نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 استادیار/ دانشگاه گیلان

2 دانشجو/ دانشگاه گیلان

3 دانشجو/ دانشگاه خوارزمی

چکیده

فلز سنگین سرب به عنوان آلاینده در محیط زیست سبب بروز اثرات سمی در سلول‌ها می‌شود. جلبک سبز تک یاخته‌ای Chlorella Vulgaris متعلق به خانواده‌یChlorellaceae به علت ساده بودن ساختار سلولی و ویژگی‌های منحصر به فرد خود، به عنوان مدل در مطالعات فیزیولوژیکی گیاهی استفاده می‌شود. به منظور بررسی وضعیت رشد و سازگاریC.Vulgaris به غلظت‌های مختلف سرب ( صفر، 10، 50 ، 80میلی‌گرم بر لیتر)، آزمایشی در محیط کشت زاندر مثبت با سه تکرار در اتاقک کشت با دمای °C2 ±25 ، شدت نوری 2500 لوکس ، تناوب نوری 12 ساعت روشنایی و 12ساعت تاریکی در شرایط هوادهی به مدت 18 روز انجام شد. منحنی رشد نمونه‌ها در هر تیمار بر اساس جذب نوری در طول موج nm750 ، نرخ رشد، میزان کلروفیل‌ها و مالون‌دی‌آلدهید و مقدار سرب جذب شده از محیط توسط جلبک کلرلا اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد با افزایش غلظت سرب در محیط کشت تا تیمار 80 میلی‌گرم بر لیتر سرب، تولید ماده زیستی، رنگیزه‌های فتوسنتزی و متعاقب آن نرخ رشد کاهش یافت و نمونه‌ها در مدت زمان کمتری وارد مرحله ایستایی رشد شدند و میزان مالون‌دی‌آلدهید در تیمار های 50 و 80 میلی‌گرم بر لیتر نسبت به کنترل افزایش معنی داری داشتند.به طور کلی غلظتهای بالای فلز سمی سرب، اکثر پارامترهای فیزیولوژیکی و حیاتی جلبک C.Vulgaris را تحت تاثیر قرار داد اما به عنوان یک میکروآلگ مقاوم، علی رغم کاهش تقسیم سلولی همچنان توانایی رشد خود را حفظ نمود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effects of different concentrations of lead on the growth, photosynthetic pigments and malondialdehyde content of the unicellular green algae Chlorella Vulgaris

نویسندگان [English]

  • Akram Sadat Naeemi 1
  • Jannat Sarmad 1
  • nastaran mohseni 2
  • fatemeh kehtari 3

1 Assistant Prof./University of Guilan

2 student/ University of Guilan

3 student/ Kharazmi University

چکیده [English]

Lead as a contaminant of the environment cause cell poisoning. The unicellular green algae Chlorella Vulgaris belongs to the family Chlorellaceae. Since C.Vulgaris has a simple cell structure and unique feature, it is used as a model in plant physiological studies. In order to investigate the growth and adaption of Chlorella sp. to different concentrations of lead (0,10 ,50 , 80 mgL-1) , an experiment was done in the medium Zn+ With 3 replication in the growth chamber with 12 h light photoperiod, temperature of 25 ± 2 °C, light intensity of 2500 lux and with proper aeration, during 18 days. Growth curve of total samples were determined by measuring the absorbance of 750 nm. Growth rate, chlorophylls and malondialdehyde content and sorption of lead by the algae were measured. Results showed that by increasing concentrations of Lead in the medium up to 80 mgL-1, biomass production, photosynthetic pigments and subsequent growth rate were decreased and samples in less time were able to enter stationary phase and the amount of malondialdehyde (MAD) in treatment of 50 and 80 mgL-1 were significantly increased compared to control. Generally, high concentrations of toxic metal lead influenced the majority of physiological and vital parameters of C.Vulgaris but as a resistant microalgae, despite of the reduction in cell division still retained its growth potential.

