نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه اصفهان

چکیده

در این مطالعه اثر کاربرد خارجی گلایسین‌ بتائین بر میزان پرولین و ایجاد مقاومت به تنش شوری، گیاهان تنباکوی تراریخت حاوی بیان افزوده ژن P5CS، به صورت تصادفی با سه تکرار در شرایط کشت در شیشه مورد ارزیابی قرار گرفتند. به این منظور گیاهان تراریخت و غیر-تراریخت به محیط کشت MS در شرایط کشت بافت حاوی غلظت‌های صفر، 100و 200 میلی‌مولار نمک NaCl انتقال داده شدند. گیاهچه های تنباکو در مرحله چهار و شش برگی توسط گلایسین‌بتائین با غلظت‌های صفر، 20و 40 میلی گرم در لیتر محلول پاشی شدند. پس از 4 هفته نتایج نشان داد با افزایش میزان گلایسین‌بتائین در گیاهان در معرض شوری وزن تر و خشک، میزان پتاسیم، سطح برگ، گلایسین‌بتائین درونی و همچنین قند محلول در هر دو غلظت 20 و 40 میلی گرم در لیتر گلایسین‌بتائین افزایش معنی دار را نسبت به نمونه شاهد از خود نشان دادند. به علاوه میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی، پرولین و همچنین میزان سدیم نسبت به تیمار عدم کاربرد به تدریج کاهش یافت و کمترین این میزان در غلظت 40 میلی گرم در لیتر گلایسین‌بتائین بود. در مجموع نتایج این مطالعه نشان داد که کاربرد خارجی گلایسین ‌بتائین در گیاه تنباکو در کاهش اثرات تنش شوری و بهبود شاخص های رشد در شرایط تنش موثر بود. همچنین به نظر می‌رسد که عملکرد توأم گلایسین‌بتائین و تجمع پرولین ناشی از بیان افزوده ژن P5CS در گیاهان تراریخت باعث القا تحمل بیشتری به تنش شوری در این گیاهان گردید.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of exogenous glycinebetaine on proline and salt tolerance of transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plant under in vitro culture

نویسنده [English]

  • Marzieh Vahid Dastgerdi

University of isfahan

چکیده [English]

In the present study, transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants over expressing P5CS gene under in vitro salt stress condition. Tobacco plants transferred to MS medium containing 100 and 200 mM NaCl, then foliar application of two glycine betaine concentrations, including 20 and 40 mg L-1 were applied on the surface of the plants with four to six leaves at University of Isfahan in 2015 with a completely randomized design with three replications.
After 4 weeks post treatment results showed that, exogenous glycine betaine under salt stress increased fresh and dry weight, K+, content, leaf area, endogenous glycine betaine and soluble sugar. In contrast, the amount of photosynthetic pigments, proline, content, Na+ content, and Na+/K+ ratio were decreased. The results of this study showed that, exogenous application of glycine betaine in tobacco plants was effective in reducing the negative effects of salt stress and improved growth parameters. However preliminary experiments showed a decrease of proline and increase of endogenous glycine betaine in stressed platns. On the other hand, results indicated that, communion cooperation of these osmolytes to cope with stress conditions has possibly been occurred.
According to the results of this study, that cooperative roles of glycine betaine and proline in membrane stability and reducing the negative effects of salinity in both transgenic and non-transgenic plants it can be suggested.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "Glycine betaine"
  • "Proline"
  • "P5CS gene"
  • "Tobacco plants"
  • "Salt tolerance"

اثر کاربرد گلایسین­بتائین بر تحمل به شوری تنباکو تراریخت (Nicotiana tabacum) حاوی ژن P5CS

علی اکبر احسانپور

ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 15/1/97                تاریخ پذیرش: 23/7/97

چکیده

در این مطالعه اثر کاربرد خارجی گلایسین‌ بتائین بر میزان پرولین و ایجاد مقاومت به تنش شوری، گیاهان تنباکوی تراریخت حاوی بیان افزوده ژن P5CS، به صورت تصادفی با سه تکرار در شرایط کشت در شیشه مورد ارزیابی قرار گرفتند. به این منظور گیاهان تراریخت و غیر­تراریخت به محیط کشت MS حاوی غلظت­های صفر، 100و 200 میلی­مولار نمک NaCl انتقال داده شدند. گیاهچه های تنباکو در مرحله چهار و شش برگی توسط گلایسین­بتائین با غلظت­های صفر، 20و 40 میلی گرم در لیتر محلول پاشی شدند. پس از 4 هفته نتایج نشان داد با افزایش میزان گلایسین­بتائین در گیاهان در معرض شوری وزن تر و خشک، میزان پتاسیم، سطح برگ، گلایسین­بتائین درونی و همچنین قند محلول در هر دو غلظت 20 و 40 میلی گرم در لیتر گلایسین­بتائین افزایش معنی دار را نسبت به نمونه شاهد از خود نشان دادند. به علاوه میزان رنگیزه­های فتوسنتزی، پرولین و همچنین میزان سدیم نسبت به تیمار عدم کاربرد به تدریج کاهش یافت. در مجموع نتایج این مطالعه نشان داد که کاربرد خارجی گلایسین ‌بتائین در گیاه تنباکو در کاهش اثرات تنش شوری و بهبود شاخص های رشد در شرایط تنش موثر بود. همچنین به نظر می­رسد که عملکرد توأم گلایسین‌بتائین و تجمع پرولین ناشی از بیان افزوده ژن P5CS در گیاهان تراریخت باعث القا تحمل بیشتری به تنش شوری در این گیاهان گردید.  با توجه به نتایج این مطالعه، عملکرد توأم گلایسین‌بتائین و پرولین در ثبات غشا و کاهش اثرات منفی تنش شوری در گیاه تراریخت و غیر تراریخت تنباکو را می­توان پیشنهاد نمود.

