نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 هیات علمی دانشگاه آزاد اسلامی

2 هیات علمی دانشگاه شهید بهشتی

3 دانشجوی دانشگاه شهید بهشتی

چکیده

گیاه نرگس Narcissus tazetta L. از خانواده لیلیاسه، گیاهی است که علی‌رغم تقاضای زیاد در بازار، تکثیر رویشی بسیار کندی دارد. به منظور تکثیر سریع، در این مطالعه ریزازدیادی گیاه نرگس از طریق کشت بافت تحت تاثیر هورمون های متفاوت و انتقال به خاک گیاهچه‌ها بررسی گردید. ریزازدیادی این گیاه در سه مرحله القا اندام‌های هوایی، تکثیر آنها و تولید پیاز و ریشه از قطعات جدا‌کشت صورت گرفت. نتایج نشان داد بهترین محیط برای القا اندام‌های هوایی محیطMS تغییریافته دارای 4 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 12/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA است و در‌صورت انتقال اندام‌های هوایی القا شده به محیط MS دارای 2 میلی‌گرم بر لیتر BAP و 12/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA بیشترین تکثیر حاصل شد. با انتقال این اندام‌ها به محیط کشت MS دارای 9% ساکارز و 1/0 میلی‌گرم بر لیتر NAA حداکثر تعداد پیازها به دست آمد که پس از گذشت 4 ماه قطر آنها به mm 20-12 رسید. ریشه‌های تولید شده در قاعده پیاز‌ها، در این محیط نسبت به محیط دیگر (محیط فاقد هورمون)، کوتاه و ضخیم‌تر بودند. گیاهان پیاز‌دار حاصل با سالیسیلیک‌اسید تیمار و به خاک منتقل شدند و در خاک تحت تاثیر قارچ‌کش کاربندازیم قرار گرفتند. کاربندازیم موجب افزایش درصد زنده‌مانی گیاهان (100%) شد ولی سالیسیلیک‌اسید تاثیری بر روی موفقیت انتقال به خاک نداشت. تعداد بالای پیاز‌های به دست آمده و درصد بالای بقای گیاهان باززایی شده در خاک نشان می‌دهد ریزازدیادی یک روش مناسب جایگزین برای کشت سنتی است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Micropropagation of Narcissus tazetta L. treated with different hormones and transfer of plantlets to the soil

نویسندگان [English]

  • Seyedeh Homeira Soleimani 1
  • Francoise Bernard 2
  • Somayyeh Fazeli Nejad 3

1 Professor assistant of Islamic Azad University

2 Associate Professor of Shahid Beheshti University

3 student of Shahid Beheshti University

چکیده [English]

Narcissus tazetta L. of the Liliaceae family, despite the high demand market has very slow vegetative propagation. For the rapid propagation, in this study micropropagation of Narcissus under different hormones and soil transfer of plantlets was investigated. Micropropagation of this plant was done in three procedures: induction, proliferation and bulb production from explants. It was found that the best medium for shoot induction is modified‌MS+ 4 mg l-1 BAP +0.12 mg l-1 NAA and shoot clumps which were cultured on the MS+2 mg l-1 BAP +0.12 mg l-1 NAA medium, showed the most proliferation. Transferring these shoot clumps to MS+ 9% sucrose + 0.1 mg l-1 NAA medium resulted in maximum bulbs production. After 4 months, the bulbs were 12–20 mm in diameter. In this medium, roots were thicker and shorter than the ones grown without NAA. The bulbous plants treated with salicylic acid and transferred to soil and then treated with Carbendazim fungicide. Carbendazim increased survival percent (100%) but salicylic acid did not have any effect on success of transferring to soil. The high number of bulbs and high percentage of survival of regenerated plants in soil indicated that micropropagation is an effective alternative method compare to traditional method.

کلیدواژه‌ها [English]

  • "Narcissus tazetta"
  • " Micropropagation"
  • "Bulb production"
  • "Hormones"

ریزازدیادی گیاه نرگس (Narcissus tazetta L.) تحت تیمار­های هورمونی متفاوت و انتقال به خاک گیاهچه­ها

سیده حمیرا سلیمانی1*، فرانسواز برنارد2 و سمیه فاضلی نژاد2

1ایران،شهرقدس،دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرقدس، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