کلیدواژه‌ها [English]

  • heavy metal
  • Chlorella sp
  • growth rate
  • Chlorophyll
  • malondialdehyde

اثرات غلظت‌های مختلف سرب بر رشد و محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی و مالون‌دی‌آلدهید جلبک سبز تک یاخته‌ای Chlorella Vulgaris

اکرم سادات نعیمی1*، جنت سرمد1، نسترن محسنی1 و فاطمه کهتری2

1 گیلان، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی 

2 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروهزیست شناسی سلولی _تکوینی گیاهی

تاریخ دریافت: 10/4/95                تاریخ پذیرش: 13/9/96

چکیده

فلز سنگین سرب به عنوان آلاینده در محیط زیست سبب بروز اثرات سمی در سلول‌ها می‌شود. جلبک سبز تک یاخته­ای Chlorella Vulgaris  متعلق به خانواده‌یChlorellaceae   به علت ساده بودن ساختار سلولی و ویژگی‌های منحصر به فرد خود، به عنوان مدل در مطالعات فیزیولوژیکی گیاهی استفاده می‌شود. به منظور بررسی وضعیت رشد و سازگاریC.Vulgaris   به غلظت­های مختلف سرب ( صفر، 10، 50 ، 80میلی­گرم بر لیتر)، آزمایشی در محیط کشت زاندر مثبت با سه تکرار در اتاقک کشت با دمای  °C2  ±25 ، شدت  نوری 2500 لوکس ، تناوب نوری 12 ساعت روشنایی و 12ساعت تاریکی در شرایط هوادهی به مدت 18 روز انجام شد. منحنی رشد نمونه­ها در هر تیمار بر اساس جذب نوری در طول موج   nm750  ، نرخ رشد، میزان کلروفیل­ها و مالون‌دی‌آلدهید و مقدار سرب جذب شده از محیط توسط جلبک کلرلا اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد با افزایش غلظت سرب در محیط کشت  تا تیمار 80 میلی­گرم بر لیتر سرب، تولید ماده زیستی، رنگیزه‌های فتوسنتزی و متعاقب آن نرخ رشد کاهش یافت و نمونه­ها در مدت زمان کمتری وارد مرحله ایستایی رشد شدند و میزان مالون‌دی‌آلدهید در تیمار های 50 و 80 میلی­گرم بر لیتر نسبت به کنترل افزایش معنی داری داشتند. به طور کلی غلظتهای بالای فلز سمی سرب، اکثر پارامترهای فیزیولوژیکی و حیاتی جلبک C.Vulgarisرا  تحت تاثیر قرار داد اما به عنوان یک میکروآلگ مقاوم، علی رغم کاهش تقسیم سلولی همچنان توانایی رشد خود را حفظ نمود.

واژه های کلیدی: فلز سنگین ، کلرلا، نرخ رشد، کلروفیل، مالون‌دی‌آلدهید

* نویسنده مسئول، تلفن: 01333310173 ، پست الکترونیکی: akramnaeemi@yahoo.com

مقدمه 

 

توسعه‌ی فعالیت‌های انسانی ‌و صنعتی منجر به افزایش آلودگی فلزات در محیط زیست می شود (7). سرب یکی از خطرناک ترین، مهمترین و سمی‌ترین فلزات سنگین در اکوسیستم‌های آبی است (15). فلزات سنگین بسته به موقعیت اکسیداسیونی که دارند به میزان زیادی فعال بوده و برای اغلب موجودات سمی هستند. در غلظتهای بالای فلزات سنگین، آسیب به سلولها به علت بالا رفتن سطوح گونه های فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species) سلولی و عدم توانایی سلول در مقابله با آنها رخ می‌دهد، در غلظتهای پایین فلزات سنگین توسط گیاهان و جلبکها جذب شده و به دیگر موجودات زنجیره غذایی انتقال می‌یابد (18)مقدار استاندارد سرب در آب‌های آشامیدنی براساس داده‌های آژانس حفاظت محیط زیست (EPA) و سازمان بهداشت جهانی (WHO) به ترتیب μg/l-1 5 و  μg/l-110 و حداکثر غلظت مجاز سرب در آب‌های طبیعی برای حفظ سلامتی انسان μg/l-1 50 گزارش شده‌است (25). جلبک‌ها، تولید کنندگان ‌اولیه‌ی زنجیره غذایی آبی هستند و به این دلیل اهمیت اکولوژیکی بالایی دارند. جلبک سبز تک یاخته‌ای کلرلا به علت ساده بودن ساختار سلولی و شرایط کشت آسان دوره رشد کوتاه و شباهت زیاد یه ساختار سلولی گیاهان عالی (21)، معمولا به عنوان مدل آزمایشی استفاده ‌می‌شود. علاوه بر این‌، نتایج حاصل از آزمون سمیت جلبکی نسبتا قابل اعتماد و برای سایر گونه های گیاهی تکرار پذیر است (11). تحقیقات گذشته نشان داده اند که فلزات سنگین اثرات قابل توجهی بر تقسیم سلولی، رشد و محتوای رنگیزه های فتوسنتزی و میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشای ریزجلبک کلرلا داشته است(7، 9، 11، 13، 19، 25).  با توجه به اهمیت فلز سنگین سرب به عنوان آلاینده اکوسیستم، در مطالعه حاضر آزمایشی به طرح سمیت بلند مدت فلز سرب و بررسی غلظت‌های مختلف آن بر شاخص‌های حیاتی Chlorella Vulgaris اختصاص دارد.