واژه­های کلیدی: گلایسین­بتائین، پرولین، ژن  P5CS، گیاه تنباکو، تنش شوری

* نویسنده مسئول، تلفن: 03137934150، پست الکترونیکی: ehsanpou@sci.ui.ac.ir

مقدمه

 

تنش شوری یکی از مهم ترین عوامل محدود کننده رشد گیاه می­باشد. یکی از واکنش­های معمول گیاه برای مقابله با تنش، تنظیم اسمزی (Osmotic adjustment) می­باشد. تنظیم اسمزی در گیاهان از طریق تجمع انواع مختلفی از محلول­های آلی سازگار (Compatible solutes) در سیتوپلاسم صورت می­گیرد. یک دسته از مواد آلی سازگار در گیاهان گلایسین­بتائین می­باشد. گلایسین­بتائین در شرایط تنش می تواند از فعالیت آنزیم­های فتوسنتزی، ساختار پروتئین­ها و غشاهای سلولی محافظت نماید (10). پرولین نیز یکی از آمینواسید­های فعال در پدیده تنظیم اسمزی می­باشد که در ایجاد و حفظ فشار اسمزی درون گیاه نقش مهمی دارد (35). علاوه بر این پرولین در محافظت از ساختار­های سلولی در گیاهان در معرض تنش، پاکسازی گونه­های فعال اکسیژن و همچنین به عنوان مخزن انرژی جهت تنظیم پتانسیل ردوکس سلولی عمل مینماید (15).

گلایسین­بتائین در بسیاری از گیاهان زراعی مانند اسفناج، جو، گندم و سورگوم در واکنش به تنش­ها افزایش می­یابد (6). با این وجود همه گیاهان قادر به تولید این اسمولیت به مقدار کافی جهت مقابله با تنش نمی­باشند. از این رو کاربرد خارجی گلایسین بتائین به عنوان راه حلی برای افزایش غلظت این ترکیب در گیاهان ممکن است بتواند گیاه را در مقابله با شرایط تنشی یاری نماید. علاوه بر این به دلیل اهمیت تنش شوری در گیاهان و تولید گیاهان تراریخته‌ای که در این شرایط به رشد مناسب خود ادامه دهند، مسئله انتقال ژن به گیاهان مورد توجه قرار‌گرفته است (33). از‌آنجا‌که پرولین نیز یکی از اسمولیت‌های مهم در افزایش تحمل گیاه به تنش می‌باشد، دست‌ورزی ژنتیکی آنزیم‌های مسیر بیوسنتز آن به ویژه آنزیم 1-پیرولین-5-کربوکسیلات سنتتاز (P5CS) در گیاهان می‌تواند افزایش تحمل به تنش را باعث شود. بطوریکه نقش مثبت پرولین در تعدیل فشار اسمزی نسبت به شرایط شوری در گیاهان مختلفی همچون تنباکو (Nicotiana tabacum) گزارش شده است  (23،11). در بسیاری از موارد اثرات مثبت کاربرد خارجی گلایسین بتائین روی رشد و عملکرد گیاهان تحت تنش گزارش شده است. در گزارشی Makela و همکاران (1996) اظهار داشتند که با مصرف خارجی، گلایسین بتائین سریعاً به داخل برگ­های گیاهی نفوذ کرده و به ریشه­ها، مریستم­ها و برگ­های توسعه یافته منتقل می­شود و اندام­های گیاهی در حال نمو را از تنش حفظ می­کند. علاوه بر این مشاهده شده است که گلایسین بتائین در بافت گیاهی برای چند هفته به حالت غیر متابولیزه باقی مانده و به محض وارد شدن تنش به اندام­های گیاهی منتقل شده و به عنوان یک تعدیل کننده  اسمزی در سلول­ها فعالیت می­کند (21). علاوه بر این در گزارش منتشر شده توسط Hu در سال 2012 نشان داده شده که در بعضی از گیاهان افزایش میزان گلایسین بتائین موجب افزایش غلظت پرولین می­شود در حالیکه در بعضی دیگر از گیاهان باعث کاهش میزان پرولین گردیده است (18). به طوریکه کاربرد خارجی گلایسین بتائین در گیاه گوجه فرنگی سطوح بالایی از تجمع پرولین تحت تنش شوری را نشان می­دهد (12). در مقابل کاربرد خارجی گلایسین بتائین در دیسک های برگی Brassica باعث ممانعت از تجمعپرولین می­شود.

Nicotiana tabacum  از خانواده بادنجانیان جز گیاهان غیر تجمع دهنده گلیسین‌بتائین می‌باشد (32) و به دلیل استفاده وسیع در تحقیق و پژوهش‌های زیست‌شناسی و کشاورزی به‌عنوان یک گیاه الگو و مدل استفاده می‌شود.

همانطور که گفته شد اگرچه اثرات مثبت گلایسین­بتائین و پرولین خارجی بر افزایش تحمل در برابر تنش شوری پیش از این گزارش شده است، با این وجود تلاقی این دو اسمولیت نیز با هم برای مقابله با تنش ناشناخته است. علاوه بر این اطلاعات در زمینه اثر این اسمولیت آلی در گیاهان تراریخت حاوی ژن P5CS محدود است. هدف از آزمایش حاضر بررسی اثر گلایسین­بتائین بر تحمل به تنش شوری و میزان پرولین گیاهان تراریخت در شرایط کشت در شیشه است. داده­های پژوهش حاضر می­تواند به درک بهتر نحوه عملکرد گلایسین­بتائین بر میزان پرولین و یا عملکرد توأم این دو اسمولیت مهم آلی در ایجاد تحمل به شوری گیاهان کمک نماید.

مواد و روشها

در این پژوهش از بذر گیاه تنباکو (Nicotiana tabacum) رقم Wisconsin تراریخت حاوی بیان افزوده ژن P5CS، تهیه شده در آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهی اصفهان در سال 1394 استفاده شد. در ادامه بذر­های تراریخت و غیر تراریخت (به عنوان کنترل منفی) به مدت 5 دقیقه در اتانول 70%، سپس به مدت 15 دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم 10% ضد عفونی و در پایان با آب مقطر استریل سه مرتبه شستشو داده شدند. در مرحله بعد بذر­های استریل روی محیط کشت MS کشت داده شدند. پس از 20 روز گیاهچه­ها به محیط کشت MS حاوی نمک NaCl در غلظت­‌های 0، 100 و 200 میلی مولار منتقل گردید و در دو مرحله 4 و 6 برگی با محلول گلایسین بتائین در غلظت­های 20،0 و 40 میلی‌گرم در لیتر محلول پاشی شدند. کلیه کشت­ها در اتاق کشت با فتوپریود 16 ساعت  روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای C˚25 - 23 و نور حدود 45 میکرو مول فوتون بر متر مربع بر ثانیه رشد داده شدند. پس از گذشت 4 هفته پارامتر­های مورد نظر اندازه گیری شد. پس از گذشت 4 هفته پارامتر­های مورد نظر اندازه گیری شد.

