نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 گروه زیست شناسی دانشگاه پیام نور
2 مدرس گروه کشاورزی دانشگاه پیام نور
چکیده
در این تحقیق، تنوع ژنتیکی 18 اکوتیپ پنیرک (Malva neglecta) تهیه شده از بانک ژن سازمان جنگلها و مراتع مورد ارزیابی قرار گرفت. با استفاده از روش CTAB استخراج DNA صورت گرفت و با 15 نشانگر ISSR تنوع ژنتیکی مورد بررسی قرار گرفت. آغازگرهای ISSR در مجموع توانستند 99 باند تولید کنند که از این تعداد، 2 باند یک شکل مشاهده شد. آغازگرهای IS5 و IS6 بهترتیب با 12 و 11 باند بیشترین تعداد و آغازگرهای UBC807 و UBC867با 4 باند کمترین تعداد باند را نشان دادند. شاخص-های محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI)، نسبت چندگانه موثر (EMR) و شاخص قدرت تفکیک (RP) برای کلیه نشانگرها محاسبه گردید که با توجه به شاخصهای محاسبه شده آغازگرهای IS5 و IS6 به عنوان بهترین آغازگرها جهت بررسی تنوع ژنتیکی پنیرک معرفی گردید. میزان شباهت ژنتیکی مشاهده شده براساس اطلاعات این نشانگرها برابر 69/0 بود. بیشترین تشابه را اکوتیپ 4G با اکوتیپ 9G با ضریب 84/0 داشتند. کمترین تشابه مربوط به اکوتیپ 1G با اکوتیپهای 9G، اکوتیپ 15G با 6G و 8G با ضرایب تشابه 57/0 بود. نتایج حاصل از گروهبندی تجزیه خوشهای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد اکوتیپها را در 3 گروه قرار داد که بر اساس تجزیه به مختصات اصلی (PCo) و تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) گروههای حاصل از تجزیه کلاستر تایید گردید بر طبق این گروهبندی واریانس بین گروهها در سطح 5% معنیدار بود، اما براساس واریانس برآورد شده سهم واریانس بین گروهها تنها 29 درصد از تنوع کل بود.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Genetic variabiliy of Malva neglecta ecotype using ISSR molecular markers
نویسندگان [English]
1 Department of Biology, Payame Noor University, I.R. Iran
2 Department of Agriculture, Payame Noor University, Iran
چکیده [English]
In this research, the genetic diversity of 18 malva (Malva neglecta) from the gene bank of forests and rangelands was evaluated. DNA extraction was performed using CTAB method, and genetic variation was investigated with 15 ISSR markers. All of the ISSR primers showed 99 visible bands in which four bands were similar patterns. The IS5 and IS6 primers had the most number of bands with 12 and 11 bands respectively, while UBC807 and UBC867 with two bands showed the least band numbers. The Polymorphic information content (PIC), marker index (MI), EMR and RP indices were calculated for all primers. With this point of view, IS5 and IS6 were the best primers to identify variability among these Malva. Total genetic similarity based on these primers was 69 percent. The greatest genetic similarity was between G4 with G9 ecotype. The lowest genetic distance was between G1 and G9 ecotype. Cluster analysis based Jakard coefficient by UPGMA was classified all genotype to tree groups and this clustering was confirmed by principal coordinate (PCo) and analysis of molecular variance (AMOVA). Portion of between group variance was just 29 percent of total variance.
کلیدواژهها [English]
بررسی تنوع ژنتیکی اکوتیپهای پنیرک (Malva neglecta) با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR
عبدالمهدی نوریان1* و هومن شیروانی2
ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی
ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی
تاریخ دریافت: 4/11/1396 تاریخ پذیرش: 14/7/1397
چکیده
در این تحقیق، تنوع ژنتیکی 18 اکوتیپ پنیرک (Malva neglecta) تهیه شده از بانک ژن سازمان جنگلها و مراتع مورد ارزیابی قرار گرفت. با استفاده از روش CTAB استخراج DNA صورت گرفت و با 15 نشانگر ISSR تنوع ژنتیکی مورد بررسی قرار گرفت. آغازگرهای ISSR در مجموع توانستند 99 باند تولید کنند که از این تعداد، 2 باند یک شکل مشاهده شد. آغازگرهای IS5 و IS6 بهترتیب با 12 و 11 باند بیشترین تعداد و آغازگرهای UBC807 و UBC867با 4 باند کمترین تعداد باند را نشان دادند. شاخصهای محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI)، نسبت چندگانه موثر (EMR) و شاخص قدرت تفکیک (RP) برای کلیه نشانگرها محاسبه گردید که با توجه به شاخصهای محاسبه شده آغازگرهای IS5 و IS6 به عنوان بهترین آغازگرها جهت بررسی تنوع ژنتیکی پنیرک معرفی گردید. میزان شباهت ژنتیکی مشاهده شده براساس اطلاعات این نشانگرها برابر 69/0 بود. بیشترین تشابه را اکوتیپ 4G با اکوتیپ 9G با ضریب 84/0 داشتند. کمترین تشابه مربوط به اکوتیپ 1G با اکوتیپهای 9G، اکوتیپ 15G با 6G و 8G با ضرایب تشابه 57/0 بود. نتایج حاصل از گروهبندی تجزیه خوشهای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه جاکارد اکوتیپها را در 3 گروه قرار داد که بر اساس تجزیه به مختصات اصلی (PCo) و تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) گروههای حاصل از تجزیه کلاستر تایید گردید بر طبق این گروهبندی واریانس بین گروهها در سطح 5% معنیدار بود، اما براساس واریانس برآورد شده سهم واریانس بین گروهها تنها 29 درصد از تنوع کل بود.
