نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه شاهد

چکیده

سدابی جنوبی (Haplophyllum tuberculatum (Forssk.) A. Juss.) گیاهی چند ساله از تیره مرکبات (Rutaceae) است که در منابع طب سنتی به عنوان گیاه دارویی ارزشمندی شناخته می-شود. در این پژوهش ضمن بررسی محتوای فنل، فلاوونوئید و آلکالوئید کل عصاره متانولی برگ، ساقه و ریشه گیاه سدابی جنوبی جمع‌آوری شده از استان هرمزگان، این عصاره‌های متانولی توسط حلال‌هایی با قطبیت متفاوت شامل دی‌اتیل‌اتر، کلروفرم، بوتانول و آب بخش‌سازی شد و اثر سمیت سلولی این بخش‌ها بر رده‌های سلولی RAJI (سلول سرطانی لنفوئیدی انسانی) و A549 (سلول سرطانی اپی‌تلیال ریه انسان) و سلول‌های لنفوسیت سالم خون انسان مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد بیشترین محتوای ترکیبات فنلی در ساقه و بیشترین محتوای فلاوونوئیدها و آلکالوئیدها در برگ این گیاه تجمع می‌یابد. عصاره‌ دی‌اتیل‌اتری هر سه اندام گیاه، IC50 کمتر از 200 میکروگرم بر میلی‌لیتر نسبت به رده سلول سرطانی A549 نشان دادند و در مجموع اثر سمیت سلولی بر رده سلولی A549 بطور معنی‌داری نسبت به رده سلولی RAJI بیشتر بود. عصاره‌ها نسبت به سلول‌های سالم خون سمیت سلولی نشان ندادند. به نظر می‌رسد ترکیبات این گیاه ضمن عدم آسیب به سلول‌های سالم، بر رده‌های مختلف سلول سرطانی تاثیر اختصاصی دارند. این نتایج می-تواند پتانسیل مناسبی برای استفاده از ترکیبات خالص شده این گیاه در صنعت داروسازی فراهم -آورد. لازم به ذکر است که بررسی‌های انجام شده در این پژوهش برای اولین بار بر روی سدابی جنوبی ایران صورت پذیرفته است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Cytotoxic evaluations of metanolic extract fractions from Haplophyllum tuberculatum against RAJI and A549 cancerous cell lines

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Dastranj
  • Farah Karimi
  • Nosrat Rahmani

Shahed University

چکیده [English]

Haplophyllum tuberculatum (Forssk.) A. Juss., is a perennial plant from Rutaceae which is a valuable folk medicinal plant. The leaves, stem and root samples of shadow dried plants gathered from Hormozgan province-IRAN, were extracted with methanol and total phenolics, Flavonoids and alkaloids contents were determined by spectrophotometer. Then the methanolic extract was fractionated by Di-ethyl-ether, Chloroform, Butanol, and Water respectively. The cytotoxic effects of fractionated extracts were evaluated against RAJI and A549 cancerous cell lines and intact blood lymphocyte cells by MTT assay. Results showed that the most phenolics were accumulated in stems and the most alkaloids and flavonoids contents were observed in the plant leaves. Di-ethyl-ether extract from all three plant organs had moderate cytotoxic effect (IC50 < 200 µg/mL) against A549 cell line. Overall cytotoxic effects against A549 were more than RAJI cell line. None of the extracts had cytotoxicity against intact blood lymphocyte cells. It seems that the plant chemicals while have no cytotoxic effects on intact cells, have specific effects on different cancerous cell lines. The results suggest that the purified chemicals of the plant may be benefit for pharmaceutical uses. The present study is the first report on evaluation of cytotoxic activities of fractions with different polarities obtained from methanolic extract of Iranian H. tuberculatum species against A549 and RAJI cell lines.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cytotoxic effect
  • Haplophyllum tuberculatum
  • Methanolic Extract

ارزیابی سمیت سلولی اجزای بخش­سازی شده عصاره متانولی گیاه سدابی جنوبی (Haplophyllum tuberculatum ) بر رده­های سلول سرطانی RAJI و A549

فاطمه دسترنج، فرح کریمی* و نصرت رحمانی

تهران، دانشگاه شاهد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی

تاریخ دریافت: 22/11/96              تاریخ پذیرش: 16/1/97 

چکیده

سدابی جنوبی (Haplophyllum tuberculatum (Forssk.) A. Juss.) گیاهی چند ساله از تیره مرکبات (Rutaceae) است که در منابع طب سنتی به عنوان گیاه دارویی ارزشمندی شناخته می­شود. در این پژوهش ضمن بررسی محتوای فنل، فلاونوئید و آلکالوئید کل عصاره متانولی برگ، ساقه و ریشه گیاه سدابی جنوبی جمع­آوری شده از استان هرمزگان، این عصاره­های متانولی توسط حلال­هایی با قطبیت متفاوت شامل  دی­اتیل­اتر، کلروفرم، بوتانول و آب بخش­سازی شد و اثر سمیت سلولی این بخش­ها بر رده­های سلولی RAJI (سلول سرطانی لنفوئیدی انسانی) و A549 (سلول سرطانی اپی­تلیال ریه انسان) و سلول­های لنفوسیت سالم خون انسان مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد بیشترین محتوای ترکیبات فنلی در ساقه و بیشترین محتوای فلاونوئیدها و آلکالوئیدها در برگ این گیاه تجمع می­یابد. عصاره­ دی­اتیل­اتری هر سه اندام گیاه، IC50 کمتر از 200 میکروگرم بر میلی­لیتر نسبت به رده سلول سرطانی A549 نشان دادند و در مجموع اثر سمیت سلولی بر رده سلولی A549 بطور معنی­داری نسبت به رده سلولی RAJI بیشتر بود. عصاره­ها نسبت به سلول­های سالم خون سمیت سلولی نشان ندادند. به نظر می­رسد ترکیبات این گیاه ضمن عدم آسیب به سلول­های سالم، بر رده­های مختلف سلول سرطانی تاثیر اختصاصی دارند. این نتایج می­تواند پتانسیل مناسبی برای استفاده از ترکیبات خالص شده این گیاه در صنعت داروسازی فراهم ­آورد. لازم به ذکر است که بررسی­های انجام شده در این پژوهش برای اولین بار بر روی سدابی جنوبی ایران صورت پذیرفته است.