وزن تر و خشک  گیاهان پس از اندازه گیری وزن جمع تمام گیاهان در یک شیشه بعنوان یک تکرار محاسبه و گزارش گردید. جهت بررسی تغییرات مقدار محتوای کلروفیل، استخراج کلروفیل برگ با استفاده از استون و اندازه گیری آن با کمک روش Lichtenthaler (1987) به کمک اسپکتروفتومتر مدل AE-UV1600 انجام و در نهایت با استفاده از فرمول‌های زیر محاسبه گردید (20).

Chla = )12.25 A663.2( – )2.79 A646.8(

Chlb = )21.21 A646.8( – )5.1 A663.2(

Chla+b = chla + chlb

Car = (1000A470 - 1.8 chla - 85.02 chlb) / 198

جهت اندازه‌گیری سدیم و پتاسیم، از سولفوسالیسیلیک اسید 3% به عنوان محلول استخراج از نمونه­های آسیاب شده استفاده شد. سپس عصاره با استفاده از دستگاه شعله سنج مدل Halstead,Essex-corning410 قرائت گردید.مقدار پرولین به روش Bates و همکاران (1973) تعیین شد (7). جهت اندازه‌گیری مقدارگلایسین بتائین به روشGrieve و Grattan (1983) عمل شد. به این منظور25 میلی گرم بافت گیاهی با اسید سولفوریک 2 نرمال رقیق گردید. و بعد از اضافه کردن 2/0 میلی لیتر معرف KI-I2 سرد به نمونه ها در دور rpm 10000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس کریستال های ته نشین شده در 3 میلی لیتر حلال 1و2 دی کلرواتان حل شده و جذب محلول در طول موج 365 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مدل AE-UV1600 خوانده شد (16). کربوهیدرات محلول نیز با روش فنل - اسیدسولفوریک غلیظ مورد اندازه گیری قرار گرفت (14). کلیه آزمایشات با حداقل 3 تکرار انجام شده و تجزیه واریانس داده­ها با استفاده از نرم افزار SPSS، آزمون Two-Way  ANOVA تحلیل و مقایسه میانگین داده­ها بر اساس آزمون Dancan در سطح 5 درصد مورد مقایسه قرار گرفتند و نمودارها به‌وسیله‌ی نرم‌افزار Excel رسم شد.

نتایج

اثر گلایسین بتائین بر وزن­تر و خشک گیاه: تنش شوری موجب کاهش وزن تر و خشک گیاه شد (جدول1). در مقابل افزایش وزن تر وخشک بر اثر تیمار گلایسین­بتائین در گیاه تحت تنش شوری مشاهده گردید. نتایج همچنین نشانگر عدم تفاوت معنی داری از نظر رشد تحت تنش شوری و تیمار گلایسین­بتائین در دو نوع گیاه تراریخت و غیر تراریخت بود.

اثر گلایسین بتائین بر سطح برگ گیاه: با توجه به جدول 1 نتایج نشان داد که سطح برگ در هر دوگیاه تراریخت و غیرتراریخت با افزایش تنش به طور معنی­داری کاهش یافت. به طوریکه در گیاهان غیرتراریخت در غلظت­های 100 و 200 میلی مولار نمک به ترتیب 47 و 75 و در گیاهان تراریخت به ترتیب 39 و 2/76 درصد کاهش نسبت به نمونه شاهد مشاهده شد. در مقابل تیمار گلایسین­بتائین مقدار سطح برگ گیاهان تحت تنش شوری را افزایش داد. نتایج همچنین نشان دهنده افزایش بیشتر سطح برگ گیاه تراریخت در اثر تیمار گلایسین بتائین نسبت به گیاه غیر تراریخت در شوری 100 میلی مولار بود.

اثر گلایسین بتائین بر رنگیزه های فتوسنتزی: نتایج جدول 1 نشان می­دهد که میزان رنگیزه های فتوسنتزی تفاوت معنی داری در دو سطح شوری 100 و 200 میلی مولار در دو نوع گیاه تراریخت و غیر تراریخت نسبت به گیاهان شاهد نشان ندادند، در مقابل میزان آنها در اثر تیمار گلایسین­بتائین کاهش یافت. به طوریکه میزان کلروفیل کل در دو سطح 20 و 40 میلی گرم گلایسین­بتائین کاهش یافت همچنین بین دو نوع گیاه تحت تنش شوری و تیمار گلایسین­بتائین تفاوت معنی داری مشاهده نشد. همچنین میزان کاروتنوئید های گیاهان غیر تراریخت در شوری 200 میلی مولار کاهش معنی داری نسبت به شوری 100 میلی مولار داشته است (جدول 2).

 

 

جدول 1- اثر تیمار گلایسین­بتائین بروزن تر و خشک (gr)، سطح برگ (mm2) و کلروفیل کل (mg.gˉˡfw) گیاهان غیر تراریخت (NT) و تراریخت (T) تنباکو تحت تنش شوری. . داده­ها میانگین سه تکرار± انحراف معیار و حروف مشابه بیانگر عدم تفاوت معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‌باشد.

40GB T

20GB T

0GB T

40GB NT

20GB NT

0 GB NT

 