مواد و روشها

جلبک Chlorella Vulgaris از موسسه تحقیقات ماهیان خاویاری واقع در شهر رشت تهیه و در محیط کشت زاندر مثبت و pH  7 کشت اولیه داده شد. کلیه مواد شیمیایی مورد مطالعه از درجه خلوص آنالیتیکی برخوردار بودند. در ابتدا حجم مشخصی از سوسپانسیون جلبکی در شرایط استریل، به ارلن­های 250 میلی­لیتری در سه تیمار از غلظت‌های 10، 50 ، 80 میلی­گرم بر لیتر سرب (با استفاده از نمک نیترات سرب) و یک گروه شاهد با سه تکرار تلقیح شدند. تعداد سلول ها در ابتدای آزمایش تقریبا 106× 25/0 سلول در هرمیلی­لیتر در نظر گرفته شد. این عمل به منظور مشابهت نقطه ابتدایی منحنی رشد صورت گرفت. سپس تمامی ارلن­ها تحت شرایط پایه آزمایش( دمای ̊c2±25، شدت نوری 2500 لوکس، تناوب نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی با شدت جریان هوای مناسب) به اتاقک کشت انتقال یافتند. نمونه برداری در زمان صفر ( لحظه شروع آزمایش) تا انتهای دوره آزمایش در زمان‌های مشخصی به منظور رسم منحنی رشد و سنجش رنگیزه­ها انجام شد. رشد جلبک از طریق اندازه ی جذب نوری در طول موج nm ۷۵۰ اندازه‌گیری و سپس منحنی رشد رسم شد. میزان نرخ رشد ریز جلبک های مورد بررسی جداسازی شده بر طبق فرمول جدول شماره یک محاسبه گردید (12).

جدول 1- معادله نرخ رشد

 (Ln(dw9th)-Ln(dw7th)

µ=

t2-t1

در این رابطه μ نرخ رشد روزانه است . dw9th وزن خشک روز نهم و dw7th وزن خشک روز هفتم می‌باشد. t1 -  t2 بترتیب روزهای هفتم و نهم آزمایش می‌باشند. 

جهت تعیین غلظت رنگیزه­ها، یک میلی­لیتر از سوسپانسیون جلبکی هر ارلن به طور جداگانه، به میکروتیوب­های  مخصوص میکروسانتریفوژ منتقل و به مدت 5 دقیقه با 7000 دور دردقیقه سانتریفیوژ گردید. محلول رویی به کمک سمپلر خارج و به رسوب باقیمانده، یک میلی­لیتر استون 85% اضافه شد. سپس محتویات داخل میکروتیوب­ها با دستگاه ورتکس مخلوط و پس از آن نمونه­ها مجددا با دور 7000 ، به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ شدند. جذب محلول رویی در طول موج­های 647 و 663 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین گردید. (جهت جلوگیری از تخریب رنگیزه­ها، نمونه­ها  همواره در سرما و تاریکی نگه داشته شدند) با استفاده از فرمول­های جدول شماره دو ، میزان کلروفیلa، کلروفیل کل بر حسب میکروگرم در میلی­لیتر در هر سلول محاسبه گردید (8).

 

جدول 2- معادلات مورد استفاده در محاسبه رنگیزه‌های کلروفیلی در جلبک سبز تک یاخته‌ای C.vulgaris

Chla

=((12.25×od 663 nm)-(2.79× od 647 nm)) ×Dilution factor

Chlb

=((21.5× od 647 nm)-(5.1×od 663 nm)) ×Dilution factor

T-chl

=Chla+ chlb

 