2 ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی

تاریخ دریافت: 30/6/95                تاریخ پذیرش: 13/9/96

چکیده

گیاه نرگس Narcissus tazetta L. از خانواده لیلیاسه، گیاهی است که علی­رغم تقاضای زیاد در بازار، تکثیر رویشی بسیار کندی دارد. به منظور تکثیر سریع، در این مطالعه ریزازدیادی گیاه نرگس از طریق کشت بافت تحت تاثیر هورمون های متفاوت و انتقال به خاک گیاهچه­ها بررسی گردید. ریزازدیادی این گیاه در سه مرحله القا اندام­های هوایی، تکثیر آنها و تولید پیاز و ریشه از قطعات جدا­کشت صورت گرفت. نتایج نشان داد بهترین محیط برای القا اندام­های هوایی محیطMS  تغییریافته دارای 4 میلی­گرم بر لیتر BAP و 12/0 میلی­گرم بر لیتر NAA است و در­صورت انتقال اندام­های هوایی القا شده به محیط MS دارای 2 میلی­گرم بر لیتر BAP و 12/0 میلی­گرم بر لیتر NAA بیشترین تکثیر حاصل شد. با انتقال این اندام­ها به محیط کشت MS دارای 9% ساکارز و 1/0 میلی­گرم بر لیتر NAA حداکثر تعداد پیازها به دست آمد که پس از گذشت 4 ماه قطر آنها به mm 20-12 رسید. ریشه­های تولید شده در قاعده پیاز­ها، در این محیط نسبت به محیط دیگر (محیط فاقد هورمون)، کوتاه و ضخیم­تر بودند. گیاهان پیاز­دار حاصل با سالیسیلیک­اسید تیمار و به خاک منتقل شدند و در خاک تحت تاثیر قارچ­کش کاربندازیم  قرار گرفتند. کاربندازیم موجب افزایش درصد زنده­مانی گیاهان (100%) شد ولی سالیسیلیک­اسید تاثیری بر روی موفقیت انتقال به خاک نداشت.  تعداد بالای پیاز­های به دست آمده و درصد بالای بقای گیاهان باززایی شده در خاک نشان می­دهد ریزازدیادی یک روش مناسب جایگزین برای کشت سنتی است.

واژه های کلیدی: گیاه نرگس، ریزازدیادی، تولید پیاز، هورمون­ها، انتقال به خاک

* نویسنده مسئول، تلفن: 02144536481 ، پست الکترونیکی: moho_plant@qodsiau.ac.ir

مقدمه

 

گیاه نرگس با نام علمی Narcissus tazetta L.  از خانواده لیلیاسه گیاهی زینتی و معطر است که بلحاظ دارا بودن خواص دارویی بسیار مورد توجه می­باشد. گیاه نرگس ضداسپاسم، مخدر، مسهل، ضد سرطان و دارای فعالیت anti-HIV- 1 است. ویژگی دیگر گیاه نرگس آلکالوئیدهای متعددی است که از آن استخراج می­شود (4، 8، 13). ریزازدیادی (Micropropagation) از کاربردهای مهم کشت بافت است. در ریزازدیادی اندام خاصی از گیاه جدا و بعنوان قطعه جدا کشت  در محیط کشت قرار داده می‍شود. بر روی این قطعات جدا کشت به­کمک نسبت بین هورمون­های اکسین و سیتوکینین اندام خاصی القا می­شود. ایجاد گیاهان عاری از ویروس، تولید گیاهان هاپلوئید، هیبریداسیون بوسیله ادغام پروتوپلاست­ها، انتقال DNA، ایجاد موتاسیون و تولید متابولیت­های ثانویه به­کمک این روش صورت می­گیرد (24). ریزازدیادی روشی سریع، ساده، آسان و اقتصادی برای تکثیر گیاهان پیازدار است (6، 18، 19) و بخاطر مزیت­هایی که دارد بعنوان یک روش متداول جهت تکثیر رویشی، توجه بسیاری را جلب نموده است (16، 26). گیاه نرگس یکی از گیاهان پیاز­دار زینتی مهم است که علاقه مردم جهان به آن سبب تقاضای زیاد و برداشت کنترل نشده این گیاه می­شود (18). تکثیر رویشی نرگس با سرعت متوسط سالیانه تولید 6/1 پیاز دختر به ازای یک پیاز مادر بسیار کند صورت می­گیرد. بنابراین از طریق تکثیر رویشی، پیازهای برداشت شده در هر سال جبران نمی­شود (15) و این در حالی است که با استفاده از روش ریزازدیادی، از یک پیاز نرگس طی 4 تا 5 سال 1200 پیاز حاصل می­گردد (19). از سویی، مطالعات صورت گرفته نشان می­دهد که بسیاری از ارقام تجاری نرگس بوسیله ویروس آلوده می­شوند که موجب کاهش 30 درصدی محصول پیاز آن می­شود (5). بنابراین جهت تکثیر سریع و تولید گیاهان عاری از ویروس، کشت گیاه نرگس در شرایط  in vitroبسیار مورد توجه می باشد.

تاکنون مطالعه ای در ایران بر روی ریزازدیادی گیاه نرگس صورت نگرفته است. هدف این پژوهش بهینه سازی شرایط ریزازدیادی این گیاه و تولید تعداد پیاز­های بیشتر است. در کشت in vitro گیاهان پیاز­دار، تشکیل پیاز سودمند است زیرا دیگر نیازی به مرحله سازگاری نیست و همچنین پیاز­های حاصل به سادگی قابل جابه­جایی بوده، می توان آنها را مدت طولانی در یخچال ذخیره نمود و این پیازها عاری از ویروس و سایر بیماری­ها می­باشند (11). از اینرو بمنظور تهیه تعداد پیاز­های بیشتر در شرایط in vitro، از آنجا که تشکیل پیاز در قاعده اندام هوایی صورت می­گیرد، ابتدا ضروری است که شرایط کشت مناسب برای تکثیر اندام هوایی فراهم شود. بنابراین در این مطالعه تاثیر محیط­های کشت و هورمون­های متفاوت بر روی القا، تکثیر اندام­های هوایی، تکثیر پیاز­ها و تولید ریشه بررسی می­شود. مرحله انتقال به خاک یک مرحله اساسی در ریزازدیادی است. گیاهچه­ها برای سازگاری به شرایط خارج از شیشه به پیش تیمارهایی نیاز دارند (16، 18). از اینرو اثر پیش­تیمار سالیسیلیک­اسید و تیمار قارچ­کش بر موفقیت انتقال به خاک و بقای گیاهچه­های باززایی شده بررسی می­گردد.