پارامتر

56/0±01/0a

54/0±01/0a

41/0±03/0b

41/0±03/0b

40/0±05/0b

26/0±01/0cdefg

0 salt

وزن تر

31/0±03/0cd

30/0±01/0cdef

23/0±01/0gh

23/0±01/0gh

30/0±04/0cde

21/0±01/0ghi

100 salt

/025±01/0efgh

23/0±01/0gh

15/0±02/0ij

15/0±02/0ij

19/0±02/0hi

12/0±01/0j

200 salt

02/0±01/0a

02/0±01/0ab

02/0±.01/0cde

02/0±.01/0cde

02/0±01/0bcd

01/0±01/0ef

0 salt

وزن خشک

02/0±01/0bcd

02/0±01/0bcd

01/0±01/0ef

01/0±01/0ef

02/0±01/0cde

01/0±01/0gh

100 salt

01/0±01/1cdef

01/0±01/1fg

01/0±01/1hi

01/0±01/1hi

01/0±01/1fg

01/0±01/1i

200 salt

16/17±24/1a

33/14±02/1b

5/10±47/1de

5/10±47/1de

16/13±62/0bc

33/10±47/0de

0 salt

سطح برگ

16/14±84/0b

16/12±62/0cd

5/6±08/1f

5/6±08/1f

10±40/0e

5/5±81/0fg

100 salt

5/6±40/0h

8/4±47/0fg

5/2±40/0h

5/2±40/0h

66/2±84/0gh

66/3±23/0h

200 salt

1/87±0/24e

2/25±0/07d

2/78±0/11ab

2/35±0/05cd

2/63±0/01bc

2/97±0/19a

0 salt

کلروفیل کل

2/60±0/01bc

2/34±0/17cd

3/04±0/02a

2/60±0/16bc

2/91±0/12ab

3/02±0/12a

100 salt

2/59±0/02bc

2/61±0/08bc

2/74±0/03ab

2/32±0/07cd

2/22±0/13d

2/81±0/07ab

200 salt

 

 

جدول 2- اثر تیمار گلایسین­بتائین برکاروتنوئید (mg.gˉˡfw) گیاهان غیر تراریخت (NT) و تراریخت (T) تنباکو تحت تنش شوری. . داده­ها میانگین سه تکرار± انحراف معیارو حروف مشابه بیانگر عدم تفاوت معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‌باشد.

40GB T

20GB T

0GB T

40GB NT

20GB NT

0 GB NT

 

پارامتر

3/68±0/46k

4/41±0/53j

5/24±0/29fghi

5/83±0/26efg

6/46±0/05cde

7/28±0/51ab

0 salt

کاروتنوئید

5/04±0/03hij

4/53±0/32ij

5/90±0/07def

6/53±0/56cde

6/97±0/28abc

7/42±0/46a

100 salt

4/88±0/25hij

5/07±0/19hij

5/45±0/06fgh

5/55±0/07fgh

5/13±0/22gij

6/60±0/19bcd

200 salt

 


اثر گلایسین بتائین بر میزان سدیم و پتاسیم: باتوجه به شکل 1 در تنش شوری، میزان سدیم به پتاسیم گیاه افزایش یافت و در شوری 100 میلی مولار به همراه گلایسین­بتائین در گیاهان غیر تراریخت کاهش معنی دار میزان سدیم و افزایش پتاسیم مشاهده شد. در مقابل کاهش  میزان سدیم و افزایش پتاسیم توسط هر دو غلظت گلایسین­بتائین (20 و 40 میلی گرم بر لیتر) در شوری 200 میلی مولار در هر دو نوع گیاه غیر تراریخت و تراریخت مشاهده گردید. بین دو نوع گیاه در نمونه های شاهد و شوری 100 میلی مولار اختلاف معنی داری در نسبت سدیم به پتاسیم مشاهده شد.

 

 

 

شکل 1- اثر تیمار گلایسین­بتائین بر سدیم (A)، پتاسیم (B) و نسبت سدیم بر پتاسیم (C) گیاهان غیر تراریخت (NT) و تراریخت (T) تنباکو تحت تنش شوری. . داده­ها میانگین سه تکرار± انحراف معیارو حروف مشابه بیانگر عدم تفاوت معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‌باشد.

اثرگلایسین بتائین بر میزان پرولین: تنش شوری در هر دو سطح 100 و 200 میلی مولار سبب افزایش پرولین برگ گردید (شکل 2). در شوری 200 میلی مولار در هر دو دو نوع گیاه تراریخت و غیرتراریخت ، گلایسین بتائین باعث کاهش میزان پرولین برگ شد. به طوریکه میزان پرولین بخش هوایی در گیاهان تراریخت درغلظت های 20 و 40 میلی گرم بر لیتر گلایسین بتائین به ترتیب 23/1 و 22/1 برابر بیشتر از گیاهان غیر تراریخت بود.

میزان پرولین در ریشه گیاهان نیز با افزایش شوری به طور معنی داری افزایش یافت. در مقابل تیمار گلایسین بتائین میزان پرولین را نسبت به گیاهان بدون تیمار کاهش داد. نتایج نشان داد پرولین در گیاهان غیر تراریخت نسبت به تراریخت کاهش معنی دار داشته است. در مجموع میزان پرولین ریشه در گیاهان تراریخت درغلظت های 20 و 40 میلی گرم بر لیتر گلایسین بتائین به ترتیب 38/1 و 32/1 برابر بیشتر از انواع غیر تراریخت در شوری 100 میلی مولار بوده است.

 

 

شکل 2- اثر تیمار گلایسین­بتائین بر میزان پرولین برگ (A)، ریشه (B) گیاهان غیر تراریخت (NT) و تراریخت (T) تنباکو تحت تنش شوری. داده­ها میانگین سه تکرار± انحراف معیارو حروف مشابه بیانگر عدم تفاوت معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‌باشد.

اثرگلایسین بتائین بر میزان گلایسین بتائین درونی: بررسی مقدار گلایسین بتائین (شکل 3) گیاه نشان داد که تیمار های تنش شوری و گلایسین بتائین میزان گلایسین بتائین درونی گیاه را افزایش داده است. علاوه بر این نتایج نشان داد که گیاهان غیر تراریخت در مجموع از میزان گلایسین بتائین درونی بالاتری نسبت به گیاهان تراریخت برخوردار بودند.

 

شکل 3- اثر تیمار گلایسین­بتائین بر میزان گلایسین­بتائین درونی گیاهان غیر تراریخت (NT) و تراریخت (T) تنباکو تحت تنش شوری. داده­ها میانگین سه تکرار± انحراف معیارو حروف مشابه بیانگر عدم تفاوت معنی‌دار بر اساس آزمون دانکن در سطح 5 درصد می‌باشد.

اثرگلایسین بتائین بر قند محلول: با توجه به شکل 4، با افزایش غلظتنمک، میزان قند های محلول در گیاهان بدون تغییر باقی ماند.کاربرد گلایسین بتائین در شرایط تنش میزان قند محلول را افزایش داد. همچنین افزایش مقدار قند های محلول در گیاهان تراریخت تیمار شده با گلایسین­بتائین بیشتر از گیاهان غیر تراریخت بود به‌طوریکه در هر دو غلظت‌ 20 و 40 میلی گرم در لیتر گلایسین­بتائین با گیاهان تراریخت اختلاف معنی‌داری مشاهده شد.