واژه های کلیدی: تنوع ژنتیکی، مارکر مولکولی، پنیرک، ISSR
* نویسنده مسئول، تلفن: 09184630902، پست الکترونیکی: Mehdi_Noorian@yahoo.com
مقدمه
کشت گیاهان دارویی و معطر، از دیرباز از جایگاه ویژهای در نظامهای سنتی کشاورزی ایران برخوردار بوده است و این نظامها از نظر ایجاد تنوع و پایداری، نقش مهمی ایفا میکردهاند. متاسفانه در سالهای اخیر، به دلیل جایگزین شدن گونههای زراعی اصلاح شده دارای عملکرد و ارزش اقتصادی بالا، بسیاری از این گونهها و ارقام بومی و محلی به فراموشی سپرده شده و از سیستمهای زراعی ایران حذف شدهاند. بنابراین بررسی وضعیت تولید گیاهان دارویی و معطر و نقش این گیاهان در ایجاد تنوع در بوم نظامهای زراعی ایران، بسیار مورد اهمیت میباشد (15). پنیرک (Malva) از تیره Malvaceae گیاهی علفی یک ساله، دوساله یا پایا با خواص شناخته شده دارویی است. گونه Malva neglecta گیاهی علفی یکساله و دارای ساقه نیمه خوابیده به طول 40-10 سانتیمتر میباشد (1). گونـههـای مختلـف پنیـرک هماننـد Malva neglecta Wallrدر کشـــورهای مختلف دنیا کشت میگردد یا به طور خودرو رشد میکند (6). خـواص آنتـی اکسیدانی گونههای مختلف پنیرک در نقاط دیگر دنیا توسـط برخـی محققین گزارش شده است (18). پنیرک منبع غنی از ویتامینهای A، B و C بوده و به عنوان یکی از گیاهان داوریی موثر در کاهش عوارض سرماخوردگی به ویژه سرفه، همچنین در التهابهای تنفسی، مجاری ادراری و گوارشی و نیز جوشهای پوستی میباشد. نتایج مطالعات انجام دشه بر روی خواص ضد میکروبی پنیرک حاکی از آن است که این گیاه دارای خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد ویروسی علیه بسیاری از پاتوژنهای انسانی میباشد (19).