مواد و روشها

تهیه قطعه جداکشت: پیاز­های گیاه Narcissus tazetta در مرحله قبل از گلدهی از روستای ضیابر از توابع بندر انزلی جمع­آوری شدند و بعنوان منبع قطعه جدا­کشت مورد استفاده قرار گرفتند. ضد عفونی پیازها با کمک اتانول 80 % (v/v) و هیپوکلریت سدیم 2% صورت گرفت. قطعات جدا­کشت به صورت دو فلسی­هایی به ابعاد تقریبی یک سانتی­متر مربع متصل به 2-1 میلی­متر کپه تهیه گردید.

محیط کشت القاء (Induction medium) اندام هوایی: جهت القا شاخه، شش محیط کشت مختلف شامل دو نوع محیط پایه MS (Murashig & Skoog) و MS  تغییر­یافته (modified Murashig & Skoog) و ترکیبات هورمونی متفاوت مورد استفاده قرار گرفت (جدول1). اختلاف دو محیط پایه در جدول 2 آمده است. لازم به ذکر است سایر ترکیبات محیط MS تغییر­یافته مشابه محیط  MSاست. pH محیط­ها روی 6 تنظیم شد و پس از افزودن آگار (6 گرم بر لیتر) در اتوکلاو استریل شدند. بر روی محیط­های کشت در هر شیشه 5 قطعه جدا­کشت از ناحیه کپه قرار گرفت. پس از 6 هفته اندام­های هوایی به محیط­های جدید با همان ترکیب­های قبلی واکشت شدند و پس از 12 هفته، تعداد و ارتفاع شاخه­ها محاسبه گردید.

جدول 1- ترکیبات محیط­های القاء شاخه (I). mMS: MS تغییر­یافته

محیط القاء

محیط پایه

هورمون­ (میلی­گرم بر لیتر)

 

NAA

BAP

I1

I2

I3

I4

I5

I6

MS

MS

MS

mMS

mMS

mMS

1

12/0

12/0

1

12/0

12/0

2

2

4

2

2

4

جدول 2- ترکیبات پایه محیط­های MS و mMS (MS تغییریافته)

ترکیبات

مقادیر  (میلی­گرم بر لیتر)

 

mMS

MS

KH2PO4

NaH2PO4

Nicotinic acid

Pyridoxine-HCl

Thiamine-HCl

vitamine-free Caseinehydrolysate

-

300

5

1

5/0

1000

170

-

5/0

5/0

1/0

-

محیط کشت تکثیر (Proliferation medium): جهت افزایش تعداد اندام­های هوایی القاء شده درمرحله قبل، محیط­های تکثیر P2 (محیطMS  دارای 2 میلی­گرم بر لیترBAP و 12/0 میلی­گرم بر لیترNAA ) و  P5(محیطMS  تغییریافته دارای 2 میلی­گرم بر لیترBAP و 12/0 میلی­گرم بر لیتر NAA) تهیه شد و دسته اندام­های هوایی پس از تقسیم به قطعاتی شامل دو اندام هوایی و ارتفاع 2 سانتی­متر در این محیط­ها قرار گرفتند و هر 6 هفته یکبار واکشت ­شدند. 6 هفته پس از انتقال، تعداد و ارتفاع آنها محاسبه گردید.

محیط تولید پیاز (Bulb Production medium): دسته اندام­های هوایی که در قاعده برگ­های آنها پیاز­های کوچکی بود، کوتاه و به محیط­های تولید پیاز B1 ( MS دارای 9% ساکارز و 7 گرم بر لیتر آگار) و B2 ( MS دارای 9% ساکارز ، 1/0 میلی­گرم بر لیتر NAA و 7 گرم بر لیتر آگار) منتقل شدند. پس از 70 روز تعداد و قطر پیاز­ها و تعداد و ارتفاع ریشه­ها محاسبه گردید.

تمام کشت­ها درون اتاق رشد با دمای C°25، دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 2200 لوکس شدت روشنایی قرار گرفتند.

انتقال به خاک: جهت انتقال به خاک ابتدا پیاز­ها از محیط کشت خارج و با آب مقطر شسته شدند. بمنظور بقای بیشتر، پیاز­ها قبل از انتقال به خاک بمدت یک ساعت در غلظت 200 میکرومولار سالیسیلیک­اسید و پس از انتقال به خاک تحت تیمار قارچ­کش کاربندازیم (Carbendazim) قرار گرفتند. گیاهان در خاکی مخلوط از خاک باغچه، ماسه، کود چای و قارچ با نسبت (5 به 1) با پرلیت درون گلدان­های پلاستیکی قرار گرفتند. گلدان­ها ابتدا جهت حفظ رطوبت با درپوش پلاستیکی پوشیده و با فاصله دو روز یک بار آبیاری شدند. پس از یک ماه درپوش برداشته شد و گلدان­ها بمدت یک ماه در اتاق رشد با 16 ساعت روشنایی و دمای C°25 قرار گرفتند.