واژه­های کلیدی: سمیت سلولی، سدابی جنوبی، عصاره متانولی

* نویسنده مسئول، تلفن: 02151212144 ، پست الکترونیکی: fkarimi@shahed.ac.ir

مقدمه

 

سرطان بیماری بسیار شایعی است و سالانه عامل مرگ میلیون­ها نفر در سرتاسر جهان می­باشد. با وجود پیشرفت های حاصل در روش­های جراحی و رادیوتراپی، هنوز هم شیمی­درمانی، یکی از روش­های اساسی در درمان سرطان­های شایع به شمار می­رود ولی کارایی شیمی­درمانی به دلیل مقاومت سلول­ها به دارو به مرور زمان کاهش می­یابد. برای غلبه بر مقاومت شیمیایی سلول­ها به داروهای پادسرطان نیاز به یافتن ترکیبات پادسرطانی جدید وجود دارد و در این راستا بررسی ترکیباتی با منشاء طبیعی بسیار ارزشمند خواهد بود (15). مطالعات زیادی در دنیا در رابطه با آثار سمیت سلولی عصاره­های گیاهی برای یافتن داروهای پادسرطان جدید صورت گرفته است (7، 9، 11، 15، 18، 19، 21، 26، 33). اخیرا در ایران نیز همچون سایر کشورها توجه بیشتری به یافتن تاثیرات سمیت سلولی عصاره­ها و مشتقات گیاهی نشان داده می­شود. از آن جمله، میمندی و یعقوبی تاثیر عصاره­های آبی و اتانلی گل محمدی را بر سلول­های سرطانی معده انسان مورد آزمایش قرار داده و القای مرگ برنامه ریزی شده را در این سلول­ها مشاهده نموده­اند (2) و القای آپوپتوز در یک رده سلول سرطانی مثانه انسان نیز با استفاده از پودوفیلوتوکسین که لیگنانی با منشاء گیاهی است توسط صادقی و همکاران مشاهده شده است (1).

سدابی (Haplophyllum) یکی از  جنس­های تیره مرکبات با 70 گونه در مناطق مختلف جهان است (3). در ایران 30 گونه از این جنس به صورت خودرو در مناطق گوناگون رویش دارند و از این میان 14 گونه انحصاری کشور ما قلمداد می­شوند (4). گونه­های سدابی در آسیای مرکزی انتشار فراوان داشته و از مدیترانه تا شرق سیبری، در مناطق مختلف آب و هوایی می­رویند. ترکیه، ایران و آسیای مرکزی مناطقی با بیشترین پراکنش این گیاهان معرفی شده­اند (16، 31). گونه­های این جنس بطور معمول از گذشته­های دور در مناطق رویش مورد استفاده دارویی قرار ­گرفته و در قدیمی­ترین منابع علمی، از گونه­های سدابی برای درمان بیماری­های مختلف نام برده شده است. نام سدابی جنوبی در طب سنتی مصر برای درمان تهوع، یبوست، مالاریا، روماتیسم مفاصل، بیماری های زنان و درد معده ذکر شده است (13).

تجزیه و تحلیل فیتوشیمیایی گونه­ سدابی جنوبی وجود لیگنان­ها، کومارین­ها، فلاونوئیدها  و  آلکالوئیدها را در این گیاه نشان داده است (29، 30، 34). اسانس این گیاه نیز مورد بررسی قرار گرفته و ترکیباتی نظیر  β-phellandrene (23.3%)، limonene (12.6%)، (Z)-β-ocimene (12.3%) ،β-caryophyllene (11.6%) ،myrcene (11.3%)  و  α-phellandrene (10.9%) در آن شناسایی شده­اند (6، 37).