 

شکل 4- اثر تیمار گلایسین­بتائین بر میزان قند محلول گیاهان غیر تراریخت (NT) و تراریخت (T) تنباکو تحت تنش شوری. داده­ها میانگین سه تکرار± انحراف معیارو حروف غیرمشترک بیانگر معنی‌دار بودن داده­ها بر اساس آزمون دانکن می‌باشد( (P<0.05.

بحث

نتایج پژوهش حاضر در زمینه بررسی اثر گلایسین بتائین خارجی بر میزان پرولین و همچنین مشارکت این دو ماده در مقابله با تنش نشان داد که تیمار گلایسین­بتائین در گیاه تراریخت  Nicotiana tabacum حاوی  بیان  افزوده  ژن P5CS ، پاسخ این گیاه در مقابل تنش شوری را تحت تأثیر قرار می­دهد. نتایج نشان داد که تنش شوری وزن تر و خشک گیاه را کاهش می­دهد. شوری از طریق افزایش غلظت نمک های محلول سبب منفی­تر شدن پتانسیل اسمزی محیط و در نهایت کاهش جذب آب شده و منجر به کاهش تقسیم و طویل شدن سلول­ها در منطقه رشد می­گردد(3). مشابه با نتایج حاضر، Dogan (2013) نیز کاهش وزن تر و خشک گیاه سویا تحت تنش را نشان داد (12).  بررسی­ها نشان می­دهد که گلایسین­بتائین با تجمع در سلول­های گیاه و با حفظ فشار آماس سلول­ها به توسعه سلولی و رشد گیاه در شرایط تنش کمک می­کند. علاوه بر این رشد بهتر گیاهان تراریخت در طول تنش شوری را می­توان به علت فعالیت پرولین بعنوان یک آنتی اکسیدان در حفظ ساختار غشا و در نتیجه کاهش تولید رادیکال های آزاد تحت تنش شوری دانست (9). یکی از راه کارها دیگر گیاه در زمان وقوع تنش، کاهش سطح برگ می­ باشد. گلایسین­بتائین در جهت افزایش آب مورد نیاز سلول و در نهایت تولید انرژی زمینه رشد ، تقسیم سلولی و افزایش سطح برگ در طی تنش شوری را فراهم می­کند (9). با این وجود، سازوکار دقیقی که گلایسین­بتائین از طریق آن تحمل به تنش را القا می­کند هنوز به خوبی درک نشده است. عدم تفاوت معنی داردر میزان سطح برگ در بین دو گیاه تراریخت و غیر ترایخت را می­توان مربوط به غلظت های نمک بکار رفته در این مطالعه دانست. بر این اساس شاید بتوان چنین استنباط نمود که این سطوح شوری تأثیری در ایجاد تفاوت بین دو نوع گیاه مذکور نداشته است. نتایج نشان دهنده عدم تغییر میزان کلروفیل گیاه در طی شوری است. این نتیجه در راستای مطالعات پیشین در این زمینه بوده و احتمالاً به شدت و مدت تنش بستگی دارد (4). در مقابل در مطالعه حاضر، تیمار گیاه با گلایسین بتائین منجر به کاهش معنی دار میزان رنگیزه های فتوسنتزی در گیاهان شد. احتمالاً کاهش میزان رنگیزه های فتوسنتزی توسط گلایسین بتائین خارجی رابطه عکس با افزایش سطح برگ گیاهان داشته است. بنابراین علت این کاهش شاید افزایش حجم و تعداد سلول در اثر تیمار گلایسین­ بتائین و در نتیجه عدم تناسب سنتز کلروفیل برگ و حجم و تعداد سلول باشد . به عبارت دیگر ممکن است  بتوان رقیق شدن میزان رنگدانه ای برگ به دنبال تیمار گلایسین­بتائین را پیشنهاد نمود (8). از طرف دیگر کاهش سطح برگ در اثر تنش شوری پدیده شناخته شده است که در بسیاری از گیاهان گلیکوفیت اتفاق می افتد. بنابراین در تنش شوری شاید بتوان اینطور اسنتباط نمود که کاهش سطح برگ منجر به تغلیظ کلروفیل می گردد (1).

تنش شوری می­تواند با خسارت به غشا و رها سازی یون ها از سلول به فضای بین سلولی بر هموستازی یون پتاسیم و بقا گیاهان اثر ­گذارد. در این راستا به منظور آزمودن اثر تیمار گلایسین­بتائین بر القا تحمل گونه Nicotiana tabacum  میزان یونهای سدیم و پتاسیم پس از تیمار با گلایسین­بتائین تحت تنش شوری بررسی شد. نتایج نشان داد که تنش شوری میزان سدیم را افزایش و پتاسیم را کاهش داد،که با نتایج گزارش شده توسط Dogan (2013) هماهنگی دارد (13). در پژوهش حاضر گلایسین­بتائین در تنش شوری باعث کاهش سدیم و افزایش پتاسیم نسبت به گیاه شاهد گردید. اثرات مثبت بکارگیری گلایسین­بتائین در تنش شوری به اثرات حفاظتی آن بر پراکسیداسیون لیپید غشا و سمیت زدایی رادیکال های آزاد اکسیژن مربوط می­باشد که موجب حفظ هموستازی پتاسیم سیتوزول و کاهش جریان آپویلاستی سدیم می­شود  (30). کم تر بودن میزان نسبت Na+/K+در گیاهان تراریخت نسبت به گیاهان غیر ترایخت را می­توان به عملکرد مستقیم پرولین در پاکسازی ROS تولیدی در تنش و کاهش تخریب غشا ناشی از آن دانست (31). نتایج مشابه در گیاهان تراریخت برنج، گندم و کتان حاوی ژن P5CS مشاهده شده است (35).