آزمایشات به صورت طرح کاملا تصادفی و با 4 تکرار (البته بخش انتقال به خاک با 16 تکرار) انجام شد. نتایج با استفاده از نرم افزار SPSS-11 مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. داده­ها با استفاده از ANOVA  آنالیز و گروه­بندی میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح آماری 5 % انجام شد.

نتایج

مرحله القاء: سه هفته پس از انتقال قطعات جدا­کشت به محیط­های کشت القاء، تمام دو­فلسی­ها دچار تورم قابل ملاحظه ای شدند و یک ماه بعد، از بین دو­­فلس در محیط های کشت I2 و I5 اندام­های هوایی خارج گردید. در سایر محیط­ها اندام­های هوایی بر روی قطعات جدا­کشت بسیار کمتر بود و با تاخیر تشکیل شد. پس از دوازده هفته تعداد اندام­های هوایی حاصل بر روی یک قطعه جدا­کشت در محیط­های مختلف محاسبه گردید ( نمودار 1 سمت راست). آنالیز داده­ها مشخص نمود تاثیر نوع محیط پایه MS) یا MS تغییریافته (، مقدار هورمون BAP (2 یا 4 میلی گرم بر لیتر) و همچنین بر هم­کنش آنها بر تعداد اندام­های هوایی معنی­دار است. در محیط کشت MS تغییر­یافته نسبت به MS و همچنین در غلظت 4 میلی گرم بر لیتر هورمون BAP نسبت به غلظت 2 میلی گرم بر لیتر، اندام­های هوایی بیشتری بر روی قطعات جدا­کشت ایجاد شد. اثر هورمون NAA بر روی تعداد اندام­های هوایی معنی­دار نبود. در تصویر 1 اندام­های هوایی القاء شده در محیط­های کشت مشاهده می­گردد. نتایج نشان داد که نوع محیط پایه MS) تغییریافته یا (MS و مقادیر تنظیم­کننده­های رشد BAP و NAA  بر ارتفاع اندام­های هوایی نیز به طور معنی­داری اثر می­گذارد (نمودار 1 سمت چپ).

مرحله تکثیر: با توجه به اینکه گیاهک­های حاصل شده بر روی قطعات جدا­کشت در محیط­های القاء I2 و I5 فرم طبیعی و بهتری داشتند، از این دو محیط بعنوان محیط­های تکثیر استفاده گردید و این دو محیط بترتیب P2 و P5 نامیده شدند. محاسبه تعداد اندام­های هوایی نشان داد که نوع محیط تکثیر اثری در تعداد اندام­های هوایی نداشت. در حالی­که برهم­کنش نوع محیط القاء و محیط تکثیر بر تعداد اندام­های هوایی موثر بود (نمودار 2 سمت راست). بیشترین تکثیر زمانی صورت گرفت که اندام­های هوایی از محیط I6 شامل  MSتغییر­یافته، 4 میلی­گرم بر لیتر BAP و 12/0 میلی­گرم بر لیتر NAA به محیط P2 منتقل شدند (تصویر 2). نوع محیط القاء و همچنین برهم­کنش محیط القاء و محیط تکثیر، اثر قابل توجهی بر طول اندام­های هوایی داشت (نمودار 2 سمت چپ).

 

F

E

D

B

C

A

تصویر1- القا اندام­های هوایی در محیط­های  MS :A    با NAA + BAP (1+ 2)میلی­گرم بر لیتر       MS :Bبا NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر   MS :C    با NAA + BAP (12/0+ 4) میلی­گرم بر لیتر    MS :D     تغییر­یافته با NAA + BAP (1+ 2) میلی­گرم بر لیتر    MS :E   تغییر­یافته با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر    MS :F  تغییر­یافته با NAA + BAP (12/0+ 4) میلی­گرم بر لیتر

 

نمودار 1- تاثیر محیط­های کشت القاء بر  سمت راست:  تعداد  و  سمت چپ: طول  اندام­های هوایی القاء شده بر روی قطعات جدا­کشت پیاز گیاه نرگس پس از 12 هفته (n=4)  MS :I1    با NAA + BAP (1+ 2)میلی­گرم بر لیتر    MS :I2با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر MS :I3 با NAA + BAP (12/0+ 4) میلی­گرم بر لیتر   MS :I4تغییر­یافته با NAA + BAP (1+ 2) میلی­گرم بر لیتر  MS :I5 تغییر­یافته با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر   MS :I6تغییر­یافته با NAA + BAP (12/0+ 4) میلی­گرم بر لیتر

C

B

A

      

تصویر2- تکثیر اندام­های هوایی در محیط تکثیر MS با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر انتقال­یافته از محیط­های القای

 MS :Aبا NAA + BAP (1+ 2) میلی­گرم بر لیتر MS: B  تغییر­یافته با NAA + BAP (1+ 2) میلی­گرم بر لیتر 

 MS :C تغییر­یافته با NAA + BAP (12/0+ 4) میلی­گرم بر لیتر

 

نمودار 2- تاثیر محیط­های کشت القا (I) و تکثیر(P) بر   سمت راست: تعداد  و  سمت چپ : طول اندام­های هوایی ایجاد شده گیاه نرگس 6 هفته پس از انتقال به محیط تکثیر  MS :I1    با NAA + BAP (1+ 2)میلی­گرم بر لیتر    MS :I2با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر    MS :I3با NAA + BAP (12/0+ 4) میلی­گرم بر لیتر    MS :I4  تغییر­یافته با NAA + BAP (1+ 2) میلی­گرم بر لیتر    MS :I5 تغییر­یافته با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر   MS :I6    تغییر­یافته با NAA + BAP (12/0+ 4) میلی­گرم بر لیتر