برای سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا و غلظت مالون‌دی‌آلدهید (MDA) 1/0 گرم رسوب جلبکی از هر تیمار به کمک  ml1 محلول تری‌کلرو‌استیک اسید (TCA) 5 درصد، در دمای 4 درجه و به مدت 30 ثانیه سونیک شد و عصاره به دست آمده با سرعت 12000 دور به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و محلول رویی برداشته شد. هم حجم محلول رویی، محلول تیوباربیتوریک اسید 5/0 درصد در تری‌کلرواستیک اسید %20 به آن اضافه شد و مخلوط برای 25 دقیقه در 100 درجه سانتی گراد جوشانده شده و سپس برای مدت 5 دقیقه در rpm 7500  سانتریفیوژ شد تا محلول شفاف به دست آید. جذب محلول حاصله در  nm532  اندازه گیری شد. ماده مورد نظر برای جذب در این طول موج کمپلکس (MDA-TBA) است. جذب بقیه رنگیزه‌های غیراختصاصی در 600 نانومتر تعیین شد و از میزان جذب در 532 نانومتر کسر شد. برای محاسبه غلظت MDA از ضریب خاموشی معادل mM-1cm-1 155 استفاده شد و در نهایت مقدار مالون‌دی‌آلدهید که محصول پراکسیداسیون لیپیدی است برحسب نانومول در گرم وزن تر محاسبه گردید(10). برای اندازه گیری میزان سرب جذب شده از محیط توسط جلبک کلرلا، پس از سانتریفیوژ، رسوب جلبک جدا سپس با آب دیونیزه چند بار شستشو گردید. سپس جلبک در دمای 80 درجه سانتی گراد آون به مدت 48 ساعت خشک گردید. به ازای هر 2/0 گرم پودر جلبک ، 5 سی سی اسید نیتریک 65% (مرک) اضافه گردید و به مدت یک ساعت در دمای اتاق باقی ماند. سپس دیواره جلبک توسط اسید نیتریک به مدت 40 دقیقه در دمای بالا هضم گردید تا یون های سرب جذب شده توسط جلبک آزاد شود. پس از آن با صافی whatman 40 صاف شد . محلول صاف شده حاصله با آب دیونیزه به حجم 50 سی سی رسانده  و رقیق شد. سپس مقدار فلز سرب توسط دستگاه جذب اتمی مدل Younglin AAS 8020 آنالیز گردید. در نهایت مقدار سرب جذب شده توسط جلبک بر حسب میلی گرم بر گرم وزن خشک جلبک اندازه گیری شد.

نتایج 

روند روزانه رشد در منحنی های شکل شماره1، در نمونه‌های تحت تیمار سرب و کنترل، تقریباً از الگوی مشابهی تبعیت می­کند.

 

شکل۱ – نمودار مقایسه منحنی رشد جلبک سبز
  Chlorella Vulgaris در روزهای مختلف تحت تیمار غلظت‌های مختلف سرب، در شرایط پایه آزمایش . داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای معیار (SE) می‌باشد

به طوری که پس از گذراندن فاز کندی یا تاخیری رشد (lag phase) که در حدود 4 روز پس از اعمال تنش ادامه داشت، وارد مرحله لگاریتمی رشد (logarytmic phase) می‌شوند با این تفاوت که با افزایش غلظت سرب تا تیمار 80 میلی گرم در لیتر نمونه‌ها به ترتیب با شیب ملایم تر و در مدت زمان کوتاهتری وارد مرحله ایستایی رشد (stationary phase) شدند. در شکل 2 نمودار نرخ رشد جلبک سبز تک­یاخته­ای vulgarisChlorella در گروه کنترل و نمونه­های تحت تیمار، نشان داده شده است. نرخ رشد در نمونه کنترل 221/۰ است و در نمونه های تحت تیمار 10و 50 میلی­گرم در لیتر سرب  به 153/ و 03/0 کاهش می‌یابد و در تیمار 80 میلی­گرم در لیتر سرب این مقدار منفی می‌شود و به 06/0- میرسد. در مقایسه نرخ رشد  بین تیمار 50 و 80 با کنترل اختلاف معناداری مشاهده شد.

 

شکل 2- نرخ رشد جلبک سبز تک یاخته­ای vulgarisChlorella تحت تیمار غلظت‌های مختلف سرب. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای معیار (SE) می‌باشد. و حروف متفاوت نشان دهنده وجود اختلاف معنی دار بین نمونه­ها بر اساس مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن و حروف مشترک بیانگر عدم وجود اختلاف معنی دار در سطح احتمال p≤0.05 می‌باشند. 

در بررسی میزان کلروفیلa و کلروفیل کل،
Chlorella vulgaris (شکلهای 3و4)  تحت تیمارهای مختلف سرب، غلظتmg/l ۱۰ الگوی تقریباً مشابه ای را نسبت به کنترل تا روز دوازدهم نشان می‌دهد و اختلاف معنی دار بین این تیمار با کنترل از روز دوازدهم به بعد مشاهده شد. در غلظتmg/l ۵۰ و ۸۰ تفاوت معنی‌داری نسبت به کنترل از روز چهارم به بعد در محتوای کلروفیل a و کلروفیل کل مشاهده شد و  با نزدیک شدن به روزهای انتهایی بیشترین میزان کاهش کلروفیل در تیمار mg/l  ۸۰  مشاهده شد.

