نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

استادیار، دانشکده کشاورزی سنقر، دانشگاه رازی، کرمانشاه، ایران

چکیده

امروزه تکنیک‌های کشت بافت گیاهی به عنوان ابزار مفیدی برای ایجاد تنوع ژنتیکی به منظور بهنژادی محصولات کشاورزی و همچنین تولید گیاهان عاری از ویروس به کار می‌روند. هدف از این پژوهش ارائه یک روش مؤثر بر کالوس‌زایی و باززایی در گیاه سیب‌زمینی می‌باشد. این تحقیق به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با 3 تکرار اجرا شد. در این تحقیق به‌منظور ایجاد کالوس، ریزنمونه‌های مختلف (ساقه، برگ و غده) سه رقم سیب‌زمینی (سانته، آگریا و مارفونا) روی محیط کشت MS حاوی غلظت‌های مختلف 2-4,D، NAA، IAA، IBA و پیکلورام به تنهایی و به همراه کینتین و BAP قرار داده شدند. محیط کشت MS حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر 2-4,D با غلظت‌های مختلف کینتین به‌عنوان بهترین محیط‌های کشت کالوس‌زایی انتخاب شدند. واکنش سه رقم سیب‌زمینی به محیط کشت القاء کالوس متفاوت بود بدین صورت که رقم مارفونا بیشترین و رقم سانته کمترین میزان کالوس‌زایی را در کلیه محیط‌های کشت القاء کالوس داشتند. کالوس‌ها به‌طور مطلوب روی محیط کشت MS حاوی 3 میلی‌گرم در لیتر 2-4,D و 5/0 میلی‌گرم در لیتر اسید جیبرلیک باززا و در محیط حاوی 2 میلی‌گرم در لیتر IBA ریشه‌دار شدند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The Effect of Growing Conditions Explants and Growth Regulators on Callus Induction Potato Plant (Solanum tuberosum L.)

نویسنده [English]

  • Massomeh Amerian

Razi University, Kermanshah, I.R. of Iran

چکیده [English]

Plant tissue culture techniques are a useful tool to increase the genetic diversity, crop production and production of plants virus free. The purpose of this study was reached to a useful method for callus induction and regeneration in potato plant. The experiment was set up based on factorial experiment and completely randomized design (CRD) with 3 replications. In this study, in order to induce callus, different explants (stem, leaf and tuber) of three potato (Sante, Agria and Marfona) were placed on MS medium containing various concentrations of 2,4-D, NAA, IAA and pikloram alone or combined with kinetin and BAP. MS medium containing 2 mg L-1 2,4-D with different concentrations of kinetin was selected as the best callus-inducing medium. Response of three cultivars potato to medium callus induction was different so that the Marfona highest and Sante lowest callus induction were in all callus induction media. The calluses were regenerated in media containing 3 mg L-1 BAP combined with 0.5 mg L-1 GA3. Regenerated shoot were transferred to root-inducing media containing 2 mg L-1 IBA and, plantlets with roots were transferred to pots containing sterilized soil four weeks after culture.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Callus
  • Kinetin
  • Tissue culture and 2
  • 4- D

تاثیر شرایط رشد ریز نمونه و تنظیم کننده­های رشد بر القاءکالوس گیاه سیب­زمینی (Solanum tuberosum L.)

معصومه عامریان

ایران، کرمانشاه، دانشگاه رازی، دانشکده کشاورزی سنقر

تاریخ دریافت:14/6/95           تاریخ پذیرش: 1/11/96

چکیده

امروزه تکنیک­های کشت بافت گیاهی بعنوان ابزار مفیدی برای ایجاد تنوع ژنتیکی بمنظور بهنژادی محصولات کشاورزی و همچنین تولید گیاهان عاری از ویروس به کار می­روند. هدف از این پژوهش ارائه یک روش مؤثر بر کالوس­زایی و باززایی در گیاه سیب­زمینی می­باشد. این تحقیق بصورت آزمایش فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با 3 تکرار اجرا شد. در این تحقیق بمنظور ایجاد کالوس، ریزنمونه­های مختلف (ساقه، برگ و غده) سه رقم سیب­زمینی (سانته، آگریا و مارفونا) روی محیط کشت موراشیک و اسکوگ (MS) حاوی غلظت­های مختلف 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2-4,D)، NAA)) Naphthaleneacetic acid، (IAA) Indole-3-acetic acid، Indole-3-butyricacid (IBA) و پیکلورام بتنهایی و بهمراه کینتین و (BAP) 6-Benzylaminopurine قرار داده شدند. محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم در لیتر 2-4,D با غلظت­های مختلف کینتین بعنوان بهترین محیط­های کشت کالوس­زایی انتخاب شدند. واکنش سه رقم سیب­زمینی به محیط کشت القاء کالوس متفاوت بود بدین صورت که رقم مارفونا بیشترین و رقم سانته کمترین میزان کالوس­زایی را در کلیه محیط­های کشت القاء کالوس داشتند. کالوس­ها بطور مطلوب روی محیط کشت MS حاوی 3 میلی­گرم در لیتر 2-4,D و 5/0 میلی­گرم در لیتر اسید جیبرلیک باززا و در محیط حاوی 2 میلی­گرم در لیتر IBA ریشه­دار شدند.

واژه­های کلیدی: 2-4,D، سیب­زمینی، کالوس، کشت بافت و کینتین

نویسنده مسئول، تلفن: 09183377466، پست الکترونیکی: Masoomehamerian@yahoo.com

مقدمه

 

سیب­زمینی چهارمین گیاه زراعی مهم بعد از گندم، برنج و ذرت در جهان است. نامگذاری سال 2008 بعنوان سال سیب­زمینی توسط سازمان ملل بیانگر اهمیت این محصول زراعی می­باشد که هم اکنون غذای اصلی بسیاری از مردم دنیا است (16). سیب­زمینی یک منبع غنی از انواع کربوهیدرات­ها، پروتئین­ها و ویتامین­ها می­باشد (25).