مرحله تشکیل پیاز: وقتی دسته اندام­های هوایی بمدت 10 هفته بر روی محیط­های تکثیر P2 و P5 قرار گرفتند، در قاعده برگ­ها پیازهای بسیار کوچک ظاهر شد. در محیط P2، 5/62 درصد برگ­ها و در محیط P5، 56 درصد برگ­ها دارای پیاز شدند. با توجه به اثر سوکروز در نمو پیاز­ها (18) دسته­های برگی با تعداد معین پیاز به محیط­های B1 و B2 انتقال یافتند. نوع محیط تشکیل پیاز (B1 و B2) و نوع محیط تکثیری که اندام­های هوایی از آنجا منتقل شده است تاثیریبر تعداد پیاز­ها نداشت. اما برهم­کنش آن­ها در تعداد پیاز­ها اثری معنی­دار داشت. به طوری که بیشترین تعداد پیاز­ها زمانی حاصل شد که اندام­های هوایی از محیط  P2به محیط B2 با ترکیب MS) شامل 1/0 میلی­گرم بر لیتر NAA و 9% ساکارز) انتقال یافت (P<0.05) ( نمودار 3 سمت چپ و تصویر 3). نوع محیط تکثیری که اندام­های هوایی از آنها به محیط­های تشکیل پیاز منتقل شده­اند و نوع محیط تشکیل پیاز و بر­هم­کنش آن­ها، اثری در قطر پیاز­ها نداشت. هفتاد روز پس از انتقال به محیط تولید پیاز،  قطر تمام پیاز­ها بین 5/9- 5/6 میلی­متر و بلحاظ ظاهری مشابه پیاز­های طبیعی گیاه نرگس بود (نمودار 3 راست). کشت مجدد بر روی محیطی تازه با همان ترکیب قبلی بمدت هفتاد روز، سبب افزایش اندازه پیاز­ها شد به طوری که قطر آنها به 20-12 میلی­متر رسید. همچنین پیاز­های کوچک (bulblets) در کنار این پیاز­ها تشکیل شد که در تصویر 3 مشخص است.


B

A

          

تصویر 3- A: پیاز­ها در محیط تشکیل پیاز دارای 1/0 میلی­گرم بر لیتر NAA    B: تشکیل  bulbletدر کنار پیازها (فلش­ها نشان می­دهند)

 

نمودار3-  تاثیر محیط­های تکثیر (P) و تشکیل پیاز (B) بر  سمت راست: قطر  و  سمت چپ: تعداد  پیاز­های ایجاد شده در قاعده برگ­های ریزازدیادی شده گیاه نرگس  هفتاد روز پس از انتقال   MS :P2با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر  MS :P5 تغییر­یافته با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر: B1  MS بدون هورمون : B2  MS دارای 1/0 میلی­گرم بر لیتر NAA


تشکیل ریشه­ها: قرار گرفتن پیاز­ها بمدت هفتاد روز در محیط تشکیل پیاز، موجب تشکیل ریشه در قاعده پیاز­ها شد. این ریشه­ها همان­گونه که در تصویر 4 مشخص است قطور و طویل بودند. آنالیز داده­ها نشان داد که بر­هم­کنش نوع محیط تشکیل پیاز و نوع محیط تکثیر به طور معنی­داری در تعداد ریشه ها تاثیر داشت. به­طوری­که با انتقال پیاز­ها از محیط P5 به محیط B1 بیشترین تعداد ریشه ایجاد شد( P< 0.001) ( نمودار 4 سمت راست). همچنین نوع محیط تشکیل پیاز اثری معنی­دار بر طول ریشه­ها داشت در­حالی­که نوع محیط تکثیر بر طول ریشه­ها تاثیری نداشت. ریشه­هایی که در قاعده پیاز­های کشت شده در محیط B2 تشکیل شد کوتاه و ضخیم­تر بودند. بیشترین طول ریشه، در محیط B1  حاصل شد، خواه این پیازها از محیط­های تکثیر P2 یا P5 به آن منتقل شده بودند (نمودار 4 سمت چپ  و تصویر 4).

انتقال به خاک: تصویر 5 گیاهان انتقال­یافته به خاک را نشان می­دهد. درصد زنده­مانی گیاهان انتقال­یافته به خاک پس از یک، دو و سه ماه محاسبه شد. نتایج نشان داد که تیمار سالیسیلیک اسید تاثیری در موفقیت انتقال به خاک ندارد. اما تیمار کاربندازیم به­طور معنی­داری باعث افزایش درصد زنده­مانی گیاهان نسبت به شاهد می­شود (P<0.05). تحت تاثیر این قارچ­کش طی سه ماه صد در­صد گیاهان زنده می­مانند(جدول3).

بحث

مطابق نتایج حاصل از این پژوهش مشخص شد که در Narcissus tazetta  القا اندام­های هوایی به مقادیر هورمون NAA وابسته نبوده ولی مقادیر هورمون BAP در القا مؤثر است. به طوری که در حضور مقادیر بالاتر هورمون) 4 میلی­گرم بر لیتر BAP ( اندام­های هوایی بیشتری القا می‍گردد که با نتایج Santos و همکاران (18) کاملاً تطابق دارد.