 

شکل 3- روند تغییرات روزانه میزان کلروفیلa  بر حسب پیکوگرم بر میلی لیتر در جلبک Chlorella.sp  در غلظت های مختلف سرب. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای معیار (SE) می‌باشد و حروف متفاوت نشان دهنده وجود اختلاف معنی‌دار بین نمونه­ها بر اساس مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن و حروف مشترک بیانگر عدم وجود اختلاف معنی دار در سطح احتمال p≤0.05 می‌باشند. 

 

شکل 4- روند تغییرات روزانه میزان کلروفیل کل بر حسب پیکوگرم بر میلی لیتر در جلبک Chlorella.sp  در غلظت‌های مختلف سرب. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای معیار (SE) می‌باشد و حروف متفاوت نشان دهنده وجود اختلاف معنی‌دار بین نمونه­ها بر اساس مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن و حروف مشترک بیانگر عدم وجود اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال p≤0.05 می‌باشند. 

محتوای مالون‌دی‌آلدهید (MDA) ریز جلبک کلرلا تحت غلظت‌های مختلف سرب، 16 روز پس از اعمال تنش بررسی و نتایج در شکل(5) نشان داده شده است.

 

شکل 5- تغییرات غلظت MDA در جلبک سبز تک یاخته‌ای vulgarisChlorellaدر پاسخ به غلظت‌های مختلف نیترات سرب. پس از 16 روز تنش. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای معیار (SE) می‌باشد و حروف متفاوت نشان دهنده وجود اختلاف معنی‌دار بین نمونه­ها بر اساس مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن و حروف مشترک بیانگر عدم وجود اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال p≤0.05 می‌باشند. 

نتایج نشان داد که، محتوای مالون‌دی‌آلدهید (MDA) در تیمار ۱۰ میلی گرم در لیتر تفاوت معنی‌داری با شاهد نشان نداد، ولی در بقیه تیمارها در مقایسه با کنترل تفاوت معنی‌دار بود و محتوای MDA افزایش یافت. بیشترین میزان مالون‌دی‌آلدهید در غلظت80 میلی گرم در لیتر و کمترین مقدار در کنترل مشاهده شد. مقدار سرب جذب شده از محیط توسط جلبک کلرلا بعد از 16 روز قرار گرفتن در معرض 3 غلظت مختلف سرب(10، 50 و 80 میلی گرم بر لیتر) در شکل 6 آورده شده است. نتایج نشان می دهد که با افزایش غلظت فلز سرب در محیط کشت میزان جذب این فلز توسط جلبک کلرلا افزایش یافته است.

 

شکل 6- مقدار فلزسرب جذب شده بر حسب میلی گرم در گرم وزن خشک جلبک سبز تک یاخته‌ای vulgarisChlorellaدر پاسخ به غلظت‌های مختلف نیترات سرب در محیط (10، 50 و 80 میلی گرم بر لیتر) پس از 16 روز تنش. داده‌ها میانگین سه تکرار ± خطای معیار (SE) می‌باشد و حروف متفاوت نشان دهنده وجود اختلاف معنی‌دار بین نمونه­ها بر اساس مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن و حروف مشترک بیانگر عدم وجود اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال p≤0.05 می‌باشند. 