افزایش جمعیت جهان و کاهش منابع تولید فرآورده­های گیاهی و دامی در جهان یک مشکل جدی و اساسی است که دانشمندان را در دهه­های اخیر به این فکر ترغیب نموده تا با استفاده از شیوه­های جدید در حفظ محیط زیست و عدم تغییر بنیادی در طبیعت، دست به تولید بهتر و بیشتر محصولات گیاهی بزنند. یکی از این روش­های مدرن، استفاده از فناوری کشت سلول و بافت­های گیاهی است که از این طریق می­توان نسبت به تکثیر گیاهان مختلف اعم از صنعتی، دارویی، مرتعی و کشاورزی اقدام نمود. علاوه بر این، کشت بافت گیاهی می­تواند بستر مناسبی جهت حفظ و نگهداری گونه­ها و ژنوتیپ­های مادری و یا درحال انقراض طبیعت بعنوان منابع با ارزش ژرم پلاسم محسوب شود. همچنین فناوری کشت سلول و بافت­های گیاهی طی سال­های اخیر به گونه­ای توسعه یافته که هم اکنون در سطح گسترده برای انتقال ژن­های مطلوب بویژه ژن­های ایجادکننده مقاومت نسبت به آفات و بیماری­های گیاهی، مورد استفاده قرار می­گیرد. بدیهی است اصلاح گیاهان به روش سنتی، علاوه بر وقت­گیر بودن در بسیاری از موارد امکان پذیر نیست در حالیکه فناوری جدید کشت سلول و بافت گیاهی، این راه را بخوبی هموار ساخته و به پیش می­برد (2). در واقع توسعه­ی روش­های نوین از جمله کشت بافت گیاهی در سال­های اخیر منجر به پیشرفت­های زیادی در زمینه­ی کشاورزی شده است. روش­های متداول اصلاح نباتات (تلاقی و انتخاب) با بسیاری از مشکلات و موانع مواجه است. بکارگیری روش­های نوین کشت بافت بعنوان مکمل روش­های مرسوم در این راستا نوید بخش بوده است، به گونه­ای که امروزه علاقمندی به تکنیک­های کشت بافت و توانایی آن در اصلاح و بهبودی گیاهان به­صورت یک موضوع جهانی در آمده است (8). 

طی 20 سال گذشته تحقیقات زیادی روی کشت­های درون شیشه­ای سیب­زمینی انجام شده است و روش­های زیادی پیشنهاد شده اما همه­ی نتایج بدست آمده در اندام­زایی و جنین­زایی موفق آمیز نبوده است (9). البته کشت بافت بعنوان یک ابزار قابل عرضه برای تکثیر و تنوع ژنتیکی محصول سیب­زمینی مفید شناخته شده است که می­تواند در برنامه­های اصلاحی سیب­زمینی نقش مهمی را ایفا کند (28). القاء کالوس در بسیاری از ریزنمونه­ها مانند برگ، میانگره، گره، ساقه و غده­ی سیب­زمینی با موفقیت انجام شده است (20). نوع و غلظت تنظیم کننده­های رشد، میزان ساکارز، ژنوتیپ، نوع ریز نمونه و شرایط نگه­داری زیرنمونه­ها بر میزان کالوس­زایی تاثیر گذار می­باشد (15، 16 و 20).

سیب­زمینی از مهمترین محصولات غذایی انسانی است و از اهمیت اقتصادی ویژه­ای برخوردار می­باشد. بدلیل اهمیت این محصول بهینه سازی سیستم کشت بافت و انتقال ژن به آن ضروری است. کشت گیاه سیب­زمینی در شرایط محیط کشت می­تواند زمینه­ی مناسبی برای بهبود ژنتیکی سیب­زمینی را فراهم نماید. تاکنون گزارشاتی در زمینه کالوس­زایی و بازایی گیاه از بافت­های مختلف سیب­زمینی ارائه شده است. دست­یابی به یک سیستم تولید کالوس و شاخساره در انجام مطالعات مهندسی ژنتیک بر روی گیاهان اولین اقدام ضروری است در نتیجه نقش افزایش کالوس­زایی و باززایی شاخساره از قطعات برگ، ساقه و غده­ی سیب­زمینی اهمیت بسیاری دارد. توجه به نتایج بدست آمده توسطAbd Elaleem و همکاران (2009) بیشترین میزان تشکیل کالوس از محیط MS حاوی 3 میلی­گرم بر لیتر 2-4,D همراه با 2 میلی­گرم بر لیتر BAP بدست آمد. محیط کشت MS حاوی 5 میلی­گرم بر لیتر TDZ (Thidiazenon) بهترین محیط کشت باززایی بود. کالوس­های باززا شده در محیط ریشه زایی حاوی 5 میلی­گرم بر لیتر IBA ریشه­دار شدند. در نهایت گیاهچه­های ریشه­دار شده پس از سازگاری به محیط گلخانه منتقل شدند (6). تحقیقاتKumlay & Ercisli و همکاران (2015) نشان داد که میزان تولید کالوس در ریزنمونه های ساقه بیشتر از برگ بود. بیشترین درصد کالوس­زایی در محیط کشت MS حاوی 3 میلی­گرم بر لیتر BAP و 2 میلی­گرم بر لیتر NAA بدست آمد. محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم بر لیتر BAP همراه با 25/0 میلی­گرم بر لیتر GA3 بیشترین درصد باززایی مشاهده شد (21). Khalafalla و همکاران (2010) 100% تشکیل کالوس را از ریز نمونه­های غده سیب­زمینی در محیط کشت حاوی 1 میلی­گرم بر لیتر 2-4,D بدست آوردند. کالوس­ها روی محیط کشت MS حاوی 5 میلی­گرم بر لیتر TDZ بیشترین تعداد شاخه را تولید کردند. ریشه­دار شدن در محیط کشت MS حاوی 1 میلی­گرم بر لیتر IBA صورت گرفت. گیاهچه­های ریشه­دار شده بعد از رشد کافی و سازگار شدن به شرایط آرمایشگاهی به گلخانه منتقل شدند و گیاهچه­ها رشد نرمال داشتند (18). با توجه به نتایج تحقیقات انجام شده نوع ریز نمونه، نوع هورمون­های رشدی و غلظت آنها بر میزان کالوس زایی تاثیر زیادی دارند. تحقیقات زیادی در ارتباط با کشت بافت سیب­زمینی انجام شده است اما تاکنون پژوهشی با این وسعت انجام نشده است که همزمان تاثیر هورمون­های گیاهی اکسین و سیتوکنین بر کالوس­زایی آن مورد بررسی قرار گردد. لذا در این تحقیق غلظت هورمونی متفاوتی جهت بررسی میزان کالوس­زایی قطعات ریزنمونه­های ساقه، برگ و غده در 3 رقم آگریا، مارفونا و سانته از ارقام مهم زراعی سیب­زمینی که در شرایط درون شیشه­ای وگلخانه­ای رشد یافته­اند جهت بهینه­سازی محیط کشت کالوس­زایی این ارقام مورد بررسی قرار گرفت. درنتیجه با استفاده از آن بتوان بعنوان یک الگو در مطالعات کشت بافت و انتقال ژن در این ارقام اقدام نمود.