پیش از این مطالعه­ای در کشور لیبی در مورد اثر سمیت سلولی اسانس این گیاه بر رده­های سلول سرطانی ریه (H-1299) و کبد (HEPG2) انسان صورت گرفته است (27). در سال 2007 نیز Varamini و همکارانش اثر عصاره اتانلی چند گونه هاپلوفیوم از جمله سدابی جنوبی را بر رده­های مختلف سلول سرطانی بررسی کرده و به نتایج قابل توجهی در این مورد رسیده­اند (35). گیاه سدابی جنوبی خواص داروشناختی متعددی داشته و ملکول­های زیست­فعال شناخته شده در این گیاه قادرند نقش مهمی در سلامت انسان ایفا کنند. این گیاه توزیع و پراکنش وسیعی در زیستگاه­های مختلف داشته و در صحراهای شنی و انواع مختلفی از خاک­ها و بخصوص رسوبات سیلتی (silt deposits) می­روید و با توجه به اینکه شرایط سال­های کم باران و خشک را نیز به خوبی تحمل کرده و تا ارتفاع 1300 متر از سطح دریا نیز رویش دارد، به عنوان علف هرز اغلب مزارع در تابستان شناخته می­شود (24). این گیاه در ایران نیز پراکنشی وسیع داشته و رویش آن در استان­های خوزستان، هرمزگان، کرمانشاه، لرستان، بختیاری، فارس، کرمان، سیستان، بلوچستان، مرکزی و گلستان گزارش شده است (4، 25). با در نظر گرفتن تنوع اقلیمی زیستگاه­های مختلف گیاه سدابی جنوبی و تاثیر شرایط اقلیمی بر محتوا و ترکیب متابولیت­های ثانوی گیاهی، بررسی و مطالعه این گونه در ایران نیز می­تواند نتایج ارزشمندی در بر داشته باشد. با توجه به اهمیت دارویی این گیاه و مطالعات مختلفی که بر روی ترکیبات متشکله آن صورت گرفته، در این پژوهش به بررسی اثر سمیت سلولی اجزای بخش­سازی شده با حلال­هایی با قطبیت افزاینده حاصل از عصاره متانلی شامل عصاره­های دی­اتیل­اتری، کلروفرمی، بوتانلی و آبی به­دست آمده از اندام­های برگ، ساقه و ریشه این گیاه بر رده­های سلولی RAJI (سلول سرطانی لنفوئیدی انسانی) و A549 (سلول سرطانی اپی­تلیال ریه انسان) پرداخته شد. لازم به ذکر است که قبلا مطالعه­ای بر روی آثار سمیت سلولی عصاره­های مورد بررسی در این پژوهش، بر روی رده­های سلولی سرطانی مورد مطالعه (A549 و RAJI) صورت نگرفته است. با این هدف ابتدا عصاره متانولی از نظر محتوای آلکالوئیدها، ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی کل مورد بررسی قرار گرفت و پس از بخش­سازی عصاره متانولی در حلال­های مورد نظر (دی­اتیل­اتر، کلروفرم، بوتانول و آب)، آثار سمیت سلولی بخش­ها بر روی دو رده سلول سرطانی انسانی مطالعه شد. به منظور مقایسه آثار سمیت سلولی عصاره­ها بر رده­های سلول سرطانی با سلول­های سالم انسان، اثر سمیت سلولی عصاره­ها بر لنفوسیت­های سالم جدا شده از خون انسان نیز بررسی شد.

مواد و روشها

مواد گیاهی: اندام هوایی و ریشه گیاه سدابی جنوبی (Haplophyllum tuberculatum) از بندرعباس، کوه گنو، ارتفاع 1120 متر با مشخصات جغرافیایی 27˚ 24' N و  56˚ 11' E جمع­آوری و پس از تمیز کردن در دمای اتاق خشک شد. نمونه­ها تا زمان انجام بررسی­های مورد نظر در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. 

استخراج آلکالوئیدها و سنجش آلکالوئید کل: یک گرم از بافت مورد بررسی (برگ، ساقه، ریشه) در 50 میلی­لیتر متانول سائیده شد و در طول شب در دمای اتاق روی شیکر با سرعت 45 دور در دقیقه قرار گرفت. پس از حذف بقایای بافت گیاهی توسط کاغذ صافی، اتانول توسط دستگاه تقطیر در خلاء تبخیر شد. سپس با افزودن سولفوریک­اسید V/V)) %5 و دی­اتیل­اتر به نسبت مساوی، فاز آبی حاوی آلکالوئید جدا شد و شستشو با دی­اتیل­اتر تا بی­رنگ شدن ادامه یافت. با افزودن هیدروکسید سدیم 10 نرمال pH محلول تا حدود 10 افزایش یافت. سپس محلول به دکانتور انتقال داده شد و 110 میلی­لیتر کلروفرم در سه مرحله (30+40+40) اضافه شد. هر بار فاز کلروفرمی حاوی آلکالوئید جمع و به یکدیگر اضافه شد. در نهایت کلروفرم توسط دستگاه تقطیر در خلاء تبخیر شد و ته مانده عصاره در متانول حل شد و حجم عصاره حاصل به 5 میلی­لیتر رسانده شد. سپس با دستگاه اسپکتروفتومتر (Shimadzu, UV-Visible) مدل PC1601 مورد بررسی قرار گرفت (17). منحنی استاندارد با استفاده از ترکیب استاندارد کلشی­سین رسم شد و با استفاده از آن مقدار آلکالوئید کل در هر نمونه بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک بافت محاسبه گردید.

تهیه عصاره پلی­فنلی و سنجش ترکیبات فنلی: برای استخراج ترکیبات پلی­فنلی دو گرم از بافت گیاهی (ریشه، ساقه، برگ) با 30 میلی­لیتر متانول عصاره­گیری شد و در طول شب روی شیکر و در دمای اتاق نگهداری شد. عصاره به دست آمده برای سنجش ترکیبات فنلی و فلاونوئیدها مورد استفاده قرار گرفت.

برای سنجش ترکیبات فنلی، 125میکرولیتر عصاره متانولی، 5/1 میلی­لیتر آب مقطر و 125 میکرولیتر معرف فولین- سیاکلتو (Folin-Ciocalteu) مخلوط و بعد از گذشت 6 دقیقه 25/1 میلی­لیتر محلول سدیم کربنات 7% به مخلوط حاصل افزوده شد و در نهایت محلول­ها به مدت 90 دقیقه در تاریکی نگهداری و سپس جذب آن­ها در طول موج 760 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر خوانده شد. مقدار ترکیبات فنلی کل در هر نمونه با استفاده از منحنی استاندارد حاصل از گالیک اسید بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک بافت محاسبه گردید (5).

سنجش فلاونوئیدها:  برای سنجش فلاونوئیدها 5/0 میلی­لیتر از عصاره متانولی، 50 میکرولیتر استیک اسید 33% و 100 میکرولیتر محلول تازه تهیه شده آلومینیم کلراید 10% مخلوط شد و حجم نهایی محلول با استفاده از متانول به 5/2 میلی­لیتر رسید. بعد از 30 دقیقه جذب آن­ها در طول موج 414 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر خوانده شد. سنجش همه نمونه­ها با سه تکرار مستقل انجام شد و مقدار فلاونوئید کل در هر نمونه با استفاده از منحنی استاندارد کوئرستین بر حسب میلی­گرم بر گرم وزن خشک بافت محاسبه گردید (8).