بحث

موجودات فتوسنتزکننده به ترکیبات فلزی بسیار حساس هستند. اثرات یونهای فلزی بر گیاهان شامل اختلال در بسیاری از کارکردهای فیزیولوژیکی مانند جذب آب، تنفس، جذب مواد معدنی، فتوسنتز(19) کاهش سنتز DNA،  تغییر در قابلیت نفوذپذیری غشا و مهار یا فعال سازی فعالیت های آنزیمی می باشد(3). در مطالعه حاضر، با توجه به نمودار رشد (شکل 1) با آن که کلیه نمونه­های تحت تیمار سرب روند رشد لگاریتمی را در منحنی‌های رشد خود نشان دادند،  اما شدت و مدت زمان آن در مقایسه با شاهد کاهش یافت. همچنین بررسی نتایج حاصل از شکل(2) نشان داد که با افزایش تنش سرب تا تیمار 80 نرخ رشد به معنای تولید ماده خشک در نمونه‌های تحت تیمار در مقایسه با نمونه‌های شاهد به طور معناداری کاهش یافت. لذا در مجموع می­توان گفت که تنش حاصل از غلظت­های مختلف سرب تا 80  میلی گرم در لیتر در این تحقیق سبب کاهش رشد و تولید ماده خشک (بیومس) در ریز جلبک کلرلا گردید نتایج آزمایش حاضر با مطالعات Zhang و همکاران در مورد اثرات بلند مدت و کوتاه مدت تنش فلز سنگین سرب برروی دو گونه‌ی جلبک کلرلا C.vulgarisو C.protothecoides مطابقت نشان داد. آن‌ها با اندازه-گیری نرخ رشد براساس جذب نوری در طول موج 680 نانومتر گزارش نمودند که نمونه‌های تحت تیمار در غلظت‌های پایین و متوسط سرب رفتاری مشابه با کنترل نشان می‌دهند. در حالی که غلظت‌های بالا (50 و 80) میلی‌گرم بر لیتر اثربازدارندگی قابل توجه ای بر رشد هر دوگونه ریز جلبک کلرلا نشان داده است(25).به نظر می­رسد که کاهش رشد القا شده به وسیله‌ی فلزات سنگین می‌تواند نتیجه‌‌‌‌‌ی دخالت فلز با فرایندهای متابولیکی مرتبط شده با نمو طبیعی، مخصوصا سنتز پروتئین باشد، زیرا فعالیت برخی از آنزیم‌های مهم به وسیله‌ی اتصال فلز با گروه‌های آمینو آزاد، کربوکسیل وگروه‌های جانبی مهار می‌شود (13). تحقیقات نشان داده است که یون سرب می‌تواند مقلد خوبی برای نقش کلسیم-کالمودولین باشد و به نظر می‌رسد یکی دیگر از دلایل کاهش رشد، اختلال در جذب عناصر ضروری نظیر کلسیم و منیزیم به دلیل وجود یون سرب در محیط باشد که به نوبه خود متابولیسم سلول‌ها را تحت تاثیر قرار می‌دهد (24). سرب همچنین می‌تواند به اسیدهای نوکلئیک متصل شده و بدین ترتیب سبب تجمع و تراکم کروماتین و تثبیت مارپیچ مضاعف DNA و به دنبال آن مانع از فرایند رونویسی و ترجمه گردد (22). با این همه به نظر می­رسد ریز جلبک کلرلا قادر به تحمل سرب در غلظت­های مورد استفاده دراین تحقیق باشد. زیرا به رشد و تکمیل چرخه زندگی خود (شکل 1) هر چند با کاهش نرخ رشد (شکل 2) در مقایسه با شاهد ادامه داده است.

کلروفیل ها به عنوان رنگیزه‌ اصلی در فتوسنتز، مسئول دریافت انرژی نورانی و تبدیل آن به انرژی شیمیایی در زنجیره انتقال الکترون می‌باشد. از آنجا که میزان و شدت فتوسنتز تحت تاثیر تنش‌های محیطی تغییر می‌کند ، انتظار می‌رود که تغییراتی در میزان کلروفیل a وپروتئین‌هایی که در ساختار کلروپلاست و در ارتباط با کلروفیل a می‌باشند، ایجاد شود (2). شکل(3و4) ارتباط مابین غلظت سرب و محتوای کلروفیلa  و کلروفیل کل را در روزهای (4، 8 ،12، 21،18) نشان می‌دهد همان‌طور که مشاهده می‌شود سنتز کلروفیل در جلبک Chlorella vulgaris با افزایش غلظت سرب بتدریج کاهش پیدا می‌کند و با افزایش زمان این اختلاف بیشتر می‌شود. در مقایسه با گروه کنترل، سطح پایین‌تر سرب  به سختی منجر به اختلال در سنتز کلروفیل می‌شود، این در حالی ست ‌که درغلظت‌های 50 و80 میلی گرم بر لیتر تفاوت بسیار معناداری با گروه کنترل دیده می‌شود. یافته های این پژوهش با نتایج قیصری و همکاران در سال 1394 بر روی گیاه  (Ocimum basilicum L.). همسو می باشد. آنها مشاهده کردند که غلظت های سرب باعث کاهش چشمگیر رنگیزه های فتوسنتزی در این گیاه می شود. این کاهش می تواند به دلیل بازدارندگی مراحل مختلف بیوسنتز رنگیزه ها توسط سرب باشد (4).  به نظر می­رسد سرب بر سنتز هم در ساختمان  سیتوکروم های زنجیره انتقال الکترون میتوکندری و یا در  حلقه پورفیرینی کلروفیل ها از طریق رقابت با Fe+2 و Mg+2  اثر دارد (6). همچنین کاهش محتوای کلروفیل ممکن است به علت افزایش  فعالیت کلروفیلاز به وسیله‌ی اختلال در غشاء کلروپلاست و غیر فعال شدن نقل و انتقال الکترون به فتوسیستم Ι ایجاد شود (20).