مواد و روشها

تهیه مواد گیاهی: غده­های سه رقم سیب­زمینی آگریا، مارفونا و سانته از مرکز تحقیقات سیب­زمینی و پیاز کرج تهیه گردیدند. تعداد 10 غده از هر رقم در شرایط گلخانه برای تولید اندام­های هوایی در گلدان­های بطول و قطر 25 سانتی­متری حاوی نسبت مساوی خاک زراعی، کود دامی پوسیده و ماسه کاشته شدند.

جهت آزمایش­های کشت بافت، از محیط کشت پایه MS استفاده گردید (22). اسیدیته همه محیط­های تهیه شده 8/5 بود که با سود یک نرمال و اسیدکلریدریک 1/0 نرمال قبل از اضافه کردن آگار (8/0% آگار- آگار) برای محیط کشت جامد، و قبل از اتوکلاو کردن برای محیط کشت مایع، تنظیم گردید. نمونه­ها در دمای 2±25 درجه سانتیگراد و تحت 16 ساعت فتوپریود با استفاده از لامپ فلورسنت سفید نگه­داری شدند.

ایجاد کالوس: در این آزمایش از ریزنمونه­های مختلف شامل ساقه، برگ و غده گیاهان سیب­زمینی رشد یافته در شرایط درون شیشه­ای و گلخانه استفاده گردید (شکل 1).

 

 

 

شکل 1- گیاه سیب­زمینی رشد کرده در شرایط درون شیشه­ای (سمت راست) و گلخانه (سمت چپ)


ایجاد کالوس از گیاهان رشد کرده در گلخانه: چهار ماه پس از کشت غده­ها، اندام­های ساقه و برگ از گیاهان در حال رشد در گلخانه برداشت گردیدند و بهمراه تعدادی از غده­های کشت نشده جهت رفع گرد و غبار موجود در سطح آن­ها با آب شهری شسته شدند. غده­ها قبلاً توسط یک برس کاملاً تمیز زیر آب شسته و پوست کن شده بودند. نمونه­ها سپس در محلول حاوی دو قطره مایع ظرفشویی بمدت 5 دقیقه قرار داده و با آب شسته شدند. بمنظور ضدعفونی نمودن نمونه­ها از محلول هیپوکلریت سدیم (سفیدکننده تجاری 5 درصد) به غلظت 1، 2 و 5/2 درصد به­ترتیب برای ریزنمونه­های برگ (15 دقیقه)، ساقه (15 دقیقه) و غده (30 دقیقه) استفاده گردید که به­دنبال آن بلافاصله چهار بار توسط آب مقطر استریل و هر بار بمدت 5 دقیقه جهت زدودن هیپوکلریت سدیم شستشو داده شدند.

ریزنمونه­های آماده کشت از هر سه رقم بطریقی که قبلاً شرح داده شد، در داخل هود با استفاده از اسکالپل و پنس استریل، به قطعات 5/1-1 سانتی­متر (ریزنمونه­های ساقه)، 1×1 سانتی­متر (ریزنمونه­های برگ) و 5/7×5 میلی­متر (ریزنمونه­های غده) تقسیم گردیدند و 4 قطعه از هر ریزنمونه در یک پتری­دیش و روی محیط کشت جامد با ترکیبات هورمونی مختلف (جدول 1، مرحله مقدماتی) برای تشکیل کالوس قرار داده شدند. پس از مسدود نمودن مجدد پتری­دیش­ها با پارافیلم، محیط­های کشت بهمراه ریزنمونه­های کشت شده به اتاقک رشد با شرایطی که قبلاً گفته شد منتقل گردیدند.

 

جدول 1- تیمارهای هورمونی اعمال شده در مرحله مقدماتی آزمایش*

تیمار

غلظت تنظیم کننده­های رشد

1

1، 5/1، 2 و 5/2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D

2

2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D + 4/0، 6/0، 8/0 و 1 میلی­گرم در لیتر کینتین

3

2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D + 2/0، 4/0، 5/0 و 1 میلی­گرم در لیتر BAP

4

5/0 میلی­گرم در لیتر BAP + 2 میلی­گرم در لیتر NAA

5

5/0 میلی­گرم در لیتر BAP + 2 میلی­گرم در لیتر IAA

6

5/0 میلی­گرم در لیتر BAP + 2 میلی­گرم در لیتر پیکلورام

7

5/0 میلی­گرم در لیتر کینتین+ 2 میلی­گرم در لیتر NAA

8

5/0 میلی­گرم در لیتر کینتین+ 2 میلی­گرم در لیتر IAA

9

5/0 میلی­گرم در لیتر کینتین + 2 میلی­گرم در لیتر پیکلورام

                                  *: کلیه غلظت­های هورمونی در محیط کشت پایه MS به­کار برده شدند.

 

پس از 3 هفته، کالوس­های تولید شده در اطراف ریزنمونه­های برگ، ساقه و غده جدا و روی محیط کشت MS با همان ترکیب هورمونی واکشت شدند.

ایجاد کالوس از ریزنمونه­های گیاهان درون شیشه­ای: برای تولید گیاهان درون شیشه­ای ابتدا محیط کشت MS حاوی 30 گرم ساکارز و 8 گرم آگار بدون تنظیم کننده رشد تهیه و در ظروف استریل درب­دار توزیع گردید. سپس قطعاتی از ساقه گیاهانی که در گلخانه رشد یافته بودند، بطول 1 سانتی­متر همراه با یک جوانه جانبی جدا و در 2 درصد هیپوکلریت­سدیم بمدت 15 دقیقه ضدعفونی گردیدند و 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. پس از برش و جدا کردن بافت­های مرده، ریزنمونه­ها بعنوان قلمه به ظروف حاوی محیط­های کشت فوق­الذکر انتقال داده شدند. 4 ریزنمونه در هر ظرف کشت گردیدند و همه ظروف در اتاق رشد با دمای 24 درجه سانتیگراد و فتوپریود 16 ساعت نگه­داری شدند. پس از 3 هفته، از جوانه­های جانبی قلمه­ها، شاخه­هایی رشد نمود که برای افزایش تعداد گیاهچه، مجدداً از آن­ها قلمه تهیه گردید و به محیط کشت 2/1 MS منتقل شد.