استخراج و تهیه عصاره­های گیاهی: پنج گرم از پودر هر یک ­از اندام­های گیاه (ریشه، ساقه، برگ) همراه با 50 میلی­لیتر متانول 80% به مدت 5/1 ساعت در حمام اولتراسونیک قرار گرفت. عصاره متانولی حاصل از کاغذ صافی عبور داده شد و توسط دستگاه تقطیر در خلاء و در دمای اتاق کاملا تغلیظ شد. به عصاره متانولی تغلیظ شده 20 میلی­لیتر آب مقطر و 20 میلی­لیتر دی­اتیل­اتر اضافه و در دکانتور بخوبی مخلوط شد. سپس فاز دی­اتیل­اتری (فاز رویی) جدا و بطور جداگانه تغلیظ گردید و این بار 20 میلی­لیتر کلروفرم به فاز آبی اضافه و به خوبی در دکا­نتور مخلوط شد. فاز کلروفرمی (زیرین) جدا و تغلیظ گردید. در مرحله آخر 20 میلی­لیتر  بوتانول به فاز آبی اضافه و در دکا­نتور بخوبی مخلوط شدو فازهای تشکیل شده آبی (زیرین) و بوتانولی (رویی) از هم جدا و با استفاده از دستگاه تقطیر در خلاء تغلیظ شده و برای مطالعات بعدی نگهداری شدند.

بررسی سمیت سلولی عصاره­ها: رده­های سلول­ سرطانی RAJI و A549 از انستیتو پاستور ایران تهیه شد. محیط کشت RPMI حاوی پنی سیلین- استرپتومایسین (IU/mL 100) همراه با 5/0 میلی­لیتر FBS ده درصد در انکوباتور CO2 با دمای 37 درجه سانتی­گراد و محیطی با پنج درصد CO2 و 95% بخار آب کشت داده شدند. پس از رشد و تکثیر، سلول­ها در پلیت 96 خانه­ای توزیع گردیدند (000/20 سلول در هر چاهک) و به مدت 18 تا 20 ساعت داخل انکوباتور 37 درجه نگهداری شدند. سپس محیط کشت هر چاهک به آرامی خارج شد و ml180 محیط کشت جدید همراه با  ml20 از عصاره گیاهی آماده شده و با  غلظت­های نهایی  mg/ml 5/62 – 1000 حل شده در (Dimethyl sulfoxide) DMSO (بطوری­که مقدار  DMSO  در هر چاهک از 5% تجاوز نکند) به هر چاهک اضافه و مجدداً پلیت به مدت 24 ساعت داخل انکوباتور قرار داده شد. بعد از این مدت پلیت از انکوباتور خارج کرده و به هر چاهک ml20  محلول  mg/ml5MTT  ( 3-(4,5-dimethyltetrazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) اضافه گردید. پس از گذشت چهار ساعت، محیط داخل هر چاهک به آرامی خارج و به هر چاهک ml100 DMSO اضافه شد تا کریستال­های ارغوانی رنگ حاصل از احیاء MTT در آن حل شود و سپس جذب نوری هر نمونه با دستگاه reader (Anthos 2020) ELISA در طول موج 490 نانومتر اندازه­گیری شد. در نمونه شاهد، بجای عصاره گیاهی، از همان حجمDMSO  استفاده شد. در این روش نمکMTT  که زرد رنگ است، توسط آنزیم­های دهیدروژناز موجود در میتوکندری سلولهای فعال به ترکیب غیرمحلول و ارغوانی رنگ فورمازان تبدیل می­شود و بنابراین شدت رنگ ارغوانی حاصله معرف نسبت سلول­های زنده در هر چاهک است (14، 22). 

اثر سمیت سلولی عصاره­ها بر سلول­های لنفوسیت خون: به منظور مقایسه اثر سمیت سلولی عصاره­های گیاه بر رده­های سلول سرطانی با سلول سالم، از لنفوسیت­های جدا شده از خون تازه انسان استفاده شد. ابتدا خون­گیری از فرد داوطلب سالم با اخذ رضایت­نامه انجام شد (همه مراحل با استفاده از خون یک نفر انجام گرفت). خون تازه پس از آغشته شدن به  Na2EDTA به آرامی به ظرفی حاوی فایکول انتقال یافت به طوری که خون روی فایکول قرار گرفت (حجم فایکول نصف حجم خون مورد نظر بود). این مجموعه به مدت 20 دقیقه در rpm 1500 سانتریفوژ شد و سپس سلول­های لنفوسیت که به صورت لایه­ای مجزا در زیر فایکول قرارگرفته بودند، به آرامی جدا شده و مجدداً سانتریفوژ شدند تا لنفوسیت­ها رسوب کرده و اگر احیاناً با فایکول آغشته بودند کاملاً از آن جدا شوند. رسوب حاصل ابتدا با سرم فیزیولوژیک و سپس با محیط کشت RPMI شستشو داده شد و در انتها در دو میلی­لیتر محیط کشت معلق شد و شمارش سلولی انجام گرفت تا تعداد سلول­ها در هر میلی­لیتر به­ دست آید. بر اساس نتیجه شمارش سلولی برای هر چاهک پلیت حجمی از محیط کشت حاوی 20000 سلول (معادل 50 میکرولیتر) محاسبه شد. سپس ابتدا در چاهک­های هر ردیف 20 میکرولیتر از رقت مورد نظر عصاره ریخته و سپس 50 میکرولیتر محیط کشت حاوی سلول و 130 میکرولیتر محیط RPMI دارای FBS %10 اضافه گردید. سپس به ازای 200 میکرولیتر محیط کشت، 5 میکرولیتر  فیتوهماگلوتینین اضافه شد. بعد از انجام مراحل فوق، سلول­ها به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شده و سپس به روشی که پیش از این ذکر شد مورد ارزیابی MTT قرار گرفتند.