جدول 3- درصد زنده­مانی گیاهان ریزازدیادی شده نرگس پس از انتقال به خاک تحت پیش تیمار سالیسیلیک اسید و تیمار کاربندازیم

تیمار

ماه اول

ماه دوم

ماه سوم

شاهد

سالیسیلیک­اسید

کاربندازیم

75

75/68

100

75

5/62

100

5/87

25/56

100

 

 

B

A

               

تصویر4 – تولید ریشه در محیط­های تشکیل پیاز  A: MS بدون NAA  B: MS دارای 1/0 میلی­گرم بر لیتر NAA

 

نمودار4- تاثیر محیط­های تکثیر(P) و تشکیل پیاز(B)  بر  سمت راست : تعداد   و  سمت چپ : طول ریشه­های تولید شده در قاعده پیازهای ریزازدیادی شده گیاه نرگس هفتاد روز پس از انتقال    MS :P2با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر    MS :P5 تغییر­یافته با NAA + BAP (12/0+ 2) میلی­گرم بر لیتر: B1     MS بدون هورمون : B2     MS دارای 1/0 میلی­گرم بر لیتر NAA

 

B

A A

             

D

E

C

    

تصویر 5- گیاهان نرگس انتقال­یافته به خاک     A:  بمنظور حفظ رطوبت با درپوش پوشیده شده­اند        B: پس از برداشتن درپوش

C: پیاز­های شاهد پس از یک­ماه   D: پیاز­های تحت تیمار کاربنداریم پس از یک­ماه   E: پیاز­های تحت پیش تیمار سالیسیلیک­اسید پس از یک­ماه


آنها گزارش نمودند که مقدار اکسین تأثیری بر القا اندام­هوایی N. bulbocodium ندارد ولی نوع اکسین مهم است. در گیاه Crinum نیزBAP  در القاء اندام هوایی مؤثر بوده ولی NAA اثر بازدارنده دارد و بیشترین تعداد شاخه در حضور 5 میلی ­گرم بر لیتر هورمون  BAPو فقدان NAA حاصل می­گردد (23). همچنین بلندی و همکاران (1) نشان دادند که بیشترین تعداد شاخه در ریزازدیادی  پایه رویشی  GF677در تیمار 5/0 و 1 میلی­گرم بر لیتر BAP و بدون حضور NAA تولید می­شود.

نتایج حاضر نشان داد بر خلاف تعداد اندام­های هوایی القاء شده، طول آنها تحت تأثیر هر دو هورمون سیتوکینین و اکسین قرار می­گیرد. به­طوری­که با افزایش مقادیر BAP و NAA طول برگ­ها کاهش می­یابد. این نتایج با یافته­های Torres & Carlis (22) همخوانی دارد. بررسی­های آنها مشخص نمود که تعداد اندام­های هوایی القا شده در گیاه Camellia sasanqua فقط تحت تأثیر سیتوکنین قرار می­گیرد در­حالی­که افزایش طول آنها وابسته به هر دو هورمون اکسین و سیتوکینین می­باشد. در گیاه Myrica نیز در غلظت های کمتر کینتین طول اندام­های هوایی افزایش می یابد ولی بطور قابل­توجهی تعداد آنها کاسته می­شود (7). یاری و همکاران (2) نیز در مطالعه بر روی رقم Vendetta گل سرخ یافتند کاربرد 4/4 میکرومولار BA همراه با 27/0 میکرومولار  NAA بیشترین طول شاخه را ایجاد می­کند. مطالعه گیاهان جهش­یافته تنباکو ‌و آرابیدوپسیس که بترتیب مقادیر کم و زیاد سیتوکینین را بیان می کنند، مشخص نمود که سیتوکینین­ها تشکیل مریستم­های شاخه­ای را القا می­کنند و باعث ایجاد سلول­های برگی بیشتری می­شوند. این در­حالی است که این هورمون موجب کاهش اندازه آنها می­گردد.  Wernerو همکاران (25) نتیجه گرفتند که سیتوکینین از طریق تغییر سرعت تقسیم سلولی و رشد سلول­ها در نواحی مریستمی اثرات خود را اعمال می­کند (17، 25).