غشای سلولی یکی از اولین مکان‌هایی است که سمیت با فلزات سنگین روی آن اثر می‌گذارد . آسیب غشای سلولی از طریق تولید مالون‌دی‌آلدهید (MDA) که یک محصول و شاخص تنش و تولید رادیکال‌های آزاد در سلول ها  است، مشخص می‌گردد(17) و نشان می‌دهد که مکانیسم های آنتی‌اکسیدانی نتوانسته‌اند به طور کامل از پیشرفت و افزایش فرایند پراکسیداسیون لیپدی غشاها، در سلول‌های تحت تنش جلوگیری کنند (17). شکل (5) نشان داد که غلظت MDA در تیمار ۱۰ میلی­گرم در لیتر تفاوت معناداری با کنترل نداشت، ولی با افزایش غلظت سرب تا تیمار 80  میلی گرم بر لیتر، محتوای MDA در نمونه­های تحت تیمار به طور معنا داری افزایش یافت که  این  نتیجه افزایش MDA در غلظت های 50 و 80 میلی گرم برلیتر سرب، می‌تواند نشان دهنده  اعمال تنش سلولی بر جلبک کلرلا باشد. داخم در سال 1390 مشاهده نمود که با افزایش غلظت سرب در محیط کشت تا غلظت 80 میکرو مولار به مدت 20 روز، محتوای مالون دی آلدهید (MDA) جلبک دونالیلا در مقایسه با شاهد به طور معنا دار ی افزایش یافت. بنابراین افزایش مالون دی آلدئید بیانگر افزایش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشا در شرایط تنش فلزات سنگین از جمله سرب است. افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشا نیز می تواند به علت تجمع انواع فعال اکسیژن از جمله پراکسیدهیدروژن تحت تنش سرب باشد (3).

میزان فلز جذب شده توسط جلبک در غلظتهای مختلف سرب،  می تواند کاهش رشد و محتوای کلروفیل و افزایش MDA را توجیه کند. به نظر می رسد افزایش میزان سرب در محیط کشت تا در غلظت 50 و 80 باعث افزایش این فلز درون جلبک شده و ایجاد تنش می کند.

نتایج این آزمایش به طور کلی نشان می‌دهد که که قرار گرفتن کلرلا در غلظتهای 50 و 80 میلی گرم بر لیترسرب در سلول‌های جلبک کلرلا تنش ایجاد می‌کند و باعت کاهش رشد و محتوای کلرفیلی آن می‌گردد، اما جلبک با وجود این غلظت بالا همچنان توانایی رشد خود را (اگرچه ضعیف تر از گروه کنترل) حفظ می‌کند و می‌تواند چرخه زندگی خورد را کامل کند. با توجه به این مقاومت بالا و پتانسیل خوب جلبک کلرلا در جذب فلز سنگین سرب و دیگر فلزات سنگین (5، 9، 13، 14، 23) و با رشد و تکثیر مصنوعی جلبک کلرلا در پسآبهای صنعتی، می توان از سمیت این پسآب ها کاست و از انتشارآلاینده ها به محیط زیست جلوگیری کرد.

1- داخم، م. (1390) بررسی فعالیت سیستم آنتی اکسیدانی جلبک تک سلولی Dunaliella sp. تحت تنش فلز سنگین سرب. پایان نامه کارشناسی ارشد.

2- زمانی ن.(1385) اثر جیوه بر رشد، تکثیر و سیستمهای آنتی‌اکسیدانی در جلبک Dunaliella Tertiolecta پایان نامه کارشناسی ارشد.

3- قلیچ س. ، زرین کمر ف. ، نیکنام و. (1394)  بررسی میزان انباشتگی سرب و تاثیر آن بر فعالیت آنزیم پراکسیداز، محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در مرحله جوانه زنی در گیاه یونجه (Medicago sativa L.). پژوهش‌های گیاهی. 28(1): 164-174.

4- قیصری س.، سعید نعمت پور ف.، صفی پور افشار ا. (1394) اثر سالیسیلیک اسید و آسکوربیک اسید بر محتوای رنگیزه های فتوسنتزی و فعالیت برخی آنزیم های آنتی اکسیدان در گیاه ریحان (Ocimum basilicum L.) تحت تنش سرب. پژوهش‌های گیاهی. 28(4): 814-825 .