تجزیه و تحلیل آماری داد­ها: آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی و با سه تکرار بیولوژیک انجام شد. مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن با سطح احتمال 0.05 p ≤  با استفاده از نرم­افزار SPSS 2016 صورت گرفت.

نتایج 

بر اساس نتایج حاصل، محتوای آلکالوئید در اندام­های مورد بررسی بطور معنی­داری با یکدیگر متفاوت بوده و بیشترین مقدار (mg/g DW 99/14) در برگ و کمترین مقدار آن (mg/g DW 45/10) در ساقه مشاهده شد (شکل1-الف). محتوای فنل­ها نیز در اندام­های مورد بررسی بطور معنی­داری با یکدیگر متفاوت بوده و بیشترین مقدار در ساقه (mg/g DW 33/5) و کمترین مقدار آن (mg/g DW 25/2) در برگ مشاهده شد (شکل 1-پ). نتایج بررسی محتوای فلاونوئیدها کل در شکل1-ب نشان داده شده است. به طوری که از نتایج بر می­آید، محتوای فلاونوئیدها نیز در اندام­های مورد بررسی بطور معنی­داری با یکدیگر متفاوت بوده و بیشترین مقدار (mg/g DW 07/6) در برگ و کمترین مقدار آن (mg/g DW 21/3) در ساقه مشاهده شد.

 

 

 

شکل 1- مقایسه محتوای ترکیبات آلکالوئیدی کل (الف)، ترکیبات فنلی کل (ب) و ترکیبات فلاونوئیدی کل (پ) در اندام­های برگ، ساقه و ریشه گیاه سدابی جنوبی (حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح 0.05 p ≤ است).

 

نتایج حاصل از بررسی سمیت سلولی عصاره­ها به صورت IC50 (غلظتی از عصاره که باعث مهار 50 درصد تکثیر سلولی نسبت به کنترل می شود) بیان شده است (هر چه مقدار IC50 کمتر باشد، سمیت سلولی عصاره بیشتر است).

سمیت سلولی عصاره­های دی­اتیل­اتری، کلروفرمی، بوتانولی و آبی حاصل از عصاره متانولی اندام­های برگ، ساقه و ریشه سدابی جنوبی بر روی رده سلولی RAJI در شکل 2 نشان داده شده است. همانطور که قابل مشاهده است، در تمامی اندام­های مورد بررسی عصاره دی­اتیل­اتری بیشترین فعالیت سمیت سلولی را علیه این رده سلول سرطانی نشان داد و در بین اندام­های مورد بررسی نیز عصاره دی­اتیل­اتری برگ بیشترین خاصیت سمیت سلولی را بر روی این رده سلولی داشت. سمیت سلولی عصاره کلروفرمی برگ تقریبا معادل سمیت سلولی عصاره دی­اتیل­اتری ریشه بر رده سلولی RAJI است ولی بین اثر عصاره­های بوتانولی و آبی برگ تفاوت معنی­داری مشاهده نشد.  در ریشه و ساقه، عصاره دی­اتیل­اتری بیشترین تاثیر را نشان داد ولی تفاوت معنی­داری بین اثر سمیت سلولی سایر عصاره­ها با یکدیگر مشاهده نشد. بیشترین سمیت سلولی مشاهده شده در عصاره دی­اتیل اتری برگ با IC50 معادل 23/275 میکروگرم بر میلی­لیتر و کمترین آن مربوط به عصاره آبی برگ با IC50 معادل  73/541 میکروگرم بر میلی­لیتر می­باشد. بر اساس تقسیم بندی انجام شده توسط Kuete و Efferth مقادیر IC50 بالاتر از µg/mL 200 برای عصاره­های گیاهی بر روی سلول سرطانی، فاقد سمیت سلولی لازم برای خالص سازی عصاره در نظر گرفته می­شود (19).

عصاره­های مورد بررسی بر روی رده سلولی A549 سمیت بیشتری نسبت به RAJI نشان دادند (شکل3). در برگ، ساقه و ریشه، عصاره دی­اتیل­اتری بیشترین فعالیت سمیت سلولی و عصاره آبی کمترین فعالیت را علیه این رده سلول سرطانی نشان دادند. در بین اندام­های برگ، ریشه و ساقه تفاوت معنی­داری از نظر سمیت سلولی عصاره دی­اتیل­اتری مشاهده نشد. بیشترین سمیت سلولی مشاهده شده در عصاره دی­اتیل­اتری برگ با IC50 معادل 13/152 میکروگرم بر میلی­لیتر و کمترین آن مربوط به عصاره آبی برگ با IC50 معادل 51/421 میکروگرم بر میلی­لیتر می­باشد. در تمام اندام­ها مقادیر IC50 عصاره دی­اتیل­اتری کمتر از µg/mL 200 بود.

در مجموع تاثیر عصاره دی اتیل اتری اندام­های مختلف سدابی جنوبی بر رده سلولی A549 بطور معنی­داری بیشتر از تاثیر آن بر رده سلولی RAJI بود. در ریشه، ساقه و برگ، تفاوت معنی­داری بین اثر سمیت سلولی عصاره­های کلروفرمی و بوتانولی با یکدیگر مشاهده نشد ولی تاثیر عصاره آبی بطور معنی­داری کمتر از سایر عصاره­ها در هر سه اندام بود. بجز عصاره آبی، سایر عصاره­های حاصل از اندام­های مختلف گیاه بر رده سلولی A549 بطور معنی­داری اثر سمیت سلولی بیشتری نسبت به رده سلولی RAJI  نشان دادند. در مورد رده A549 نیز تفاوت معنی­داری از نظر سمیت سلولی هر یک از عصاره­های به دست آمده از  اندام­های مختلف مشاهده نشد.