پس از 1 ماه، از اندام­های مختلف گیاهان رشد یافته در شرایط درون شیشه­ای (ساقه و برگ) بمنظور ایجاد کالوس استفاده گردید. ساقه و برگ این گیاهان نیازی به استریل کردن نداشتند و شیشه­های حاوی این گیاهان به هود منتقل شده و در داخل هود با استفاده از اسکالپل و پنس استریل ریزنمونه­های از ساقه و برگ این گیاهان بطول 4-3 میلی­متری (ریزنمونه­های ساقه) و 3×3 میلی­متری (ریزنمونه­های برگ) تهیه گردید. 8 الی 10 قطعه از هر ریزنمونه در یک پتری­دیش و روی محیط کشت جامد با ترکیبات هورمونی مختلف (جدول 1، مرحله مقدماتی) برای تشکیل کالوس قرار داده شدند. پس از مسدود نمودن مجدد پتری­دیش­ها با پارافیلم، محیط­های کشت بهمراه ریزنمونه­های کشت شده به اتاقک رشد با شرایطی که قبلاً گفته شد، منتقل گردیدند.

میزان تشکیل کالوس در هر 9 تیمار هورمونی از طریق مشاهدات عینی طی 6 هفته در گیاهان گلخانه­ای و درون شیشه­ای مورد بررسی قرار گرفت و فقط نتایج بهترین تیمارهای هورمونی و ریزنمونه در ایجاد کالوس مورد تجزیه آماری واقع شدند.

در مرحله دوم آزمایش تولید کالوس، آزمایش­ها به­صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی و در 4 تکرار اجرا شدند که در آن­ها اثر رقم (در 3 سطح) و ترکیب هورمونی (در 4 سطح برای هر یک از تیمارهای هورمونی 1 و 2 در جدول 1) روی درصد کالوس­زایی مورد مطالعه قرار گرفت. تجزیه و تحلیل داده­ها نیز با استفاده از نرم افزار (1/9) SAS انجام شد و برای مقایسه میانگین داده­ها از آزمون چند دامنه­ای دانکن (P≤0.05) استفاده شد.

باززایی گیاه: کالوس­هایی (کالوس­های حاصل از ریز نمونه­های ساقه) که روی محیط کالوس­زایی با ترکیب هورمونی 5/1 و 5/2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 4/0 و 8/0 میلی­گرم در لیتر کینتین همراه با 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D قرار داشتند روی محیط­های مختلف باززایی (جدول 2) منتقل شدند.

 

جدول 2- تیمارهای هورمونی استفاده شده در محیط­های کشت باززایی*

تیمار

غلظت و نوع هورمون

1

2 میلی­گرم در لیتر BAP + 3/0 میلی­گرم در لیتر جیبرلیک اسید

2

3 میلی­گرم در لیتر BAP + 5/0 میلی­گرم در لیتر جیبرلیک اسید

3

2 میلی­گرم در لیتر BAP + 02/0 میلی­گرم در لیتر جیبرلیک اسید + 15/0 میلی­گرم در لیتر NAA

4

4/0 میلی­گرم در لیتر IAA + 8/0 میلی­گرم در لیتر کینتین + 4/0 میلی­گرم در لیتر BAP + 4/0 میلی­گرم در لیتر جیبرلیک اسید

5

25/2 میلی­گرم در لیتر BAP + 186/0 میلی­گرم در لیتر NAA

          *: کلیه غلظت­های هورمونی در محیط کشت پایه­ی MS به­کار برده شدند.


نتایج

ایجاد کالوس: درصد کالوس­زایی با شمارش تعداد ریزنمونه­هایی که کالوس تولید کرده بودند نسبت به کل ریزنمونه­ها (4 ریزنمونه در گیاهان گلخانه­ای و 8 ریزنمونه در گیاهان درون شیشه­ای به­دلیل تولید کالوس کمتر روی ریزنمونه­های گیاهان درون شیشه­ای و خشک شدن بیشتر این ریزنمونه­ها روی محیط کشت کالوس­زایی نسبت به ریزنمونه­های گیاهان گلخانه­ای) محاسبه گردید. با توجه به مشاهدات اولیه، از بین ترکیبات هورمونی فوق فقط ترکیبات 1 و 2 از جدول 1 مرحله مقدماتی با ریزنمونه ساقه در کالوس­زایی موفق بودند.

میزان کالوس­زایی در ساقه گیاهان درون شیشه­ای: در تمامی ریزنمونه­های ساقه گیاهان درون شیشه­ای بعد از 15–10 روز روی محیط­های کشت حاوی تیمارهای هورمونی 1 و 2 (جدول 1) کالوس مشاهده شد.

نتایج تجزیه واریانس جدول 3 از نظر درصد تشکیل کالوس از ریزنمونه­های ساقه گیاهان درون شیشه­ای روی محیط کشت حاوی غلظت­های مختلف 2,4-D نشان داد که رقم و سطح هورمون اثر معنی­داری (در سطح 1%) روی تشکیل کالوس داشتند. اثر متقابل این دو فاکتور روی میزان تشکیل کالوس معنی­دار نبود.

 

جدول 3- نتایج تجزیه واریانس درصد کالوس­زایی از ریزنمونه­های ساقه سه رقم سیب­زمینی رشد یافته در شرایط درون شیشه­ای

 

 

میانگین مربعات

منابع تغییرات

درجه آزادی

درصد تشکیل کالوس (تیمار هورمونی 1)

درصد تشکیل کالوس (تیمار هورمونی 2)

رقم

2

** 3/58

 **6/24

سطح هورمون

3

 **4/40

 **8/27

رقم × سطح هورمون

6

ns 7/0

 **45

اشتباه آزمایش

36

5/3

1/1

       **و ns: بترتیب تفاوت معنی­دار در سطح احتمال1% و تفاوت غیر معنی­دار،

 

رقم مارفونا دارای بیشترین درصد تشکیل کالوس بود که اختلاف معنی­داری با رقم آگریا نشان نداد و سانته دارای کمترین درصد تشکیل کالوس بود (شکل 3).

 

شکل 3- تاثیر رقم بر درصد کالوس­زایی سه رقم سیب­زمینی در شرایط درون شیشه­ای (آزمون چند دامنه­ای دانکن (P≤0.05))

در ترکیب هورمونی حاوی غلظت­های مختلف 2,4-D بیشترین میزان تشکیل کالوس در تیمار 5/2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D مشاهده شد که اختلاف معنی­داری با تیمار 1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D نداشت و کمترین آن از 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D بدست آمد که اختلاف معنی­داری با تیمار 5/1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D نشان نداد (شکل­های 4 و 10).