به دلیل عوارض فراوان ناشی از استفاده از داروهای شیمیائی مصنوعی، استقبال چشمگیری از داروهای طبیعی با منشاء گیاهی شده است (12). آگاهی دقیق از تنوع ژنتیکی موجود در ژرمپلاسم گیاهی ضمن حفظ ذخائر ژنتیکی گیاهی، قابلیت استفاده از آنها را در برنامههای اصلاحی تعیین میکند. همچنین کسب اطلاع از فاصله ژنتیکی نسبی بین افراد و جمعیتها و روابط خویشاوندی بین آنها، امکان سازماندهی ژرمپلاسم و تهیه جمعیتهای مناسب برای ترسیم نقشهی ژنتیکی و مکانیابی ژنها را فراهم میسازد (25). بیشتر بهنژادگران معتقدند که کمبود تنوع ژنتیکی پیشرفتهای اصلاحی را در آینده مختل میکند (17). ارزیابی تنوع ژنتیکی در گیاهان برای برنامههای اصلاحی و حفاظت از ذخایر توارثی، حیاتی بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی در گونه گیاهی برای انتخاب والدین جهت رسیدن به دو رگ مناسب از اهمیت زیادی بر خوردار است (20). تنوع ژنتیکی میتواند به وسیله تخمین فاصله ژنتیکی با استفاده از اطلاعات شجره یا با استفاده از نشانگرهای مولکولی شناسایی شود (22). به منظور تخمین این تنوع انواع مختلفی از سیستمهای نشانگری توسط بهنژادگران گیاهی استفاده میشود که از جمله آنها میتوان به نشانگرهای ریخت شناختی و مولکولی شامل بیوشیمیائی و DNA اشاره کرد. نشانگرهای DNA امکان شناسایی مستقیم تنوع توالی ژنومی را در بین گیاهان فراهم میکنند که میتواند در تکمیل اطلاعات شجرهنامه مورد استفاده قرار گیرند (21). نشانگر ISSR یک نشانگر مبتنی بر PCR است که میتواند تفاوتهای افراد با خویشاوند را بهسرعت از یکدیگر جدا کند و ثابت شده است که نشانگرهای مولکولی مفیدی در مطالعات انگشت نگاری ژنومی بررسیهای فیلوژنتیکی و نشانگذاری ژن است این تکنیک از یک آغازگر منفرد طراحی شده براساس توالی زیر ماهواره که در '5 یا '3 با 2 تا 4 نوکلئوتید انتخابی قلاب شده است استفاده میکند و برای طراحی آغازگر به اطلاع قبلی از ژنوم نیاز ندارد نشانگر ISSR به علت طول نسبتاً بلندتر آغازگرها و دمای اتصال بالاتر قابل اطمینانتر از RAPD است و میتواند بطور گسترده خصوصا برای ارزیابی ژرم پلاسم گیاهی و تنوع ژنتیکی استفاده شود (26). نشانگرهای ISSR برای آشکارسازی چندشکلی ژنتیکی بین نژادها از طریق تولید تعداد زیادی نشانگر میکروساتلایتی توزیع شده در سراسر ژنوم مفید هستند (5). تحقیقات زیادی در ارتباط با وجود تنوع ژنتیکی در بین گیاهان دارویی با استفاده از نشانگرهای مولکولی خصوصا نشانگر ISSR صورت گرفته است و نتایج حاصل این بررسیها بیانگر کارایی این نشانگر در مطالعه تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی میباشد (8، 9، 14، 26). در کشور ایران تحقیقات انجام شده در زمینه اصلاح گیاهان دارویی به نسبت اهمیتی که این گیاهان در صنایع مختلف دارد، محدود میباشد. بنابراین انجام تحقیقات بیشتر به منظور دستیابی به ارقام اصلاح شده ضروری به نظر میرسد، لذا تحقیق حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتیکی در سطح مولکولی در اکوتیپهای مختلف پنیرک در جهت تلاقی نمونههای با فواصل زیاد ژنتیکی برای دستیابی به هتروزیس و افزایش ترکیبات میتواند مفید باشد، در نهایت میتوان از این اطلاعات نیز جهت حفاظت در محل رویشگاه نمونهها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و ایجاد بانک ژرم پلاسم استفاده نمود.
مواد و روشها
در تحقیق انجام شده بذرهای 18 اکوتیپ از گیاه دارویی پنیرک بهمنظور ارزیابی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR از بانک ژن موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید. مشخصات مواد ژنتیکی مورد مطالعه، با ذکر کد اکوتیپ و محل دریافت یا جمعآوری در جدول 1 نشان داده شده است.
جدول 1- مشخصات اکوتیپهای مورد استفاده در این تحقیق
کد بانک ژن |
شهرستان |
استان |
اکوتیپ |
10534 |
یزد |
یزد |
G1 |
12926 |
گنبد |
گستان |
G2 |
14342 |
نهاوند |
همدان |
G3 |
15504 |
شاهدیه |
یزد |
G4 |
15843 |
تفت |
یزد |
G5 |
15922 |
صدوق |
یزد |
G6 |
20011 |
هریس |
آذربایجان شرقی |
G7 |
21113 |
صدوق |
یزد |
G8 |
21122 |
بافق |
یزد |
G9 |
21601 |
سمنان |
سمنان |
G10 |
22521 |
بندر عباس |
هرمزگان |
G11 |
22900 |
قشم |
هرمزگان |
G12 |
22903 |
میناب |
هرمزگان |
G13 |
26408 |
کرمان |
کرمان |
G14 |
30789 |
دامغان |
سمنان |
G15 |
33487 |
طبس |
یزد |
G16 |
34327 |
دهلران |
ایلام |
G17 |
34338 |
دهلران |
ایلام |
G18 |
استخراج DNA به روش CTAB تغییر یافته (24) برای هر اکوتیپ در آزمایشگاه انجام گرفت. بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل ۸/۰ درصد آگارز و دستگاه اسپکتروفتومتر صورت گرفت. واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، 2 میلیمولار MgCl2، 05/0 میلیمولار از هر dNTP، 2/0 میکرومول آغازگر، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر واکنش به مقدار x1) انجام شد. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد و به مدت ۵ دقیقه و ۳۵ چرخه حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشتسازی به ترتیب ۳۰ ثانیه و ۹۵ درجه سانتیگراد، زمان اتصال آغازگر ۳۰ ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود (52 تا 60 درجه). همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتیگراد بود. توسعه نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد انجام شد. بعد از اتمام واکنش زنجیرهای پلیمراز محصولات واکنش بر روی از ژل آگارز 2 درصد با بافر واکنش TBE یک درصد الکتروفورز شدند. به منظور تزریق نمونه در ژل، ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونهگذاری به DNAهای تکثیر شده اضافه و سپس میزان ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه به درون چاهکهای ایجاد شده در ژل آگارز بارگزاری و با ولتاژ ۱۰۰ و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت و سپس ژل را جهت رنگآمیزی در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرولیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت نمایش باندها استفاده شد.
محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC= Polymorphic information content) از طریق فرمول محاسبه شد، در اینجا p برابر با مجموع باندهای هر لوکوس برای کلیه اکوتیپها است (16). همچنین شاخص نشانگری (MI= Marker Index) از رابطه MI= PIC × N×B بدست آمد که N تعداد کل باندها و β نسبت چندشکلی برای هر آغازگر بود (11). شاخص نسبت چندگانه موثر (EMR= Effective multiplex ratio) از رابطه EMR= NPB × β که از درصد چندشکلی (β) ضربدر تعداد باندهای چندشکل (NPB) بدست آمد (12) و قدرت تفکیک (RP= Resolving power) از رابطه RP=∑IB محاسبه گردید. RP=∑IB در رابطه [(IB=1-[2×(0.5-Pi و Pi نسبت افراد دارای باند است (4). در پایان نیز دادههای حاصل، با استفاده از نرم افزارهای NTSYSpc 2.02e برای محاسبه ماتریس تشابه و آزمون مانتل، DARwin 6 جهت تجزیه کلاستر و تجزیه به مؤلفههای اصلی و GenAlEx 6.2 برای تجزیه واریانس مولکولی مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج
بررسی پلیمورفیسم: با استفاده از 15 آغازگر ISSR تنوع ژنتیکی اکوتیپها مورد بررسی قرار گرفت که آغازگرهای ISSR در مجموع توانستند 99 باند تولید کنند که از این تعداد 2 باند یک شکل مشاهده شد و 97 باند چندشکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 18 اکوتیپ برابر 5/5 بود. آغازگر IS6 بیشترین تعداد باند (تعداد 12 باند) و آغازگرهای UBC807 و UBC867کمترین تعداد باند (تعداد 4 باند) را نشان دادند. اکوتیپ 2G بیشترین باند (65 باند) و اکوتیپ 1G کمترین باند (25 باند) را در بین اکوتیپهای مورد بررسی داشتند. شکل 1 الگوی باندی 18 اکوتیپ مورد بررسی با استفاده از آغازگر IS7 را نشان میدهد.
نتایج بدست آمده برای آغازگرهای استفاده شده در جدول 2 ارائه شده است که با توجه به این جدول، میانگین درصد چند شکلی در بین اکوتیپهای مورد بررسی برابر 12/98 بود، کمترین درصد چند شکلی را آغازگرهای IS11 (5/87%) و IS5 (91/91%) داشتند و دیگر آغازگرها با داشتن 100% چند شکلی دارای بیشترین میزان بودند. میانگین محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) در آغازگرهای مورد بررسی برابر 336/0 بود که بیشترین میزان محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) مربوط به آغازگرهای IS3، UBC807، UBC847 و UBC848 به ترتیب با 453/0، 420/،0 405/0 و 40/0 اختصاص داشت، بنابراین این آغازگرها بهتر از سایر آغازگرها بر اساس شاخص PIC توانستند فاصله ژنتیکی اکوتیپها را مشخص کنند. آغازگر IS10، IS11 و IS5 با کمترین میزان PIC (به ترتیب 318/0، 330/0 و 338/0) توانایی خوبی در جداسازی اکوتیپها نداشتند. در مورد شاخص نشانگر (MI) آغازگرهای IS6 و IS5 به ترتیب بیشترین میزان و آغازگرهایUBC807 و UBC869 دارای کمترین میزان شاخص نشانگر بودند. برای شاخص نسبت چندگانه موثر (EMR) آغازگرهای IS6 و IS5 دارای بیشترین و آغازگرUBC807 کمترین میزان را به خود اختصاص داد. در شاخص تفکیک (RP) نیز ملاحظه شد که آغازگرهای IS5 و IS6 دارای بیشترین میزان و آغازگرهای IS9 و IS14 دارای کمترین میزان بودند. آغازگرهای IS9، IS10، IS11 و IS14 با کمترین میزان توانایی خوبی در جداسازی اکوتیپها نداشتند و دیگر آغازگرها در حد متوسطی بودند.