با افزایش غلظت سدیم کلرید بر مقدار پرولین اضافه گردید، پرولین ترکیبی است که در پاسخ به تنش شوری تمایل به افزایش دارد.البته این مسئله برای تنظیم و تعدیل فشار اسمزی در گیاهان تحت تنش بسیار مهم است(2). نتایج این آزمایش در هماهنگی با نتایج مطالعات قبلی نشان دهنده افزایش میزان پرولین در برگ و ریشه گیاهان تحت تنش شوری است (13). در این مطالعه کاربرد گلایسین‌بتائین موجب جلوگیری از افزایش بیشتر پرولین در گیاهان گردید. مشابه با نتایج بدست آمده در آزمایشی بر روی گیاهان کلزا نشان داده شد که گلایسین­بتائین خارجی در شرایط شوری باعث کاهش میزان پرولین می­گردد (6). در این رابطه گمان می­رود که جذب گلایسین­بتائین و تجمع آن در گیاه برای مقابله با تنش شوری کافی است. بنابراین نیاز به افزایش بیشتر پرولین را کم می‌کند. چنین عملکردی در مطالعات قبلی به گلایسین­بتائین در گیاه تنباکو نسبت داده شده است (12). همچنین ممکن است که افزایش میزان پرولین در طول تنش شوری بیشتر به عنوان یک شاخص عکس العملی به شوری، نه تحمل به تنش شوری عمل کند بنابراین کاهش میزان پرولین در اثر کاربرد گلایسین­بتائین می­تواند نشان دهنده کاهش اثرات تنش شوری توسط تیمار گلایسین­بتائین باشد (5). نتایج مطالعات Rajaeian و Ehsanpour در سال (2017) در بررسی اثر گلایسین­بتائین بر فعالیت دو ژن P5CS و PDH در گیاه تنباکو تحت تنش شوری تأیید کننده این فرض می­باشد. در آن مطالعه گزارش شده است تیمار اتانول امین (پیش ساز بیو سنتز گلایسین­بتائین) موجب افزایش گلایسین­بتائین و کاهش فعالیت آنزیم P5CS و افزایش فعالیت PDH (پرولین دهیدروژناز) می­گردد (26). با استناد به این یافته، احتمالاً کاهش میزان پرولین توسط تیمار گلایسین­بتائین در هماهنگی با فعالیت آنزیم های مذکور می­باشد. مسلم است که این فرضیه به آزمایشات دقیق تری نیاز دارد تا نحوه عملکرد دقیق گلایسین­بتائین روی این دو آنزیم روشن شود. همچنین نتایج نشان دهنده تجمع بیشتر پرولین در ریشه­های در معرض شوری نسبت به بخش های هوایی می­باشد. افزایش میزان پرولین ریشه نسبت به برگ ها در گیاه Prosopis alba گزارش شده است (22). این امر احتمالاً می­تواند مربوط به غلظت های Na+ در محیط باشد. بنابراین در اثر قرار گرفتن ریشه در محیط حاوی غلظت های بالای نمک نسبت به بخش های هوایی از میزان بالاتری از پرولین در ریشه مشاهده می­شود. البته هنوز این سؤال اساسی بدون پاسخ قطعی باقی مانده است که آیا شوری بیشتر در محیط ریشه منجر به سنتز پرولین بیشتر در آن شده و یا موجب انتقال بیشتر پرولین از برگ به ریشه شده است. علاوه بر این گمان می­رود که غلظت های بالای پرولین در ریشه به عنوان ذخیره کربن و نیتروژن عمل کرده (17) و باعث افزایش رشد ریشه در پاسخ به پتانسیل آبی پایین می­شود. گیاهان تنباکوی تراریخت حاوی ژن P5CS در آزمایش ما از میزان پرولین بالاتری نسبت به گیاهان غیر تراریخت برخوردارند و مقاومت بهتری را در تنش شوری نشان می­دهند. نتایج مشابه دیگر در گیاهان تراریخت سیب زمینی (19)،اطلسی (33) و تنباکو (29) نشان دهنده نقش مهم بیوسنتز پرولین در گیاهان تراریخت در برابر تنش های غیر زیستی می­باشد. نتایج ما نشان می­دهد که علاوه بر پرولین مقدار گلایسین­بتائین در طی تنش افزایش می­یابد و تأییدی بر سمیت زدایی ROS تولید شده از تنش اکسیداتیو توسط گلایسین­بتائین و حفاظت بسیاری از آنزیم های سیتوپلاسمی و دیگر ماکرومولکول ها در سلول های در معرض تنش است. افزایش غلظت گلایسین­بتائین درونی در اثر تیمار گلایسین­بتائین در بسیاری از گیاهان در معرض تنش شوری نیز مشاهده شده است (28). بر اساس نتایج Weretilnyk و همکاران (1989)، Nicotiana tabacum جز گیاهان غیر تجمع دهنده گلایسین­بتائین می­باشند (32). لازم بذکر است که در مطالعه حاضر شناسایی گلایسین بتایین در گیاه تنباکوی مورد مطالعه خلاف این ادعا را اثبات نمود. به هر حال اظهار نظر قطعی در این خصوص نیاز به بررسی های دقیق تری دارد. بنابراین کاربرد برگی گلایسین­بتائین باعث افزایش تحمل به تنش شوری در این گیاه می­شود. افزایش غلظت گلایسین­بتائین درونی در اثر تیمارگلایسین­بتائین می­تواند به چند دلیل باشد. به عنوان مثال تنش شوری می­تواند نقش محرک در بیوسنتز گلایسین­بتائین درونی داشته باشد، دلیل دیگر جذب و سرعت انتقال اسپری برگی گلایسین­بتائین است (21) و اینکه عدم متابولیزه شدن این اسمولیت و پایداری آن بعد از کاربرد می­تواند در افزایش میزان گلایسین­بتائین درونی گیاه مؤثر باشد (23). میزان گلایسین­بتائین درونی در تیمار 40 میلی گرم بر لیتر گلایسین­بتائین نسبت به 20 میلی گرم بر لیتر آن کمتر بود. کاهش غلظت گلایسین­بتائین درونی در این غلظت شاید به این دلیل است که گلایسین­بتائین در این غلظت بیشتر در مسیر های تولید پروتئین و یا متابولیسم نیتروژن شرکت نموده است (25). بر اساس نتایج بدست آمده، گلایسین­بتائین در بین گیاهان تراریخت و غیر تراریخت بدون تیمار گلایسین­بتائین بجز شوری 200 میلی مولار تفاوت معنی داری نشان نداد. این نتایج در هماهنگی با نتایج حاصل از میزان پرولین در این زمینه می­باشد. همچنین غلظت گلایسین­بتائین درونی در گیاهان تراریخت افزایش کمتری نشان داد. با توجه به اینکه پرولین یکی از مهم ترین مواد اسمولیت سازگار در تنش های محیطی می­باشد و گیاهان تراریخت حاوی ژن P5CS دارای تولید افزوده پرولین می­باشند بنابراین به نظر می­رسد گلایسین­بتائین در این گیاهان به عنوان یک اسمولیت ثانویه بعد از پرولین عمل می­نماید (4) به طوریکه میزان گلایسین­بتائین درونی در این گیاهان نسبت به گیاهان غیر تراریخت کمتر می­باشد. با وجود اینکه افزایش میزان کربوهیدرات ها به عنوان استراتژی دفاعی در مقابل تنش شوری در گزارشات زیادی عنوان شده است، نتایج ما حاکی از عدم تغییر قند در تنش شوری بدون تیمار گلایسین­بتائین بود که مشابه با نتایج Morgan در گیاه گندم است (24). علاوه بر این با توجه به اینکه در گیاهان تحت تنش شوری نسبت به نمونه های کنترل کاهش سطح برگ اتفاق افتاده، شاید بتوان بخشی از عدم تغییر میزان کربوهیدارت ها در برگ را به تغلیظ کربوهیدرات ها و احتمالا بخش دیگری را به کاهش فرایند تثبیت کربن و فرایند فتوسنتز نسبت داد. به هر حال اظهار نظر قطعی در این خصوص زمانی میسر است که میزان فتوسنتز گیاه را در این شرایط اندازه گیری نمود. در مقابل وقتی گیاهان تحت تنش شوری با گلایسین­بتائین تیمار شدند نتایج ما نشانگر تأثیر گلایسین­بتائین در افزایش میزان کربوهیدرات های محلول بود که احتمال می­رود گلایسین­بتائین با حفاظت از دستگاه فتوسنتزی و رنگدانه های فتوسنتزی در شرایط شوری منجر به افزایش تثبیت CO2 و در نتیجه افزایش میزان کربوهیدرات های محلول گردیده باشد. در مطالعه حاضر مقدار کربوهیدرات­های محلول در گیاهان تراریخت در مقایسه با گیاهان غیر تراریخت بیشتر بود. در این گیاهان به دلیل وجود تولید افزوده پرولین و عملکرد مشابه با گلایسین­بتائین در تثبیت CO2 و بالاتر بودن محتوای کلروفیلی آنها نسبت به گیاهان غیر تراریخت احتمالاً تجمع کربوهیدارت­ها در آنها بیشتر گردیده است.