 

شکل 4- درصد تشکیل کالوس از ساقه گیاهان درون شیشه­ای سیب­زمینی در حضور 4 غلظت مختلف 2,4-D (آزمون چند دامنه­ای دانکن (P≤0.05))

نتایج تجزیه واریانس (جدول 3) درصد تشکیل کالوس از ریزنمونه­های ساقه گیاهان درون شیشه­ای روی محیط کشت حاوی 2,4-D و غلظت­های مختلف کینتین نشان داد که رقم، سطح هورمون و اثر متقابل آن­ها اثر معنی­دار (سطح 1%) روی تشکیل کالوس داشتند. اثر متقابل رقم و سطح هورمون نشان داد که مارفونا در محیط حاوی 4/0 و 8/0 میلی­گرم در لیتر کینتین و رقم سانته با 4/0 میلی­گرم در لیتر کینتین دارای بیشترین درصد کالوس هستند که میزان تشکیل کالوس در آن­ها 100 درصد بود و اختلاف معنی­داری را با رقم مارفونا و 1 میلی­گرم در لیتر کینتین نشان ندادند. درحالیکه رقم سانته و 6/0 میلی­گرم در لیتر کینتین دارای کمترین میزان درصد کالوس بود که اختلاف معنی­داری در با رقم آگریا با 1 و 6/0 میلی­گرم در لیتر کینتین نشان نداد (شکل­های 5 و 11).

 

شکل 5- درصد تشکیل کالوس از ساقه­ی گیاهان درون شیشه­ای سیب­زمینی در حضور 4 غلظت مختلف کینتین همراه با 2 میلی گرم در لیتر 2,4-D (آزمون چند دامنه­ای دانکن (P≤0.05))

میزان کالوس­زایی در ساقه گیاهان گلخانه­ای: در تمامی ریزنمونه­های ساقه گیاهان گلخانه­ای بعد از 15-20 روز روی محیط­های کشت حاوی تیمارهای هورمونی 1 و 2 (جدول 1)، کالوس مشاهده گردید.

براساس نتایج تجزیه واریانس (جدول 4) رقم و سطح هورمون اثر معنی­داری (در سطح 1 درصد) بر میزان تشکیل کالوس از ریزنمونه­های ساقه گیاهان گلخانه­ای در محیط کشت حاوی غلظت­های مختلف 2,4-D داشتند. اثر متقابل رقم و سطح هورمون بر میزان تشکیل کالوس
معنی­دار نبود.

 

جدول 4- نتایج تجزیه واریانس درصد کالوس­زایی ریزنمونه ساقه ارقام سیب­زمینی رشد کرده در شرایط گلخانه

 

 

میانگین مربعات

منابع تغییرات

درجه آزادی

درصد تشکیل کالوس (تیمار هورمونی 1)

درصد تشکیل کالوس (تیمار هورمونی 2)

رقم

2

 **9/43

 **4/13

سطح هورمون

3

 **8/23

 **1/25

رقم × سطح هورمون

6

ns 5/0

ns 2

اشتباه آزمایش

36

2/4

2

      **و ns: بترتیب تفاوت معنی­دار در سطح احتمال1% و تفاوت غیر معنی­دار

 

رقم مارفونا دارای بیشترین درصد تشکیل کالوس بود که اختلاف معنی­داری با رقم آگریا نشان نداد و رقم سانته دارای کمترین درصد تشکیل کالوس بود (شکل 6). هم­چنین غلظت 5/1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D دارای بیشترین میزان تشکیل کالوس بود که اختلاف معنی­داری با 1 میلی­گرم در لیتر 2,4-D نشان نداد. غلظت 5/2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D دارای کمترین میزان تشکیل کالوس بود که اختلاف معنی­داری با 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D مشاهده نشد (شکل­های 7 و 10).

b

 

شکل 6- درصد تشکیل کالوس در سه رقم سیب­زمینی در سطوح مختلف 2,4-D (آزمون چند دامنه­ای دانکن (P≤0.05))

طبق نتایج تجزیه واریانس (جدول 4) رقم و سطح هورمون اثر معنی­داری (در سطح 1 درصد) روی میزان تشکیل کالوس از ریزنمونه­های ساقه گیاهان گلخانه­ای در محیط کشت حاوی 2,4-D به­علاوه غلظت­های مختلف کینتین داشتند. اثر متقابل بین رقم و سطح هورمون بر میزان تشکیل کالوس معنی­دار نبود.

مقایسه میانگین­ها نشان داد که رقم­های مارفونا و سانته به­ترتیب دارای بیشترین و کمترین درصد تشکیل کالوس بودند که رقم مارفونا اختلاف معنی­داری با رقم آگریا نشان نداد (شکل 8).

 

شکل 7- درصد تشکیل کالوس از ساقه گیاهان گلخانه­ای سیب­زمینی در حضور 4 غلظت مختلف 2,4-D (آزمون چند دامنه­ای دانکن (P≤0.05))

 

شکل 8- درصد تشکیل کالوس در سه رقم سیب­زمینی در سطوح مختلف کینتین همراه با 2 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D (آزمون چند دامنه­ای دانکن (P≤0.05))

بیشترین درصد تشکیل کالوس در تیمار هورمونی 8/0 میلی­گرم در لیتر کینتین مشاهده شد که اختلاف معنی­داری با 4/0 میلی­گرم در لیتر کینتین نشان نداد و کمترین آن در 6/0 میلی­گرم در لیتر کینتین بود که اختلاف معنی­داری با 1 میلی­گرم در لیتر کینتین نداشت (شکل­های 9 و 11).

شکل 9- درصد تشکیل کالوس در ساقه گیاه سیب­زمینی در سطوح مختلف کینتین همراه با 2 میلی­گرم بر لیتر  2,4-D(آزمون چند دامنه­ای دانکن (P≤0.05))

باززایی: کالوس­هایی که روی محیط کالوس­زایی در محیط جامد با ترکیب هورمونی 5/1 و 5/2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 8/0 میلی­گرم در لیتر کینتین همراه با 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D قرار داشتند روی هیچیک از ترکیبات هورمونی باززایی شاخه تولید نکردند، اما کالوس­های تولید شده از تیمار هورمونی 4/0 میلی­گرم در لیتر کینتین همراه با 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D روی محیط کشت باززایی حاوی 3 میلی­گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی­گرم در لیتر اسید جیبرلیک پس از 6 هفته شاخه تولید کردند که در برخی تکرارها ریشه نیز دیده شد (شکل 12). با توجه به اینکه تولید شاخه فقط روی محیط کشت باززایی حاوی 3 میلی­گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی­گرم در لیتر اسید جیبرلیک صورت گرفت و در بقیه تیمارهای هورمونی (جدول 2) باززایی مشاهده نشد درنتیجه امکان تجزیه آماری درصد باززایی در هر سه رقم سیب­زمینی (آگریا، سانته و مارفونا) امکان پذیر نبود و فقط نتایج باززایی گزارش شد.