ماتریس تشابه: تشابه ژنتیکی اکوتیپهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه دایس از 57/0 تا 84/0 متغیر بود (جدول 3)، میانگین تشابه بین اکوتیپها برابر 69/0 بود که بالا بودن تشابه ژنتیکی نشاندهنده تنوعژنتیکی کم در بین اکوتیپهای پنیرک بر اساس آغازگرهای مورد بررسی میباشد. بیشترین تشابه را اکوتیپ 4G با اکوتیپ 9G با ضریب 84/0 داشتند. کمترین تشابه و بیشترین فاصله مربوط به اکوتیپ 1G با اکوتیپهای 9G، اکوتیپ 15G با 6G و 8G با ضرایب تشابه 57/0 بود.
تجزیه خوشهای: تجزیه خوشهای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه دایس برای اکوتیپها در شکل 2 ارائه شده است. همچنانکه ملاحظه میگردد اکوتیپها در سه گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل اکوتیپهای 1G، 2G، 3G، 4G، 7G، 6G و10G بود، که متوسط ضریب تشابه برای این سه اکوتیپ 65/0 بدست آمد. گروه دوم شامل چهار اکوتیپ 5G، 8G، 98G و 18G بود. برای این گروه متوسط ضریب تشابه این گروه 48/0 بود. گروه سوم شامل اکوتیپهای 11G، 12G، 13G، 14G، 15G، 16G و 17G بود که میانگین تشابه برای این گروه 58/0 بود. بنابراین اکوتیپهای گروه اول دارای بیشترین تشابه و اکوتیپهای گروه دوم دارای کمترین تشابه بودند.
|
|
|
|
شکل 1- الگوی باندی 18 اکوتیپ مورد بررسی با استفاده از آغازگر IS7، اولین چاهک از سمت چپ DNA Leader با سایز 100 تا bp 1500 میباشد.
جدول 2- آغازگرهای ISSR مورد استفاده و شاخصهای محاسبه شده
قدرت تفکیک |
نسبت چندگانه موثر |
شاخص نشانگری |
محتوی اطلاعات چند شکلی |
درصد چند شکلی |
تعداد مکانهای چند شکل |
تعداد مکانهای تکثیر شده |
توالی آغازگر |
نام آغازگر |
823/4 |
4 |
813/1 |
453/0 |
100 |
4 |
4 |
5'-AGAGAGAGAGAGAGAGT-3' |
UBC807 |
705/8 |
091/9 |
384/3 |
338/0 |
91/90 |
10 |
11 |
5'- AGAGAGAGAGAGAGAGC-3' |
IS5 |
294/9 |
12 |
551/4 |
379/0 |
100 |
12 |
12 |
5'-ACACACACACACACACC-3' |
IS6 |
529/3 |
5 |
103/2 |
421/0 |
100 |
5 |
5 |
5' GTGTGTGTGTGTGTGTC 3' |
IS7 |
941/2 |
6 |
076/2 |
346/0 |
100 |
6 |
6 |
5'- CTCTCTCTCTCTCTCTG-3' |
IS9 |
647/5 |
7 |
228/2 |
318/0 |
100 |
7 |
7 |
5'- GAGAGAGAGAGAGAGARc-3' |
IS10 |
411/7 |
125/6 |
313/2 |
330/0 |
5/87 |
7 |
8 |
5'-ACACACACACACACACC-3' |
IS11 |
529/3 |
6 |
435/2 |
406/0 |
100 |
6 |
6 |
5'-AGAGAGAGAGAGAGAGCC-3' |
UBC847 |
529/5 |
5 |
937/1 |
388/0 |
100 |
5 |
5 |
5'-CCGCCGCCGCCGCCGCCG-3' |
UBC856 |
588/2 |
5 |
840/1 |
368/0 |
100 |
5 |
5 |
5'- GACAGACAGACAGACA-3' |
IS14 |
4 |
6 |
048/2 |
341/0 |
100 |
6 |
6 |
5'- GGATGGATGGATGGAT-3' |
IS15 |
882/3 |
7 |
726/2 |
390/0 |
100 |
7 |
7 |
5'-DBDACACACACACACACA-3' |
IS16 |
35/5 |
8 |
62/2 |
33/0 |
100 |
8 |
8 |
5'-ACACACACACACACACYG-3' |
UBC857 |
36/3 |
5 |
2 |
40/0 |
100 |
5 |
5 |
5'-CACACACACACACAARG-3' |