 

5-Akhtar N., Saeed A., Iqb M., (2003) Chlorella sorokiniana immobilized on the biomatrix of vegetable sponge of Luffa cylindrica: a new system to remove cadmium from contaminated aqueous medium. Bioresource Technology. 88(2):163–165.

6- Borowitzka M.A. (1998) Limits to growth. In: Wong Y.S. & Tam N.F.Y. (eds.), Wastewater treatment with algae. Springer-Verlag, Berlin. 203-226.

7- Carfagna S., Lanza N. G., Salbitani A. B., Sorbo S., Vincenza V. (2013) Physiological and morphological responses of Lead or Cadmium exposed Chlorella sorokiniana (Chlorophyceae). Springer plus. 2: 147.

8- Eijckelhoff C., Dekker J.P. (1997) A routine method to determine the chlorophyll a, pheophytin a, and β-carotene contents of isolated photosystem II reaction center complexes. Photosynth Res. 52: 69–73.

9- El-Naas M.H., Al-Rub F. Ashour A., Al Marzouqi M. (2007) Effect of competitive interference on the biosorption of lead (II) by Chlorella vulgaris. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification. 46:1391-1399.

10-Heath R.L., Packer L.(1968) Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Archives in Biochemistry and Biophysics.125:189–198.

11- Lam P. K., Wut S. P. F., Chan A. C. W., Wu, R. S. S. (1999) Individual and Combined Effects of Cadmium and Copper on the Growth Response of Chlorella vulgaris. Environmental Toxicology.14: 347- 353.

12- Leganes, F., Sanchez, E. &, Fernandez-Vaiente, E. (1987), Effect of indoleacetic acid on growth and dinitrogen fixation in cyanobacteria. Plant Cell Physiol. 28:529-533.

13- Maznah W. O. W., Al-Fawwaz A.T., Surif M.(2012) Biosorption of copper and zinc by immobilised and free algal biomass, and the effects of metal biosorption on the growth and cellular structure of Chlorella sp. and Chlamydomonas sp. isolated from rivers in Penang, Malaysia. Journal of Environmental Sciences. 24(8): 1386–1393

14- Mehta S. K., Singh A., Gaur J. P. (2002) Kinetics of adsorption and uptake of Cu2+ by Chlorella vulgaris: influence of pH, temperature, culture age, and cations. Journal of Environmental Science and Health Part A. 37(3): 399–414.

15- Muhaemin M. (2004) toxicity and bioaccumulation of lead in Chlorella and Dunaliella. Journal of Coastal Development.8: 27-33.

16- Nicholas S. F. and Gary j. j. (1981) Effect of copper and zinc on growth, morphology, and metabolism of asteronella japonica (Cleve). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 51: 37-56.

17- Ohkawa H., Ohishi N.,Yagi K. (1979) Assay for lipid peroxidation in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal. Biochem. 95: 351-358.

18- Pinto E., Sigaud-kutner C.S., LehaoA., Okamoto S.,MorseD.,Colepicolo P. (2003) Heavy metal induced oxidative stress in algae. J.phycol. 39: 1008-1018.

19- Qian H., Li J., Li S., ChenW., Sheng G., Sheng D., Liu W., Zhengwei F. (2009) Combined effect of copper and cadmium on Chlorella vulgaris growth and photosynthesis-related gene transcription. Aquatic Toxicology. 94: 56–61.

20- Sen A.K. and Mondal N.G. (1987) Salvinia natan-as the scavenger of Hg (II). Water Air Soil Pollut.34: 439-46.

21- Shakya P. R. (2007) Nickel Adsorption by Wild type and Nickel Resistant Isolate of Chlorella sp. Pak. J. Anal. Environ. 8: 86 – 90.

22- Valley L. B., Ulmer, D. D. (1972). Biochemical effects of mercury, cadmium and lead. Ann Rev. Biochem. 41:91-128.

23- Tam Y.,Wong S., Simpson G. (1998) Removal of copper by free and immobilized microalga, Chlorella vulgaris. In: Wastewater Treatment with Algae (Wong S, Tam Y, eds.). Springer-Verlag and Landes Bioscience, Berlin. 17–35.

24- Visiki L., and Rachi, j.w. (1992) Ultrastructural changes in Dunaliella minuta following acute and chronic exposure to copper and cadmium. Archive of Environmenta toxicology. 23: 420-425.

25- Zhang W., Xiong B., Lin C., Kuangfei L., Xinhong C., Huasong Bi., Meijin G., Weiliang W. (2013). Toxicity assessment of Chlorella vulgaris and following exposure to Pb (II). Journal of Enviromental toxicology and pharmacology. 36: 51-57