بر اساس تقسیم بندی انجام شده توسط Kuete و Efferth  بجز عصاره دی­اتیل­اتری برگ (IC50=270.22)، هیچیک از عصاره­های مورد بررسی نسبت به سلول­های لنفوسیت سالم خون سمیت سلولی نداشتند (شکل 4). بر اساس این تقسیم بندی در مورد سلول­های سالم، IC50 بیش از 300 عصاره­های گیاهی نشانه عدم سمیت سلولی است (19).


 

شکل 2- مقایسه مقادیر IC50  اجزای عصاره متانولی حاصل از اندام­های مختلف (برگ، ساقه و ریشه) گیاه سدابی جنوبی بر رده سلولی سرطانی RAJI (حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح 0.05 p ≤ است).

 

شکل3- مقایسه مقادیر IC50  اجزای عصاره متانولی حاصل از اندام­های مختلف (برگ، ساقه و ریشه) گیاه سدابی جنوبی بر  رده سلولی سرطانی A549 (حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح  0.05 p ≤ است).

 

شکل4- مقایسه مقادیر IC50  اجزای عصاره متانولی حاصل از اندام­های مختلف (برگ، ساقه و ریشه) گیاه سدابی جنوبی بر روی لنفوسیت­های سالم خون انسان (حروف متفاوت نشان دهنده تفاوت معنی دار در سطح  0.05 p ≤ است).

 

در این بررسی، بیشترین سمیت سلولی مشاهده شده مربوط به عصاره دی­اتیل­اتری برگ با IC50 معادل 22/270 میکروگرم بر میلی­لیتر و کمترین سمیت سلولی مشاهده شده مربوط به عصاره آبی ساقه با IC50 معادل 04/1031 میکروگرم بر میلی­لیتر می­باشد.  

بحث

آلکالوئیدها، ترکیبات شیمیایی هتروسیکلی هستند که حداقل دارای یک اتم نیتروژن و دارای آثار فارماکولوژیکی می­باشند. گیاهان یکی از مهمترین منابع آلکالوئیدها محسوب می­شوند و از نظر تاریخی استفاده از آلکالوئیدهای عصاره­های گیاهی در معجون­ها، داروها و سموم، قدمتی معادل تشکیل جوامع بشری دارد. انباشتگی رونوشت ژن­های کلیدی مسیر بیوسنتزی آلکالوئیدها در گیاه پروانش هم در ریشه و هم در برگ و در مواردی در گل هم مشاهده شده است. در گونه­های تیره سیب­زمینی بررسی­ها انباشتگی رونوشت ژن هیوسیامین-بتا-6-هیدروکسیلاز را در سلول­های لایه دایره محیطیه ریشه ثبت کرده­اند ولی انباشتگی ژن­های کلیدی بیوسنتز نیکوتین در ریشه، ساقه و برگ گونه­های مختلف تنباکو مشاهده شده است (20).  بنابراین به نظر می­رسد بیوسنتز آلکالوئیدها در گونه­های مختلف گیاهی می­تواند در اندام­های مختلف تمرکز داشته باشد. بر اساس نتایج پژوهش حاضر، آلکالوئیدها دراندام هوایی گیاه سدابی جنوبی بیش از ریشه انباشته می­شوند. با وجود مطالعات زیادی که بر روی شناسایی آلکالوئیدهای گونه­های سدابی صورت گرفته، مطالعه چندانی در مورد مسیرهای بیوسنتزی آنها انجام نشده است. این بررسی بطور غیرمستقیم این احتمال را ایجاد می­کند که ممکن است بیوسنتز آلکالوئید در برگ گونه سدابی جنوبی بیشتر از سایر اندام­ها صورت گیرد.

محتویات فنلی گیاه مجموعه مهمی از ترکیبات هستند که دارای فعالیت پاداکسیدانی و خاصیت تخریب کنندگی رادیکال­های آزاد می­باشند (10). ترکیبات فنلی با داشتن حداقل یک حلقه شش کربنی (C6) که یک یا بیش از یک گروه هیدروکسیل به آن متصل است، شناخته می­شوند. این ترکیبات از سینامیک­اسید مشتق می­شوند که خود در اثر فعالیت آنزیم فنیل­آلانین­آمونیالیاز (PAL) از فنیل­آلانین مشتق شده است. فعالیت این آنزیم، محل جدا شدن متابولیسم اولیه (مسیر شیکیمات)، از متابولیسم ثانویه (مسیر فنیل­پروپانوئید) است. تحت شرایط طبیعی رویش، 20% از کربن تثبیت شده توسط گیاه، وارد متابولیسم فنیل­پروپانوئیدی می­شود. فنل­ها بر اساس تعداد کربن متصل شده به اسکلت ساختمانی، به چندین گروه نظیر فنل­های ساده، بنزوئیک اسیدها، فنیل­پروپانوئیدها و فلاونوئیدها تقسیم می­شوند. ترکیبات فنلی در گیاه نقش­های متعدد داشته و تحت شرایط محیطی مختلف، بیوسنتز آن­ها تحریک می­شود. خاصیت آنتی­اکسیدانی ترکیبات فنلی به دلیل میل بالای آن­ها به هم­بند شدن با عناصر فلزی است (23). ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی با توجه به تنوع و عملکرد وسیع خود می­توانند در اندام­های مختلف گیاهی سنتز شوند. بر اساس نتایج بدست آمده در این پژوهش، تجمع فنل­ها درساقه بیش از سایر بافت­ها و حدود دو برابر مقدار آن در برگ می­باشد. در مورد  محتوای فلاونوئید کل این نسبت معکوس شده و در برگ بیشترین تجمع این ترکیبات مشاهده می­شود.