UBC848 |
78/4 |
4 |
42/1 |
36/0 |
100 |
4 |
4 |
5'-GTTGTTGTTGTTGTTGTT-3' |
UBC869 |
55/5 |
34/6 |
44/1 |
36/0 |
12/98 |
46/6 |
6/6 |
میانگین |
|
Y=(C,T), V=(A,C,G), D=(A,G,T), B=(C,G,T)
جدول 3- ماتریس تشابه ژنوتیپها برای پرایمرهای SCoT استفاده شده بر اساس ضریب دایس
اکوتیپ |
G1 |
G2 |
G3 |
G4 |
G5 |
G6 |
G7 |
G8 |
G9 |
G10 |
G11 |
G12 |
G13 |
G14 |
G15 |
G16 |
G17 |
G18 |
G1 |
1 |
|||||||||||||||||
G2 |
73/0 |
1 |
||||||||||||||||
G3 |
75/0 |
79/0 |
1 |
|||||||||||||||
G4 |
78/0 |
86/0 |
68/0 |
1 |
||||||||||||||
G5 |
70/0 |
75/0 |
60/0 |
79/0 |
1 |
|||||||||||||
G6 |
68/0 |
67/0 |
78/0 |
68/0 |
63/0 |
1 |
||||||||||||
G7 |
70/0 |
68/0 |
73/0 |
67/0 |
59/0 |
73/0 |
1 |
|||||||||||
G8 |
65/0 |
70/0 |
71/0 |
65/0 |
73/0 |
71/0 |
67/0 |
1 |
||||||||||
G9 |
57/0 |
68/0 |
67/0 |
63/0 |
68/0 |
67/0 |
71/0 |
70/0 |
1 |
|||||||||
G10 |
78/0 |
79/0 |
71/0 |
84/0 |
70/0 |
75/0 |
70/0 |
65/0 |
60/0 |
1 |
||||||||
G11 |
68/0 |
79/0 |
65/0 |
75/0 |
67/0 |
65/0 |
63/0 |
68/0 |
60/0 |
75/0 |
1 |
|||||||
G12 |
70/0 |
78/0 |
73/0 |
76/0 |
75/0 |
73/0 |
68/0 |
70/0 |
65/0 |
76/0 |
76/0 |
1 |
||||||
G13 |
65/0 |
70/0 |
62/0 |
75/0 |
67/0 |
65/0 |
60/0 |
68/0 |
67/0 |
68/0 |
71/0 |
76/0 |
1 |
|||||
G14 |
62/0 |
73/0 |
62/0 |
71/0 |
70/0 |
62/0 |
67/0 |
62/0 |
63/0 |
75/0 |
68/0 |
70/0 |
75/0 |
1 |
||||
G15 |
63/0 |
71/0 |
70/0 |
67/0 |
59/0 |
57/0 |
68/0 |
57/0 |
59/0 |
70/0 |
70/0 |
68/0 |
67/0 |
70/0 |
1 |
|||
G16 |
65/0 |
70/0 |
71/0 |
71/0 |
67/0 |
71/0 |
63/0 |
62/0 |
67/0 |
75/0 |
78/0 |
79/0 |
75/0 |
71/0 |
79/0 |
1 |
||
G17 |
67/0 |
73/0 |
68/0 |
78/0 |
63/0 |
68/0 |
60/0 |
59/0 |
63/0 |
75/0 |
78/0 |
70/0 |
75/0 |
71/0 |
70/0 |
81/0 |
1 |
|
G18 |
67/0 |
75/0 |
63/0 |
79/0 |
75/0 |
67/0 |
68/0 |
76/0 |
68/0 |
76/0 |
76/0 |
68/0 |
70/0 |
67/0 |
71/0 |
70/0 |
70/0 |
1 |
شکل 2- نمودار حاصل تجزیه از خوشهای دادههای نشانگر ISSR برای اکوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از ضریب دایس و روش UPGMA، اعداد روی نمودار (Node) بیانگر شباهت و نزدیکی اکوتیپها میباشد
تجزیه به مختصات اصلی (PCo): بر اساس دادههای حاصل از آغازگرهای مورد بررسی تجزیه به مختصات اصلی برای اکوتیپها انجام شد، که نتایج نشان داد محور مختصات اول و دوم به ترتیب 51/24 و 27/19 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند و در مجموع 78/43 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید. بر اساس مختصات اول و دوم دیاگرام پراکنشی اکوتیپها رسم گردید (شکل 3)، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشهای تا حدودی مطابقت داشت و اکوتیپها به سه گروه تقسیم شدند.
تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA): تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروهبندی تجزیه خوشهای انجام شد (جدول 5)، که اکوتیپها در داخل 3 گروه قرار گرفتند بر اساس آماره PhiPT در بین گروهها در سطح 5% اختلاف معنیدار وجود داشت به عبارت دیگر گروهبندی به صورت صحیح انجام گرفته است. نتایج بدست آمده نشان داد که در میان گروهها تنوع بیشتر از بین گروهها میباشد. بر این اساس تنوع در درون گروهها برابر 71% و در بین گروهها تنوع برابر 29% مشاهده گردید.
شکل 3- بای پلات اکوتیپها برای نشانگر ISSR بر اساس محور مختصات اصلی اول و دوم
جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس نشانگر ISSR
PhiPT |
درصد از واریانس |
واریانس برآورد شده |
میانگین مربعات |
مجموع مربعات |
درجه آزادی |
منابع تغییر S.O.V |
|
Var% |
Est. Var. |
MS |
SS |
Df |
|||
29/0* |
29% |
002/5 |
90/32 |
70/98 |
2 |
بین گروه |
|
|
71% |
109/12 |
10/12 |
42/157 |
15 |
درون گروه |
|
|
100% |
111/17 |
|
12/266 |
17 |
کل |
|
** اختلاف در سطح 1% معنیدار |
|||||||
بحث و نتیجه گیری
در مطالعات بسیاری گزارش شده که نشانگر ISSR به دلیل خصوصیاتی نظیر تکرار پذیری بالا، عدم نیاز به دانستن توالی برای یافتن آغازگر و عدم نیاز به دانستن اطلاعات اولیه در مورد توالی ژنوم یکی از گزینههای مناسب به منظور بررسی تنوع ژنتیکی میباشد (13 و 27). در این تحقیق نیز مشخص شد که با استفاده از این نشانگر میتوان در زمان کم، الگوی ژنتیکی را مشخص ساخت. بر اساس نتایج همانطور که مشاهده گردید تنوع قابل ملاحظهای در بین اکوتیپهای پنیرک وجود داشت و چند شکلی مطلوبی بر اساس نشانگر ISSR مشاهده شد. در بررسی Celka و همکاران (7) با استفاده از نشانگرهای مولکولی ISSR و ISJ که بر روی 24 گونه مختلف پنیرک صورت گرفت، کارایی نشانگر مولکولی ISSR بالا گزارش گردید به نحوی که در این بررسی گونهها کاملا از یکدیگر تفکیک شدند. همچنین Domblides و همکاران (8) تنوع ژنتیکی 32 نمونه گیاه جعفری (متعلق به خانواده چتریان) را با استفاده از 6 آغازگر ISSR بررسی کردند و به طور متوسط 2/10 باند پلیمورف مشاهده کردند. آنها نشان دادند این نشانگر از کارایی بالایی برای بررسی تنوع ژنتیکی این گیاه برخوردار است.
محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC)، یکی از شاخصهای مهم جهت مقایسه نشانگرهای مختلف، از نظر قدرت تمایز آنها به شمار میرود. مقادیر بالای این معیار، دلالت بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه نشانگری دارد که در تفکیک و تمایز افراد نقش به سزایی دارد. بنابراین، نشانگرهایی با محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) بالا برای تمایز ژنوتیپهای خویشاوندی نزدیک مفید هستند (19) همچنین بهترین شاخص برای انتخاب آغازگر مناسب، شاخص قدرت تفکیک (RP) میباشد، زیرا هم از تعداد افراد دارای باند و هم تعداد آلل تاثیرپذیری دارد (4). در حالت کلی و بر اساس شاخصهای محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) و شاخص قدرت تفکیک (RP) مناسبترین آغازگرها برای بررسیهای گونه پنیرک، آغازگرهای UBC807، IS5، IS6، IS7 و IS12 تعیین شد، و پیشنهاد میگردد برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم دیگر اکوتیپهای پنیرک در تحقیقات بعدی استفاده گردند. Ma yanming و همکاران (14) در مطالعهای جهت بررسی تنوع ژنتیکی 24 تودهی زیره سبز از 38 آغازگر ISSR استفاده کردند که در این میان 12 آغازگر تولید قطعات چندشکل نمودند. میزان چندشکلی در این تحقیق برابر با 33/0 بود و بر اساس شاخص PIC بهترین آغازگرها را معرفی نمودند. در