گیاهچه­های باززایی شده در هر سه رقم پس از 6 هفته که طول شاخه­ها تقریباً 2 سانتی­متر بود به محیط­های ریشه­زایی حاوی سطوح مختلف IBA (2، 5/2 . 3 میلی­گرم بر لیتر) منتقل شدند و فقط در محیط حاوی 2 میلی­گرم در لیتر IBA ریشه­زایی صورت گرفت (شکل 13).

گیاهچه­های ریشه­دار شده به گلدان­های حاوی ماسه استریل منتقل و در شرایط اتاق رشد نگه­داری شدند. دو هفته بعد در شرایطی که بطور طبیعی به رشد خود ادامه می­دادند به گلدان­های حاوی خاک باغچه استریل انتقال داده شدند (شکل 14). گیاهچه­ها در این مرحله بطور مطلوبی به رشد طبیعی خود ادامه دادند.

 

 

 

شکل 10- کالوس­زایی در محیط کشت MS حاوی 5/2 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D (سمت چپ: گیاهان رشد کرده در شرایط گلخانه-سمت راست: گیاهان رشد کرده در شرایط درون شیشه­ای) .A: مارفونا. B: سانته و C: آگریا

 

 

شکل 11- کالوس­زایی در محیط کشت MS حاوی 2 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D در ترکیب با 8/0 میلی­گرم بر لیتر کینیتن (سمت چپ: گیاهان رشد کرده در شرایط گلخانه- سمت راست: گیاهان رشد کرده در شرایط درون شیشه­ای).A: مارفونا. B: سانته و C: آگریا

 

 

شکل 12- سه رقم سیب­زمینی باززایی شده در محیط کشت حاوی3 میلی­گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی­گرم در لیتر اسید جیبرلیک 6 هفته پس از کشت. A: مارفونا، B: آگریا و C: سانته

 

A

 

B

 

شکل 13- رشد گیاهچه­ها در محیط ریشه­زایی حاوی 2 میلی­گرم در لیتر IBA پس از 4 هفته. A: آگریا. B: مارفونا و C: سانته

 

 

شکل 14 - انتقال گیاهچه­ها به خاک. A: آگریا. B: مارفونا و C: سانته


بحث

با توجه به مشاهدات عینی میزان کالوس­زایی از ریز نمونه­های ساقه بیشتر از برگ و غده بود. همچنین بیشتر ریزنمونه­های برگ و غده روی محیط کشت خشک شدند و کالوس­هایی که از این ریز نمونه­ها تولید می­شدند بافت برم و آبکی داشتند. لذا همانطور که قبلا ذکر گردید برای ادامه آزمایشات از ریزنمونه­های ساقه در هر سه رقم و از تیمارهای هورمونی 1 و 2 (جدول 1) استفاده شد.

بطور کلی نتایج نشان داد که درصد کالوس­زایی گیاهان درون شیشه­ای بیشتر از گیاهان گلخانه­ای است که با نتایج آزمایشات Carputo و همکاران (1995) در مورد سیب­زمینی مطابقت دارد. بنظر می­رسد به­دلیل اینکه نمونه­های استفاده شده از گیاهان درون شیشه­ای قبلاً در این شرایط سازگار بوده و رشد مطلوبی داشته­اند توانستند در تولید کالوس موفقیت بیشتری نشان دهند از طرف دیگر این نمونه­ها احتیاج به ضدعفونی نداشته­اند که خود بعنوان عاملی تنش­زا جهت استفاده در محیط درون شیشه­ای بحساب می­آید. جهت دستیابی به موفقیت­های کاربردی، بررسی رقم­های متعلق به یک گونه گیاهی و نوع پاسخ آن­ها به سیستم­های کشت بافت ضروری است (11). شرایط رشد ریزنمونه مورد استفاده یکی از فاکتورهای مؤثر در نوع پاسخ سلول گیاه به شرایط درون شیشه­ای است (16 و 17) که مطابق نتایج بدست آمده از این تحقیق است.

گیاهان مختلف بسته به نوع ژنوتیپ خود پاسخ­های متفاوتی به شرایط کشت بافت می­دهند (4). مطالعات انجام شده روی گیاهان مختلف وابستگی پاسخ گیاه به ژنوتیپ را کاملا مورد تایید قرار داده است. بنابراین انتظار می­رود ژنوتیپ­های مختلف در پاسخ به یک سیستم کشت بافت واکنش­های متفاوتی نشان دهند. واکنش ریزنمونه­های سه رقم به تیمارهای هورمونی (تیمارهای هورمونی 1 و 2 جدول 1) متفاوت بود، همچنین بیشترین درصد تشکیل کالوس در رقم مارفونا و کمترین آن در رقم سانته مشاهده شد که این بدلیل تفاوت ژنتیکی بین رقم­ها است که Shamima و همکاران (2003) و Iqbal و همکاران (2016) به نتایج مشابهی در بررسی کالوس­زایی ارقام مختلف سیب­زمینی دست یافتند (26 و 16).