به نظر می رسد عامل دیگری که بر تعداد و طول اندام­های هوایی القا شده موثر است، نوع محیط پایه می­باشد. برخی گونه­ها پاسخ مشابهی به تمام محیط­ها می­دهند و سایر گونه­ها محیط خاصی را جهت رشد و تکثیر قطعات جدا­کشت ترجیح می­دهند. نتایج پژوهش حاضر نیز مشخص نمود که در محیط  MSتغییر­یافته نسبت به محیط MS تعداد بیشتری اندام هوایی القا می­شود ولی طول آنها کوتاه­تر می­باشد. یکی از اختلافات دو محیط این است که در محیط MSتغییر­یافته، KH2PO4  جایگزین NaH2PO4 شده است. افزودن KH2PO4 به محیط، سبب رشد رویشی بهتر می­شود (11). Haque و همکاران (11) عنوان نمودند که افزودن 750 میلی­گرم بر لیتر ترکیب  KH2PO4به محیط کشت گیاه سیر، موجب افزایش تعداد شاخه و ریشه می‍شود ولی طویل شدن اندام­های هوایی را ممانعت نموده و وزن تر آنها را کاهش می­دهد که با نتایج مطالعه حاضر در مورد گیاه N. tazetta کاملاً مطابقت دارد. یکی دیگر از اختلافات دو محیط این است که در محیط  MSتغییر­یافته کازئین هیدرولیزات افزوده شده است. گاهی عصاره­های گیاهی و عصاره مخمر بعنوان مکمل به محیط کشت افزوده می­شوند از جمله آنها می توان به کازئین هیدرولیزات اشاره نمود که اثرات محرک مشابه شیره نارگیل دارد (9). Ahmad و Anis (3) مشاهده نمودند افزودن کازئین هیدرولیزات به محیط کشت گیاه Cucumis sativus موجب افزایش تعداد اندام­های هوایی می­شود. اثرات کازئین هیدرولیزات به علت دارا بودن نیتروژن آلی (مخلوطی از آمینواسیدها) می­باشد (21). این نتایج با پژوهش حاضر همخوانی دارد.

در مطالعه حاضر اثر NAA بر تولید پیاز گیاه نرگس مورد بررسی قرار گرفت و مشخص شد که این هورمون  بر تعداد و قطر پیاز­ها تأثیری ندارد که با نتایج  Santos‌و همکاران (18) همخوانی دارد. این در­حالی است که در گونه jonquilla  N.و در گیاه سیر در حضور NAA تعداد و قطر پیاز­ها افزایش می­یابد (10، 14). بنابراین تأثیر این هورمون بستگی به گونه گیاهی دارد.

نتایج این پژوهش نشان داد وجود هورمون NAA تأثیری بر تعداد ریشه ندارد که این نتایج با یافته­های Nagakubo و همکاران(14) مطابقت دارد. این محققین بیان  کردند در گیاه Allium sativum  هم در حضور هورمون NAA و هم در فقدان آن ریشه دهی در قاعده پیاز­ها می­تواند صورت پذیرد. Chow و همکاران (10) با مطالعه بر روی دو رقم گیاه   N. jonquilla یافتند که پاسخ آنها به هورمون NAA متفاوت است. به­طوری­که در رقم Hawera بیشترین تعداد ریشه در محیط MS  فاقد NAA و در رقم St.Kaverne در محیط MS دارای 1/0 میلی­گرم بر لیتر هورمون NAA حاصل می­گردد. اما نتایج پژوهش حاضر نشان داد که NAA بر طول ریشه به طور معنی­داری مؤثر می­باشد. به­طوری­که در حضور NAA ریشه­ها ضخیم، قطور و کوتاه­تر می­شوند و در غیاب این هورمون ریشه­ها طویل و نازک­تر می­باشند. این نتایج با مشاهدات Santose و همکاران (18) در مورد گیاه N. bulbocodium کاملا مطابقت دارد. کمترین وزن پیاز برای انتقال به خاک 25/0 گرم است که در این تحقیق رعایت شد (20). در صورتی که انتقال به خاک موفقیت­آمیز باشد، افزایش طول، تعداد، سطح و ضخامت برگ­ها، افزایش رشد ساقه­ها و ریشه­ها حاصل می­شود (12) که در پژوهش حاضر نیز مشاهده گردید. در این مطالعه استفاده از تیمار قارچ­کش باعث موفقیت بیشتر انتقال به خاک می­شود که با نتایج Santose و همکاران (18) همخوانی دارد. آنها گزارش نمودند که در صورت تیمار با قارچ­کش درصد زنده­مانی گیاهانN. bulbocodium   95% می­باشد.

نتیجه­گیری

هدف این پژوهش تکثیر سریع و تولید تعداد بیشتر پیاز­های گیاه نرگس به­کمک کشت بافت در مدت زمان کوتاه بود که نتایج نشان داد بهترین محیط برای القای اندام­های هوایی بر روی قطعات جدا­کشت محیط MS تغییر­یافته دارای 4 میلی­گرم بر لیترBAP  و 12/0 میلی­گرم بر لیترNAA  است که با انتقال این اندام­ها به محیط MS  دارای 2میلی­گرم بر لیتر BAP و 12/0 میلی­گرم بر لیترNAA  بیشترین تعداد اندام­های هوایی حاصل می­شود. سپس برای تولید بیشترین تعداد پیاز، اندام­های هوایی باید در محیط MS شامل 1/0 میلی­گرم بر لیترNAA  و 9% ساکارز قرار گیرند. با این روش در مدت 7 ماه تعداد قابل­توجهی پیاز از یک پیاز مادر می­توان به دست آورد که این گیاهان باززایی­شده پس از انتقال به خاک در صورت تیمار با قارچ­کش صد در­صد بقا خواهند داشت. بنابراین روش حاضر می­تواند برای این گیاه دارویی مهم بعنوان روشی سریع و اقتصادی استفاده شود.

1- بلندی الف ر.، حمیدی ح.، رضاقلی ع الف. 1395.تأثیر محیط کشت و هورمون بر تکثیر پایه رویشی  GF677 در کشت درون شیشه ای. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). جلد 29 ، شماره 1، 14-1.