این مطالعه میانگین تشابه بین اکوتیپها برابر 69/0 بود که بالا بودن تشابه ژنتیکی نشاندهنده تنوعژنتیکی کم در بین اکوتیپهای پنیرک بر اساس آغازگرهای مورد بررسی میباشد. داروین (DARwin) نرم افزاری برای آنالیز تنوع ژنتیکی و فیلوژنتیکی است. این نرم افزار بیشتر روی توصیف ساختار تنوع بر مبنای روشهای مبتنی بر فاصله تأکید دارد. در این برنامه تعدادی Node وجود دارد که به ترتیب شباهت و نزدیکی اکوتیپها را نشان میدهد. Hammad (10) در بررسی تنوع ژنتیکی برخی جمعیت های پنیرک بااستفاده از نشانگر مولکولی ISSR و آیزوزایم ها بر اساس اطلاعات حاصل از این نشانگرها اقدام به گروه بندی جمعیت های مورد مطالعه با استفاده از ضریب دایس و روش UPGMA نمودند. بر اساس تجزیه خوشهای اکوتیپها در سه گروه قرار گرفتند، که پراکنش اکوتیپها بر اساس تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تطابق نداشت. که ممکن است علت این موضوع جدایی منشاء جغرافیایی ژنوتیپها یا ایجاد و تجمع جهشهای ژنتیکی مجزا در سطح ژنوم باشد که باعث ایجاد تنوع در آنها نسبت به یکدیگر شده است. در حالی که در تعداد دیگری از ژنوتیپها چنین تطابقی دیده نشده که این امر میتواند به دلیل منشاء مشترک، مهاجرت و انتقال باشد. نتایج حاصل از تجزیه خوشهای با دیاگرام حاصل از پراکنش اکوتیپها بر اساس مقدار مختصات اول و دوم حاصل از تجزیه به مختصات اصلی مطابقت نشان داد. در نهایت بر اساس تجزیه واریانس مولکولی گروههای حاصل از تجزیه خوشهای مشاهده شد. Celka و همکاران (7) در بررسی روابط ژنتیکی میان 24 گونه مختلف پنیرک با استفاده از نشانگرهای مولکولی ISSR و ISJ ، از تجزیه واریانس مولکولی به منظور بررسی سهم تنوع در درون و بین گونه ها استفاده نمودند. همچنین Gajera و همکاران (9) تنوع ژنتیکی 20 ژنوتیپ گونه گیاهی در معرض خطر Mangifera indica را با استفاده از 21 آغازگر ISSR بررسی کردند و با استفاده از داده های مولکولی اقدام به گروهبندی ژنوتیپها نمودند. طبق بررسی های انجام شده ، تنوع ژنتیکی بین اکوتیپهای پنیرک مورد مطالعه وجود داشت و از آنجا که این اکوتیپهای نماینده توده های پنیرک موجود در بانک ژن می باشند لذا در بین کل اکوتیپهای موجود در بانک ژن نیز تنوع قابل ملاحظه ای وجود دارد. بنابراین این مطلب را که در اکثر مطالعات مربوط به ارزشیابی تنوع درون گونه ای، تنوعی اندک بین اکوتیپهای یافتهاند و یا گاهی هیچگونه تنوعی وجود نداشته است، نمی توان به عنوان یک پیش فرض برای هرگونه در نظر گرفت. در مجموع در این مطالعه و بر اساس آغازگرهای مورد استفاده و همچنین با توجه به ماتریس تشابه، تجزیه کلاستر و تجزیه به مختصات اصلی کمترین تشابه و بیشترین فاصله مربوط به اکوتیپ 1G (مربوط به یزد) با اکوتیپهای 12G (مربوط به هرمزگان) بود که پیشنهاد میگردد از این اکوتیپها که حداکثر فاصله ژنتیکی بر اساس نشانگرهای مورد استفاده را داشتند در جهت استفاده از حداکثر هتروزیس در برنامههای اصلاحی استفاده شود. همچنین با توجه به تنوع ژنتیکی پایین درون ژنوتیپهای پنیرک کشور که از بانک ژن جنگلها و مراتع کشور تهیه شده بود، حفاظت در محل رویشگاه نمونهها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و ایجاد بانک ژرم پلاسم و استفاده از روشهای تکثیر مناسب این گیاه توصیه میشود. فرشادفر و همکاران (2، 3) در بررسیهای خود بر روی گیاهان دارویی رازیانه و مریم نخودی نتایج مشابهی را گزارش نمودند.
سپاسگزاری
این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه پیام نور انجام شده است. که از این بابت از مسئولان مربوطه تشکر و قدردانی میشـود. در ضمن کلیه حقوق مادی و معنوی آن متعلق به دانشگاه پیـام نـور میباشد.