نتیجه گیری

در مجموع با توجه به داده­های این پژوهش، اگرچه کاربرد گلایسین بتائین موجب کاهش میزان پرولین شده است، اما گیاهان تراریخت در مقایسه با انواع غیر تراریخت از کاهش پرولین کمتری برخوردار بوده و اینکه که عملکرد توأم گلایسین‌بتائین و پرولین مرتبط با تجمع پرولین ناشی از بیان افزوده (over expression) ژن P5CS در گیاهان تراریخت باعث القا تحمل بیشتری به تنش شوری در این گیاهان گردیده است. با این وجود، بررسی­های بیشتر و جامع تری به منظور آشکار شدن اثر متقابل این دو اسمولیت بر هم لازم به نظر می­رسد.

1- نجفی ن.، سرهنگ زاده الف.، 1391. اثر شوری کلرید سدیم و غرقاب شدن خاک بر ویژگی­های رشد ذرت علوفه­ای در شرایط گلخانه­ای. مجله علوم و فنون کشت­های گلخانه­ای، 10 (3): 15-1.

2- جهانبازی گوجانی، ح. حسینی نصر، م. ثاقب طالبی، خ. حجتی، م. 1393. تأثیر تنش شوری بر فاکتورهای رویشی، پرولین، رنگیزه های گیاهی و جذب عناصر در اندام هوایی چهار گونه بادام وحشی. مجله زیست شناسی ایران جلد27، شماره 5، صفحات 787-777

3- عموآقایی، ر. قربان نژاد نی ریزی، ه. مستاجران، ا. 1393. بررسی اثر شوری بر رشد گیاهچه، میزان کلروفیل، محتوای نسبی آب و پایداری غشا در دو رقم کلزا. مجله زیست شناسی ایران جلد 27، شماره 2، صفحات 268-256

 

4- Al Hassan, M., FUERTES, M.M., SÁNCHEZ, F., Vicente, O., Boscaiu, M., 2015. Effects of salt and water stress on plant growth and on accumulation of osmolytes and antioxidant compounds in cherry tomato. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 43:1.

5- Ashraf, M., 1989. The effect of NaCl on water relations, chlorophyll, and protein and proline cont ents of two cultivars of blackgram (Vigna mungo L.). Plant and Soil, 119:205-10.

6- Ashraf, M., Foolad, M., 2007. Roles of glycine betaine and proline in improving plant abiotic stress resistance. Environmental and Experimental Botany, 59: 206-216.

7- Bates,  L.,  Waldren,  R.,  Teare,  I.,  1973.  Rapid  determination  of  free proline for water-stress studies. Plant and Soil, 39: 205-207.

8- Chaum,  S.,  Kirdmanee,  C.,  2010.  Effect  of  glycinebetaine  on proline,  water  use,  and  photosynthetic  efficiencies,  and  growth  of  rice seedlings under salt stress. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 34, 517-527.

9- Chen,  T.H.,    Murata,  N.,  2002.  Enhancement  of  tolerance  of  abiotic stress  by metabolic  engineering  of  betaines  and  other  compatible  solutes. Current Opinion in Plant Biology, 5: 250-257.

10- Chen, Z., Cuin, T.A., Zhou, M., Twomey, A., Naidu, B.P., Shabala, S., 2007.  Compatible  solute  accumulation  and  stress-mitigating  effects  inbarley  genotypes  contrasting  in  their  salt  tolerance.  Journal  of Experimental Botany 58, 4245-4255.

11- Cherian, S., Reddy, M., Ferreira, R., 2006. Transgenic plants with improved dehydration-stress tolerance: progress and future prospects. Biologia Plantarum, 50, 481-495.

12- Demiral,  T.,  Türkan,  I.,  2006.  Exogenous  glycinebetaine  affects growth  and  proline  accumulation  and  retards  senescence  in  two  rice cultivars  under  NaCl  stress.  Environmental  and  Experimental  Botany,  56: 72-79.