با توجه به اینکه روش­های مختلفی جهت القاء کالوس در گیاه سیب­زمینی وجود دارد ولی بطور کلی تفاوت اصلی بین آنها مربوط به نوع و غلظت تنظیم کننده­های رشد گیاه است بطوریکه در تحقیق انجام شده، کاربرد 2,4-D به تنهایی یا در ترکیب با کینتین در ریز نمونه­های ساقه­ی گیاه سیب­زمینی بیشترین تاثیر را در القاء کالوس داشت که با نتایج Abdul Jaleel و همکاران (2007) مطابقت دارد (7). تشکیل کالوس بدون هورمون کینتین نشان داد که وجود کینتین برای تولید کالوس ضروری نیست، اما کینتین سبب افزایش درصد کالوس­زایی شده و زمان تشکیل کالوس را کاهش می­دهد (5 و 23). همچنین نتایج آزمایش­های Dhingramk و همکاران (1991) نشان داد که بیشترین میزان تشکیل کالوس در ریزنمونه­های سیب­زمینی در محیط کشت حاوی کینیتن است که با نتایج آزمایش­های حاضر که بیشترین درصد کالوس­زایی در محیط­های حاوی کینتین بود، مطابقت دارد (12). هورمون 2,4-D بهترین اکسین برای القاء کالوس در تک لپه­ای­ها و حتی دو لپه­ای­ها می­باشد (16). غلظت 2,4-D بر زمان آغازش کالوس، درصد کالوس­زایی، بافت کالوس و رنگ کالوس تاثیر گذار است (18 و 19). اثر علظت­های مختلف اکسین و سیتوکنین بر روی القاء کالوس در چند ژنوتیپ سیب­زمینی توسط Andreea و همکاران (2009) و Iqbal و همکاران (2016) مورد بررسی قرار گرفت (10 و 16). بر اساس نتایج بدست آمده بیشترین درصد کالوس­زایی در 5/0 میلی­گرم بر لیتر BAP و 1 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D مشاهده شد. تشکیل کالوس از ریزنمونه­های ساقه (2-1 سانتی­متر) رقم سیب­زمینی  Cara روی محیط کشت MS با ترکیب هورمونی 2/3 میلی­گرم در لیتر IAA، 1 میلی­گرم در لیتر کینتین و 5/0 میلی­گرم در لیتر 2,4-D پس از 20 روز توسط Ahloowalia (2004) گزارش شده است (9). القاء کالوس از 7 رقم سیب­زمینی در محیط نیمه­جامد MS حاوی 20-1 میکرومول پیکلرام توسطSteven  و همکاران (1990) صورت گرفت (27).  SabbahوTal  (1990) موفق به تولید کالوس از ریزنمونه­های برگ گیاه سیب­زمینی رقم Desire در محیط کشت MS حاوی 5 میلی­گرم در لیتر 2,4-D و 5/0 میلی­گرم در لیتر کینتین شدند (24). Dhingramk و همکاران (1991) و امیدی و شاه­پیری (1383) بیشترین رشد کالوس­های سیب­زمینی را در محیط کشت حاوی کینتین مشاهده کردند (12 و 2). تحقیقات Edriss و همکاران (1996) روی کالوس­زایی سیب­زمینی نشان داد که استفاده از اکسین بالا سبب تولید کالوس شده و سیتوکینین در این رابطه هیچ نقشی ندارد. در محیط حاوی سیتوکینین به تنهایی، تولید شاخه بدون تشکیل کالوس مشاهده گردید. غلظت کم اکسین و نیز غلظت متوسط سیتوکینین منجر به تولید گیاه کامل از نوک مریستم بدون تشکیل کالوس می­شود. غلظت بالای کینتین (2 میلی­گرم در لیتر) و غلظت کم NAA (01/0 میلی­گرم در لیتر) کالوس و شاخه تولید می­کند. در حالیکه سطح بالای BAP و غلظت کم IBA تشکیل کالوس را بدون تشکیل شاخه تحریک می­کند (13).

کالوس­های تولید شده از ریز نمونه­های ساقه و تیمار هورمونی 4/0 میلی­گرم در لیتر کینتین همراه با 2 میلی­گرم در لیتر 2,4-D روی محیط کشت باززایی حاوی 3 میلی­گرم در لیتر BAP و 5/0 میلی­گرم در لیتر اسید جیبرلیک پس از 6 هفته شاخه تولید کردند که در برخی تکرارها ریشه نیز دیده شد. Carputo و همکاران (1995)، 11 رقم از سیب­زمینی­های رشد کرده در شرایط گلخانه را برای القاء کالوس­زایی مورد بررسی قرار دادند. ریزنمونه­ها روی محیط کشت MS حاوی 25/0 میلی­گرم در لیتر کینتین و 5 میلی­گرم در لیتر 2,4-D کالوس تولید کردند. پس از 4 هفته کالوس­ها به محیط کشت باززایی حاوی 186/0 میلی­گرم در لیترNAA  و 25/2 میلی­گرم در لیتر BAP و 5 میلی­گرم در لیتر اسید جیبرلیک منتقل شدند (11). باززایی شاخه از برگ­ها و دمبرگ­های سه رقم سیب­زمینی
(Posma, Folva, Oleva) توسط Hanson و همکاران (1999) بررسی گردید. ریزنمونه­ها از گیاهان رشد کرده در گلخانه تهیه و برای تولید کالوس روی محیط کشت  MSحاوی 05/9 میکرومول 2,4-D و 40 میکرومول IBA کشت شدند. کالوس­ها سپس برای باززایی به محیط کشت MS با ترکیب هورمونی 28/2 میکرومول اسید جیبرلیک و 1 میکرومول BAP منتقل شدند (14). Khatun و همکاران (2003) از میان­گرة گیاهچه­های سیب­زمینی رقم Diamant  رشد یافته در شرایط درون شیشه­ای برای تولید کالوس استفاده کردند و باززایی روی محیط کشت نیمه­جامد MS با ترکیبات مختلف تنظیم کننده­های رشد شامل 2,4-D، NAA و IBA به­تنهایی و در ترکیب با BAP صورت گرفت. بیشترین درصد کالوس در محیط کشت حاوی 5/2 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D مشاهده شد. بیشترین درصد تولید شاخه از کالوس با محیط کشت حاوی 5 میلی­گرم در لیتر IBA همراه با 1/0 میلی­گرم در لیتر BAP بدست آمد (19). محیط کالوس زایی و باززایی این محققین مشابه بهترین ترکیب هورمونی بدست آمده در این تحقیق بود. بر اساس نتایج رحیمیان و ربیعی (1392) هورمون کینیتن در مقایسه با  BAPتاثیر بیشتری بر باززایی سیب­زمینی رقم مارادونا داشت (1) که نتایج بدست آمده از این تحقیق مغایرت داشت. شیخی ده­آبادی و جلالی جواران (1390) برای تعیین بهترین نوع ریزنمونه و محیط کشت گیاهی جهت باززایی سیب­زمینی از ریزنمونه­های ساقه و برگ در محیط کشت حاوی سطوح مختلف اکسین و سیتوکنین استفاده کردند. نتایج آنها نشان داد که ریزنمونه­های ساقه در بسیاری از محیط­ها باززا شده و دارای بیشترین درصد باززایی بودند (3) که مشابه نتایج بدست آمده از این تحقیق بود.

براساس نتایج بدست آمده، بطور کلی مشخص نیست که چرا با افزایش مرحله به مرحله غلظت هورمون تولید کالوس نیز با همان روند ادامه نمی­یابد. بدیهی است که واکنش ریزنمونه­ها به غلظت هورمون تحت تأثیر عوامل متعددی است که نتیجه­گیری یکنواخت را با مشکل مواجه می­سازد. در این رابطه مطالعات دقیق در سطح مولکولی و با در نظر گرفتن همه عوامل لازم است تا بطور دقیق به این سؤال پاسخ داد.

نتیجه­گیری کلی

یک پروتوکل برای القاء کالوس در سه رقم سیب­زمینی (آگریا، مارفونا و سانته) بهینه­سازی گردید. با توجه به نتایج بدست آمده بیشترین درصد کالوس­زایی در محیط کشت­های حاوی 5/2 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D و 2 میلی­گرم بر لیتر 2,4-D همراه با 8/0 میلی­گرم بر لیتر کینتین بود. میزان کالوس­زایی 3 رقم سیب­زمینی متفاوت بود. بطوریکه رقم مارفونا بیشترین و رقم سانته کمترین درصد کالوس­زایی را نشان دادند. استفاده ازالقاء کالوس در کشت بافت سیب­زمینی و دستیابی به بهترین محیط القاء کالوس زمینه بهره­گیری از تنوع سوماکلونال و نیز انتقال ژن برای رسیدن به صفات مطلوب را مهیا می­سازد.