2-  یاری ف.، موسوی الف.، مستوفی ی.، سیدی س. م.، زمانی ذ.، لایمر م. 1392. اثر تنظیم کننده های رشد گیاهی و نوع کلات آهن بر پرآوری و ریشه زایی درون شیشه ای سه رقم گل سرخ شاخه بریده.(Rosa hybrida L.) مجله زیست شناسی ایران. جلد 26 ، شماره 1، 110-99.

 

3- Ahmad, N.; Anis, M.; 2005; In vitro Mass Propagation of Cucumis sativus L. from Nodal Segments; Turk. J. Bot., 29, 237-240.

4- Arrigoni, O.; De Gara, L.; Pacilla, C.; 1997; Lycorine: a powerful inhibitor of L- galactono - - Lantone dehydrogenase activity; J. Plant Physiol., 150, 362-364.

5- Asjes, C.J.; 1996; Control Situation of Virus diseases in Narcissus in the Netherlands, Acta Hort., 432, 166-74.

6- Bergonon, S.; Codina, C.; Bastida , J. ; 1992 ; The shake liquid culture as an alternative way to the multiplication of Narcissus plants; Acta Hort., 325 , 447-51.

7- Bhatt, I. D.; Dhart, U.; 2004; Factors controlling micropropagation of Myrica esculenta buch. – Ham. Ex D. Don: a high value wild edible of Kumaun Himalaya; African J. of Biotechnology, 3, 534 - 40.

8- Bi, Y.R.; Yung, K.M.; Wong, Y.S.; 1998; Physiological effects of narciclasine from the mucilage of Narcissus tazetta L. bulbs; Plant Sci., 135, 103-108.

9- Butenko, R.G.; 1968; In: Plant Tissue Culture and Plant Morphogenesis, Jeruslem, 40-45.

10- Chow, Y.N.; Selby, C.; Harvey, B.M.R.; 1992; Stimulation by sucrose of Narcissus bulbil formation in vitro; J. Hort. Scri. ; 67, 289-93.

11- Haque, M. SH.; Wada, T.; Hattori, K.; 2003; Effect of sucrose, mannitol and KH2PO4 on proliferation of root tip derived shoots and subsequent bulblet formation in Garlic; Asian J. Plant Sci., 2, 903-908.

12- Kadleček, P.; Tichá, I.; Čapková, V.; Schäfer, C.; 1998; Acclimatization of micropropagated tobacco plantlets. - In: Garab, G. (ed.): Photosynthesis: Mechanisms and Effects. Vol. V. PP. 3853-3856. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht - Boston –London.

13- Lopez, S.; Armand-ugon, M.; Bastida, J.; 2003; Anti-human immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) activity of Lectins from Narcissus species; Planta Med., 69, 109-12.

14- Nagakubo, T.; Takaichi, M.; Oeda, K.; 1997: Micropropagation of Allium sativum L. (Garlic), In: Bajaj, Y.P.S (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 39, Springer–Verlag Berlin, 1-19.

15- Rees, A.R.; 1969; The initiation and growth of Narcissus bulbs; Ann. Bot., 33, 277-88.

16- Rukiye, T.; 2003; Rooting and acclimatization of  in vitro micropropagated snowdrop (Galanthus ikariae baker.) bulblets; akdeniz üniversitesi ziraat fakültesi dergisi; 16(2),121-126.

17- Rupp, H. M.; Frank, M.; Werner, T.; Strnad, M.; Schmülling, T.; 1999; Increased     steady state mRNA levels of the STM and KNAT1 homeobox genes in cytokinin overproducing Arabidopsis thaliana indicate a role for cytokinins in the shoot apical    meristem; The Plant J.,18(5), 557-63.

18- Santos , J.; Santos , I.; Salema , R.; 1998; In vitro production of bulbs of Narcissus     bulbocodium flowering in the first season of growth; Scientica Horticulture, 76, 205-17.

19- Squires, W.M.; Langton, F.A.; 1990; Potential and limitation of Narcissus micropropagation: an experimental evaluation; Acta Hort., 266, 67-77.

20- Steinitz, B.; Yahel, H.; 1982; In vitro propagation of Narcissus tazetta; Hort. Sci., 17, 333-4.

21- Straus, J.; 1960; Maize endosperm tissue grown in vitro: Development of a synthetic   medium; Am. J. Bot., 47, 641- 46.

22- Torres, K. C.; Carlisi, J. A.; 1989; Shoot and root organogenesis of Camellia sasanqua; Plant Cell Rep., 5, 381-384.21.

23- Ulrich, M. R.; Davies, F. T.; Koh, Y. Ch.; Duray, Sh. A.; Egilla, J.N.; 1999; Micropropagation of Crinum 'Ellen Bosanquet' by tri-scales; Scientia Horticulturae, 82, 95-102.

24- Vasil, I.K.; 1984; Cell culture and Somatic cell genetics of plants, Vol (2), Academic press, INC.

25- Werner, T.; Motyka, V.; Strnad, M.; Schmülling, T.; 2001; Regulation of plant growth by cytokinin; Proc. Natl. Acad. Sci., 28, 98(18), 10487-92.

26- Wickremesinhe, E.R.M.; Holcomb, E.J.; Arteca, R.N.; 1994; A practical method for the production of flowering easter lilies from callus cultures; Sci. Hort., 60, 143-52 .