13- Doğan,  M.,  2013.  Antioxidative  and  proline  potentials  as  a  protective mechanism in soybean plants under salinity stress.

14- Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P., Smith, F., 1956. Colorimetric  method  for  determination  of  sugars  and  related  substances. Analytical Chemistry, 28:350-356.

15- Ehsanpour,  A.A.,  Fatahian,  N.,  2003  Effect  of  salt and proline on Medicago sativa callus. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 73: 53-56.

16- Grieve, C., Grattan, S., 1983. Rapid assay for determination of water soluble quaternary ammonium compounds. Plant and Soil, 70: 303-307.

17- Hayat, S., Hayat, Q., Alyemeni, M.N., Wani, A.S., Pichtel, J., Ahmad, A.,  2012.  Role  of  proline  under  changing  environments:  a  review.  Plant Signaling & Behavior, 7: 1456-1466.

18- Hu, L., Hu, T., Zhang, X., Pang, H., Fu, J., 2012. Exogenous glycine betaine ameliorates the adverse effect of salt stress on perennial ryegrass. Journal of the American Society for Horticultural Science, 137, 38-46.

19- Khan,  M.S.,  Ahmad,  D.,  Khan,  M.A.,  2015.  Utilization  of  genes encoding  osmoprotectants  in  transgenic  plants  for  enhanced  abiotic  stress tolerance. Electronic Journal of Biotechnology, 18: 257-266.

20- Lichtenthaler,  H.K.,  1987.  Chlorophylls  and  carotenoids:  pigments of photosynthetic biomembranes. Methods in Enzymology, 148: 350-382.

21- Mäkelä,  P.,  Peltonen-Sainio,  P.,  Jokinen,  K.,  Pehu,  E.,  Setälä,  H., Hinkkanen,  R.,    Somersalo,  S.,  1996.  Uptake  and  translocation  of foliar-applied glycinebetaine in crop plants. Plant Science, 121: 221-230.

22- Meloni, D.A., Gulotta, M.R., Martínez, C.A., Oliva, M.A., 2004. The effects  of  salt  stress  on  growth,  nitrate  reduction  and  proline  and glycinebetaine  accumulation  in  Prosopis  alba.  Brazilian  Journal  of  Plant Physiology. 46: 39-16

23- Mickelbart,  M.V.,  Chapman,  P.,  Collier-Christian ,L.,  2006. Endogenous  levels  and  exogenous  application  of  glycinebetaine  to grapevines. Scientia Horticulturae, 111: 7-16.

24- Morgan,  J.,  1992.  Osmotic  components  and  properties  associated  with genotypic  differences  in  osmoregulation  in  wheat.  Functional  Plant Biology, 19: 67-76.

25- Neto,  C.O.,  Lobato,  A.,  Costa,  R.,  Maia,  W.,  Filho,  B.S.,  Alves,  G., Brinez,  B.,  Neves,  H.,  Lopes,  M.S.,  Cruz,  F.,  2009. Nitrogen compounds  and  enzyme  activities  in  sorghum  induced  to  water  deficit during three stages. Plant Soil Environ, 55: 238-244.

26- Rajaeian, S., Ehsanpour, A.A., Javadi, M., Shojaee, B., 2017. Ethanolamine  induced modification in glycine betaine and proline metabolism in Nicotiana rustica under salt stress. Biological Plantarum,1-5.

27- Razavizadeh, R., Ehsanpour, A.A., 2009. Effects of salt stress on proline content, expression of delta-1-pyrroline-5-carboxylate  synthetase,  and activities of catalase and ascorbate peroxidase in transgenic tobacco plants. Biological Letters, 46: 9–21

28- Rezaei,  M.A.,  Jokar,  I.,  Ghorbanli,  M.,  Kaviani,  B.,  Kharabian-Masouleh,  A.,  2012. Morpho-physiological  improving  effects  of exogenous glycine betaine on tomato (Lycopersicum esculentum Mill.) cv. PS under drought stress conditions. Plant Omics, 5: 79.

29- Riahi,  M., Ehsanpour,  A.A.,  2013. Responses  of  transgenic  tobacco (Nicotiana  plambaginifolia)  over-expressing  P5CS  gene  underin  vitrosalt stress. Progress in Biological Sciences, 2: 76-84.

30- Sobahan,  M.A.,  Arias,  C.R.,  Okuma,  E.,  Shimoishi,  Y.,  Nakamura,  Y., Hirai,  Y.,  Mori,  I.C.,   Murata,  Y.,  2009.  Exogenous  proline  and glycinebetaine  suppress  apoplastic  flow  to  reduce  Na+  uptake  in  rice seedlings. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 73, 2037-2042.

31- Szabados,  L.,   Savoure,  A.,  2010.  Proline:  a  multifunctional  amino acid. Trends in Plant Science, 15: 89-97.

32- Weretilnyk,  E.A.,  Bednarek,  S.,  McCue,  K.F.,  Rhodes,  D.,  Hanson, A.D.,  1989.  Comparative  biochemical  and  immunological  studies  of  the glycine  betaine  synthesis  pathway  in  diverse  families  of  dicotyledons. Planta, 178: 342-352.

33- Yamada,  M.,  Morishita,  H.,  Urano,  K.,  Shiozaki,  N.,  Yamaguchi-Shinozaki,  K.,  Shinozaki,  K.,   Yoshiba,  Y.,  2005.  Effects  of  free proline  accumulation  in  petunias  under  drought  stress.  Journal  of Experimental Botany, 56: 1975-1981.

34- Yang,  W.-J.,  Rich,  P.J.,  Axtell,  J.D.,  Wood,  K.V.,  Bonham,  C.C.,  Ejeta, G.,  Mickelbart,  M.V.,  Rhodes,  D.,  2003.  Genotypic  variation  for glycinebetaine in sorghum. Crop Science, 43: 162-169.

35- Zhu, B., Su, J., Chang, M., Verma, D.P.S., Fan, Y.-L., Wu, R., 1998. Overexpression  of  a  Δ  1-pyrroline-5-carboxylate  synthetase  gene  and analysis  of  tolerance  to  water-and  salt-stress  in  transgenic  rice.  Plant Science, 139: 41-48.