1- رحیمیان، ب و ربیعی، م. (1392). بررسی باززایی مستقیم سیب­زمینی (Solanum tuberosum L.) رقم مارادونا. اولین همایش ملی الکترنیکی مباحث نوین در علوم باغبانی.

2- شاه­پیری، آ؛ امیدی، م؛ احمدیان تهرانی، پ و داودی، د. (1383). بررسی کشت بافت و تنوع سوماکلون در سیب­زمینی. مجله علوم کشاورزی ایران، 35 (2): 323-335.

3- شیخی ده­آبادی، م و جلالی جواران، م. (1390). بهینه­سازی باززایی برخی از ارقام پر محصول سیب­زمینی بمنظور انتقال ژن tPA. پایان نامه ارشد، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی.

4- کبیر هاشمی، س.م؛ قنبری، ع.ر و کاشی، عبدالکریم. 1395. اثر تنظیم کننده­های رشد گیاه بر باززایی گیاهچه از پینه دو رقم خربزه (Cucumis melo L.) ایرانی به روش درون شیشه­ای. مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). 29 (1): 168-159.

5- مجتوی، س.ش و امیدی، م. 1395. تاثیر غلظت­های مختلف هورمونی و نوع ریز­نمونه بر کالوس­زایی شقایق ایرانی (Papaver bracteatum). مجله پژوهش­های گیاهی (مجله زیست شناسی ایران). 29(1): 198-191.

 

6- Abd Elaleem, K. G., Modawi, R. S., Khalafalla, M. M. 2009. Effect of plant growth regulators on callus induction and plant regeneration in tuber segment culture of potato (Solanum tuberosum L.) cultivar Diamant. African Journal of Biotechnology, 8(11): 2529-2534.

7- Abdul Jaleel, C., Manivannan, P., Sankar, B., Kishorekumar, A., Gopi, R., Somasundaram, R. & Panneerselvam, S. (2007). Water deficit stress mitigation by calcium chloride in Catharanthus roseus: Effects on oxidative stress, praline metabolism and indole alkaloid accumulation. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 60 (1): 110–116.

8- Afrasiab, H. & Iqbal, J. (2012). Biochemical and molecular characterization of somaclonal variants and induced mutants of potato. Pakistan Journal of Botany, 44(5): 1503-1508.

9- Ahloowalia, B. S. (2004). Plant regeneration from callus culture in potato. Euphytica, 31: 755-759.

10- Andreea, N., Campeanu, G.H., Chriu, N. & Kracsonyi, D. (2009). Effect of auxine and cytokinine on callus induction in Potato (Solanum tuberosum L.) explants. Agricultura-Stiinta Si Practica, Pp: 47-50.

11- Carputo, D., Cardi, T., Chiar, T., Ferraiol, G. & Frusciante, L. (1995). Tissue culture response in various wild and cultivated Solanum germplasm accession for exploitation in potato breeding. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 41: 151-158.

12- Dhingramk, K.H. & Lakhapatin, C.H. (1991). Effect of cytoknins and light on the growth and virus content of potato leaf callus. National Academy Science Letters – India, 14(3): 117–120.

13- Edriss, M.H., Badawy, M.A. & Fathi, S. (1996). Propagation of potato using tissue culture techniaue. Acta Horticulturae, 434: 413-418.

14- Hanson, B., Grattan, S. B. & Fulton, A. (1999). Agricultural salinity and Drainge California University, Davis. P: 160.

15- Haque, A.V., Samad, M.A & Shapla, T.L. (2009). In vitro callus initiation and regeneration of potato. Bangladesh Journal of Agricultural Research, 34(3): 449-456.

16- Iqbal, A.A., Rizwan, A., Mukhtar, Z., Mansoor, S., Mehmood, Z & Asad, S. (2016). Establishment of an efficient and reproducible regeneration system for potato cultivars grown in Pakistan. Pakistan Journal of Botany, 48(1): 285-290.

17- Kalak, H., Hilpus, I. & Virumas, K. (1997). Influence of genotype and growth regulators on morphogenesis processes in carnation shoot apex couture. Scientia Horticulture, 60: 181-189.

18- Khalafalla, M.M., Abd Elaleem, K.G., Rasheid, S. & Modawi, R.S. (2010).Callus formation and organogenesis of potato (Solanum tuberosum L.) cultivar almera. Journal of Phytology, 2(5): 40–46.

19- Khatun, N., Bari, M. A., Islam, R., Huda, S., Rahman, M. H. & Mollah, M. U. (2003). Callus induction and regeneration from nodal segment of potato culture Diamant. Biological science, 3 (12): 1101–1106.

20- Kumar, V., Rashmi, D. & Banerjee, M. (2014). Callus induction and plant regeneration in Solanum tuberosum L. cultivars (Kufri Chipsona 3 and MP-97/644) via leaf explants. International Research Journal of Biological Sciences, 3(6): 66-72.

21- Kumlay, A. M & Ercisli, S. 2015. Callus induction, shoot proliferation and root regeneration of potato (Solanum tuberosum L.) stem node and leaf explants under long-day conditions. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 29(6): 1075-1084.

22- Murashige, T & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15: 473–497.

23- Omidi, M. & Shahpiri, A, (2003). Callus induction and plant regeneration in vitro in potato. Acta Horticulturae, 619: 315-322.

24- Sabbah, S. & Tal, M. (1990). Development of callus and suspension cultures of potato resistant to NaCl and mannitol and their response to stress. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 21: 2.

25- Shahriyar, S., Akram, S., Khan, K., Miya, F. & Sarkar, A.R. (2015). In vitro plant regeneration of potato (Solanum tuberosum L.) at the rate of different hormonal concentration. Asian Journal of Medical and Biological Research, 1(2): 297-303

26- Shamima, N., Monzur, M. & Anjumanra, K. (2003). Induction and evalution of somaconal variation in potato. Biological Science, 3 (2): 183–190.

27- Steven, R.H., Duane, L., Paul. M. & Janice, B. (1990). Intiniation and culture of potato tuber callus tissue with picloram. Plant Growth Regulation, 9(4): 341-345.

28- Steward, F.C. & Caplin, S.M. (1951). A tissue culture from potato tuber: The synergistic action of 2, 4-D and of coconut milk. Science, 111: 518-520.