در این پژوهش فعالیت سمیت سلولی چهار بخش استخراج شده (دی­اتیل­اتری، کلروفرمی، بوتانولی و آبی) از عصاره متانولی اندام­هوایی، برگ، ساقه و ریشه علیه دو رده سلول سرطانی مورد آزمایش قرار گرفت. نتایج خاصیت پادسرطانی متوسطی از عصاره­های بررسی شده علیه رده­های سلولی مورد بررسی نشان داد که ثابت می­کند این گیاه پتانسیل بررسی­های بیشتر بعنوان منبع تولید دارو برای شیمی­درمانی حداقل در مورد دو نوع سرطان شامل سرطان­های خون و ریه را دارد. بر اساس تقسیم بندی انجام شده توسط Kuete و Efferth مقادیر IC50 بالاتر از µg/mL 200 برای عصاره­های گیاهی بر روی سلول سرطانی، فاقد سمیت سلولی لازم برای خالص سازی عصاره در نظر گرفته می­شود (19).  با توجه به اینکه IC50 عصاره اتیل­استاتی اندام­های برگ، ریشه و ساقه گیاه سدابی جنوبی بر رده سلولی A549 کمتر از 200 میکروگرم بر میلی­لیتر است و از سوی دیگر میزان IC50 عصاره اتیل­استاتی هر سه اندام نسبت به رده سلولی RAJI نیز بیشترین سمیت سلولی را نسبت به سایر عصاره­ها نشان داد، می­توان نتیجه گرفت که بخش سازی بیشتر عصاره اتیل­استاتی اندام­های مختلف این گیاه (بخصوص برگ)، با استفاده از روش­های کروماتوگرافی، احتمال دستیابی به بخش­هایی با آثار سمیت سلولی قوی­تر را افزایش می­دهد. در سال 2007 Varamini و همکارانش با بررسی عصاره اتانلی گیاه سدابی جنوبی بر رده سلولی A549 مقدار IC50 را معادل 450 میکروگرم بر میلی­لیتر بدست آورده­اند (36). مقایسه نتایج آن­ها با نتایج این پژوهش، موثرتر بودن روش عصاره­گیری در پژوهش حاضر را نشان داده و لزوم بررسی بیشتر در مورد شرایط بخش­سازی عصاره­ها را بیشتر آشکار می­سازد. نکته قابل توجه، عدم سمیت سلولی عصاره ها نسبت به سلول­های سالم خون انسان است که می­تواند نویدبخش اثر اختصاصی محتویات عصاره­ها بر سلول­های سرطانی باشد. بعلاوه تاثیر متفاوت این عصاره­ها بر دو رده مختلف سلول سرطانی می­تواند نشان­دهنده تاثیر اختصاصی ترکیبات این گیاه بر سرطان­های مختلف باشد. این نتایج می­تواند پتانسیل مناسبی برای استفاده از ترکیبات خالص شده این گیاه در صنعت داروسازی فراهم ­آورد.

در سال 2017 Al-Muniri و Hossain نیز  سمیت عصاره­های بخش­سازی شده مختلف حاصل از عصاره متانولی گیاه سدابی جنوبی بومی کشور عمان را بر میگوی آب شور مورد بررسی قرار داده و بیشترین سمیت را در عصاره­های کلروفرمی و اتیل­استاتی با IC50 معادل µg/mL500 مشاهده نمودند (7). این نتایج در تائید نتایج حاصل از پژوهش حاضر می­باشد و لزوم مطالعات بیشتر بر روی این گیاه و بخش­سازی عصاره­ها را مورد تائید قرار می­دهد. لازم به ذکر است که بررسی­های انجام شده در این پژوهش برای اولین بار بر روی سدابی جنوبی ایران صورت پذیرفته است.

1- صادقی ا، بهمنش م، شریفی م، محمدسلطانی ب و احمدیان چاشمی ن (1393) القای آپوپتوز رده سلولی کارسینومای مثانه 5637 در اثر تیمار با پودوفیلوتوکسین، مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (مجله زیست­شناسی ایران) جلد 27، شماره 3، صفحات 399-405

2- میمندی ک و یعقوبی م م (1394) اثرات عصاره آبی و اتانولی گل محمدی (Rosa damascena mill L.) بر علیه سلول­های سرطانی معده انسان، مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (مجله زیست­شناسی ایران) جلد 28، شماره 2، صفحات 299-309

3- قهرمان، احمد (1373) کورموفیت­های ایران (سیستماتیک گیاهی)، چاپ اول، مرکز نشر دانشگاهی، تهران

4- مظفریان، ولی الله (1392) فرهنگ نام­های گیاهان ایران، چاپ هفتم، نشر فرهنگ معاصر، تهران

 

5- Agbor G A, Vinson A and Donnelly P E (2014), Folin-Ciocalteau Reagent for Polyphenolic Assay. Int J Food Sci Nutr Diet. 3: 147-156

6- Al-Burtamani S. K. S., Fatope M. O., Marwah R. G. , Onifade A. K.  and  Al-Saidi S. H. (2005) Chemical composition, antibacterial and antifungal activities of the essential oil of Haplophyllum tuberculatum from Oman, Journal of Ethnopharmacology, 96: 107-112

7- Al-Muniri R M S and Hossain M A (2017) Evaluation of antioxidant and cytotoxic activities of different extracts of folk medicinal plant Hapllophyllum tuberculatum, Egyptian Journal of Basic and Applied Sciences 4: 101–106

8- Beketov E, Pakhomov V, and Nesterova O (2005) Improved Method of Flavonoid Extraction from Bird Cherry Fruits, Pharmaceutical Chemistry Journal, 39: 316-318.

