  Oxygen metabolism and the regulation of photosynthetic electron transport. In: Foyer,  C.H.  and Mul l ineausx,  P .  M.  (Ed s) .  Causes of photooxidative stress  and amelioration of defense system in plants". CRC Press, bocaraton, pp. 1-14.

13- Gholam, C., Foursy, A., Fares, K., 2002. Effects of salt stress on growth, inorganic ions and proline accumulation in relation to osmotic adjustment in five sugar beet cultivars. Environ. Exp.   Bot. 47, 39-50.

14- Goldack, D., Li, Ch., Mohan, H.R., Probst, N., 2014. Tolerance to drought and salt stress in plants unraveling the signaling networks. Frontiers in Plant Science. 5, 151-166.

15- Hasan Güngör, S., 2008. The effect of heavy metals on peroxidase from Jerusalem artichoke (Helianthus tuberous L.). African Journal of   biotechnology. 7 (13) ,2248-2253.

16- Hasanuzzaman, M., Anwar, M., Teixeira da Silva, J., Fujita, M., 2012. Plant response and tolerance to abiotic oxidative stress: Antioxidant defense is a key factor.Springer,New York, USA, pp.261-351.

17- Heidari, M., Mesri, F., 2008. Salinity effects on compatible solutes, antioxidants enzymes and ion content in three wheat cultivars. Pakistan J Biol Sci. 11(10), 1385-1389.

18- Heidari, M., Mesri, F., Keikhah, Z., 1389. Effect of salinity stress on nucleic acid metabolism and antioxidant enzymes activity, chorophyl floursence and balnces osmo regulators of five Canola varieties. Journal of Crop Sciences. 3,491-502.

19- Johnson, SM., Doherty, SJ., Croy, RRD., 2003.   Biphasic superoxide generation in potato tubers: a self-amplifying response to stress. Plant Physiology. 13,1440-1449.

20- Khanna-Chopra, R., Selote, DS., 2007. Acclimation to drought stress generates oxidative stress tolerance in drought-resistant than -susceptible wheat cultivar under field conditions. Environmental and Experimental Botany. 60,276–283.

21- Kawano, T., 2003.Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction. Plant Cell Rep. 21, 829-837.

22- Lichtenthaler, H. K., and Buschmann, C., 2001. Chlorophyl and carotenoids measurement and characterization by UV-VIS spectroscopy. Current protocols in Food Analytical Chemistry.

23- Merati, M.J., Niknam, V., Hassanpour, H. and Mirmasoumi, M. 1394. Comparative effects of salt stress on growth and antioxidative responses in different organs of pennyroyal (Mentha pulegium L.). J. Plant Research. 28 (5),1097-1107.

24- Modhan, M.M., Narayanan, S.L., Ibrahim, S. 2000. Chlorophyll stability indexes (CSI). Its impacts and salt tolerance in rice. IRRI, notes. 25, 38 – 40.

25- Mohapatra, D., Frias, M., Oliveira, R., Kerry, J., 2008. Development and validation of a model to predict enzymatic activity during storage of cultivated mushrooms (Agaricus   bisporus spp). Journal of Food Engineering. 86, 39-48.

26- Moore, K., Roberts, LJ., 1998. Measurement of lipid peroxidation. Free Radical Research. 28, 659–71.

27- Papp, J.C, Ball, M.C., Terry, N.. 1983. A comparative study of the effects of NaCl salinity on resonation, photosynthesis and leaf extension growth in   beta vulgaris L. plant, cell and environment. 6,675-677.

28- Peltzer, D., Dreyer, E., Polle, A., 2002. Differential temperature dependencies of antioxidative enzymes in two contrasting species. Plant Physiology and   biochemistry.40, 141-150.

29- Sairam, RK., Veerabhadra Rao, K., Srivastava, GC., 2002. Differential response of wheat genotypes to long-term salinity stress in relation to oxidative stress, antioxidant activity and osmolyte concentration. Plant Science. 163, 1037-1046.

30- Shigeoka, S., Ishikawa, T., Tamoi, M.,Miyagawa, Y., Takeda, T., Yabuta,  Y., Yoshimura, K., 2002. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes, J. Exp. Bot. 53, 1305–1319.

31- Tang, W., Newton, RJ., 2005. Peroxidase and catalase activities are involved in direct adventitious shoot formation induced by thidiazuron in eastern white pine (Pinus strobus L.) zygotic embryos. Plant Physiology and Biochemistry. 43,760-769.

32- Tester, M., Davenport, R., 2003. Na+ tolerance and Na+ Transport in higher plant. Annual Botany. 91, 503-527.

33- Torabi Pashai, S., Niknam, V., Ebrahimzadeh, H. and Sharifi, G.A. 1395. Comparative study of biochemical responses of different saffron (Crocus sativus) accessions to salt stress and alleviative effects of salicylic acid. J. Plant Research. 29(4), 728-740.

34- Wahing, I., Van, W., Houba, V.J.G., Vander, J.J., 1989. Soil and plant analysis a series of syllabi. Part7, Plant analysis procedure. Wageningen agriculture university.

35- Yassen, B.Y., Jurgees, G.A.. 1998. The response of sugar   beet leaf growth and its ionic composition to sodium chloride. Journal Agriculture and Water Resource Research. soil and Water Resources, 7(1), 47-59.

36- Yoshimura, K., Yabute, Y., Ishikawa, T., Shigeoka, S., 2000. Expression of spinach ascorbate peroxidase isoenzymes in response to oxidative stresses. Plant Physiology. 123, 223-233.