9- Bezivin, S. Tomasi, F. Lohezic-Le Devehat, and J. Boustie (2003) Cytotoxic activity of some lichen extracts on murine and human cancer cell lines, Phytomedicine, 10: 499–503

10- Diwan R, Shinde A and Malpathak N (2012) Phytochemical Composition and Antioxidant Potential of Ruta graveolens L. In Vitro Culture Lines, Journal of Botany, 2012: 1-6

11- El-Menshawi B, Fayad W, Mahmoud K, El-Hallouty S M, El-Manawaty M, Olofsson M H and Linder S (2010) Screening of natural products for therapeutic activity against solid tumors, Indian Journal of Experimental Biology, 48:258-264

12- Giard DJ, Aaronson SA, Todaro GJ, Arnstein P, Kersey JH, Dosik H and Parks WP (1973) In vitro cultivation of human tumors: Establishment of cell lines derived from a series of solid tumors, Journal of the National Cancer Institute, 51: 1417–1423

13- Hadjadj H, Bayoussef Z, El Hadj-Khelil, Beggat H, Boukaka Y, Khaldi I A, Mimouni S, Sayah F and Tey M (2015) Ethnobotanical study and phytochemical screening of six medicinal plants used in traditional medicine in Northern Sahara of Algeria, Journal of Medicinal Plant research, 41: 1049-1059

14- Helgason CD (2005) Basic cell culture protocols In: Methods in molecular biology, J.M. Walker (SERIES EDITOR) Springer

15- Ionkova I (2011) Anticancer Lignans - from Discovery to Biotechnology, Medicinal Chemistry, 11: 843-856

16- Jasen O, Akhmedjanova V, Angenol L, Balansard G, Chariol A, Oliver E, Tits M and Frederich M (2006) Screening of 14 alkaloids isolated from Haplophyllum A. Juss. for their cytotoxic properties. Journal of Ethnopharmacology 105: 241–245

17- Kamada H, Okamura N, Satake M, Harada H and Shimomura K (1986) Alkaloid production by hairy root cultures in Atropa belladonna, Plant Cell Reports, 5: 239-242.

18- Kuete V, Wiench B, Alsaid M S, Alyahya M A, Fankam A G, Shahat A A and Efferth T (2013) Cytotoxicity, mode of action and antibacterial activities of selected Saudi Arabian medicinal plants, BMC Complementary and Alternative Medicine, 13: 354-365

19- Kuete and Efferth (2015) African Flora Has the Potential to Fight Multidrug Resistance of Cancer, BioMed Research International, 2015: 1-24

20- Kutchan T M (1995) Alkaloid Biosynthesis -The Basis for Metabolic Engineering of Medicinal Plants, The Plant Cell, 7: 1059-1070

21- Lautie E, Fliniaux M A and Villarreal M L (2010) Updated biotechnological approaches developed for 2,7_-cyclolignan production, Biotechnol. Appl. Biochem. (2010) 55, 139–153

22- MacLeod RA and Drexler HG (2005) Cytogenetic Analysis of Cell Lines In: Methods in molecular biology, J.M. Walker (SERIES EDITOR) Springer

23- Michalak A (2006) Phenolic Compounds and Their Antioxidant Activity in Plants Growing under Heavy Metal Stress, Polish J. of Environ. Stud.,15: 523-530

 24- Raissi A, Arbabi M, Roustakhiz J and Hosseini M­ (2016)   Haplophyllum tuberculatum: An overview, Journal of Herbal Mededicine Pharmacology 5: 125-130

25- Rechinger K H (ed.), Flora Iranica, Fasc. 111-162 (1975-1987) Wiley Online Library.

26- Ruffa M J, Ferraro G, Wagner M L, Calcagno M L, Campos R H and Cavallaro L (2002) Cytotoxic effect of Argentine medicinal plant extracts on human hepatocellular carcinoma cell line, Journal of Ethnopharmacology 79: 335–339

27- Sabry O M M, El Sayed L M and Alshalmani S K (2016) GC/MS Analysis and Potential Cytotoxic Activity of Haplophyllum tuberculatum Essential Oils Against Lung and Liver Cancer Cells, Pharmacognosy Journal, 8: 66-69

28- Setterblad N, Becart S, Charron D and Moony N (2001) Signaling via MHC class II molecules modifies the composition of GEMs in APC, Scandinavian Journal of Immunology, 54: 87-92

29- Sheriha G M,  Abou Amer K M,  Elshtaiwi B Z,  Ashour A S,  Abed F A and Alhallaq H (1987) Quinoline alkaloids and cytotoxic lignans from Haplophyllum tuberculatum, Phytochemistry, 26: 3339-3341

30- Sheriha G M and  Abou Amer K M (1984) Lignans of haplophyllum tuberculatum Phytochemistry, 23: 151-153

31- Soltani M, and Khosravi AR (2005) A new species of Haplophyllum (Rutaceae) from SW Iran. Willdenowia, 293-298

32- Stanković, MS (2011) Total phenolic content, flavonoid concentration and antioxidant activity of Marrubium peregrinum L. extracts. Kragujevac Journal of Science, 33: p. 63-72

33- Thirupathi K, Krishna D R, Mohan G K, Mallaiah G K (2013) Anticancer Activity of Cleistanthus collinus, BioMedRx.,1: 392-396

34- Ulubelen A and Öztürk M (2008) Alkaloids, Coumarins and Lignans from Haplophyllum Species, Records 0f Natural products, 2: 54-69

35- Ünver-Somer N, Kaya G I, Sarıkaya B, Önür M A, Özdemir C, Demirci B and Can-Bas (2012) Composition of the Essential oil of Endemic Haplophyllum megalanthum Bornm. from Turkey, Records of Natural Products, 6:80-83

36- Varamini P, Doroudchi M, Mohagheghzadeh A, Soltani M and Ghaderi A (2007) Cytotoxic Evaluation of Four Haplophyllum Species with Various Tumor Cell Lines, Pharmaceutical Biology, 45: 299-302

37- Yari M., Masoudi sh. and Rustaiyan A. (2000) Essential Oil of Haplophyllum tuberculatum (Forssk.) A. Juss. Grown Wild in Iran, Journal of Essential oil Research, 12: 69-70.

38- Youssef D T A (2005) Lignans of aerial parts of Haplophyllum tuberculatum (FORSSK) A. JUSS, Bull. Pharm. Sci., Assiut University, 28:  261-267