نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران

2 هیات علمی سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور

3 عضو هیات علمی سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور

4 عضو هیات علمی دانشگاه آزاد، تهران

چکیده

بادام کوهی (Amygdalus scoparia Spach.)، که توزیع گسترده‌ای در مناطق وسیعی از کشور دارد، از ارزش‌های زیست‌محیطی و دارویی برخوردار است که به ‌دلایل مختلف در معرض فرسایش ژنتیکی قرار گرفته و باید احیا شود. تکثیر رویشی پایه‌های برتر از این گونه مستلزم بهینه‌کردن روش‎های مختلف از جمله ریزازدیادی است. در این پژوهش اثر ژنوتیپ‎های مختلف، هورمون‎پاشی قبل از برداشت نمونه از درخت و محیط کشت بر ویژگی‌های مورد نظر در ریزازدیادی، (تعداد جوانه، تعداد شاخساره، طول شاخساره و شادابی نمونه‌ها) مطالعه شدند. بر اساس نتایج حاصل، تاریخ نمونه‎گیری بعد از هورمون‌پاشی و ژنوتیپ‎های مورد استفاده بر همه صفات مطالعه‌‌شده اثر معنی‎داری داشتند. بهترین تاریخ نمونه‎گیری برای ریزازدیادی این گونه از نظر تعداد جوانه‎های جانبی تولیدی ده روز بعد از هورمون پاشی بود. ژنوتیپ‎های سه‌گانه از نظر تولید تعداد جوانه متفاوت بودند و واکنش‎های متفاوتی به‎شرایط عمومی ریز‎ازدیادی نشان دادند. از نظر تعداد شاخه تولیدی، برداشت‎های ده روز بعد از هورمون‎پاشی بیشترین تعداد شاخه را تولید کردند. به‌طور کلی می‌توان گفت که پایه‌های مختلف بادام واکنش‌های متفاوتی به ریزازدیادی نشان دادند و ارائه یک محیط کشت واحدی که برای ژنوتیپ‌های مختلف آثار یکسانی داشته باشد نیاز به مطالعات گسترده‌تری دارد. هورمون‌پاشی قبل از نمونه‌برداری بر روی درختان هدف و در تاریخ مناسب به نوعی می‌تواند این اثر را تعدیل کند. با این حال ژنوتیپ شماره 1 از نظر تعداد جوانه و طول شاخه نتیجه بهتری داشت و محیط کشت DKW هم از برتری‎های نسبی برخوردار بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effective factors on micropropagation of wild almond (Amygdalus scoparia Spach)

نویسندگان [English]

  • somayeh Ezazi 1
  • Hossein Mirzaie-Nodoushan 2
  • Mitra Emam 3
  • Sepideh Kalatejari 4

1 M.Sc., Azad University, Tehran, I.R. Iran

2 Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Forests and Rangelands Research Institute, Tehran, I.R. Iran

3 Agricultural Research, Education and Extension Organization (AREEO), Forests and Rangelands Research Institute, Tehran, I.R. Iran

4 Azad University, Tehran, I.R. Iran

چکیده [English]

Wild almond (Amygdalus scoparia Spach.), with a wide distribution in Iran, is a medicinally and ecologically important plant. This species is exposure to genetic erosion, so it should be considered for reclamation. Vegetative propagation of selected trees of the species depends on optimization of various methods such as micropropagation. In this study, effects of different genotypes, culture medium and application of plant growth regulators on micropropagation characteristics of A. scoparia (number of buds and shoots, shoot length and leaf freshness) were investigated. Results showed that sampling date and type of genotype had significant effects on all characteristics tested. The best sampling date for the highest shoot and lateral axillary bud production was 10 days after application of the plant growth regulator. Different genotypes significantly varied in axillary bud production. As an overall conclusion, different stands of wild almond responded differently to micropropagation. Therefore, presenting a unique culturing medium with similar effects on different genotypes needs more investigation. Application of plant growth regulators on target plants before sampling could alleviates the problem. However, genotype number one was relatively better based on number of buds and shoot length. DKW culturing medium was better than MS medium for propagation of wild almond.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Amygdalus scoparia
  • Asexual propagation
  • Genetic variation
  • micropropagation
  • Plant growth regulator

عوامل مؤثر در ریزازدیادی بادام‌کوهی (Amygdalus scoparia Spach.)

سمیه اعزازی1، حسین میرزایی ندوشن2*،میترا امام2 و سپیده کلاته جاری1

1 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تحصیلات تکمیلی

2 ایران، تهران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور

تاریخ دریافت: 9/4/95                  تاریخ پذیرش: 23/11/95

چکیده

بادام کوهی (Amygdalus scoparia Spach.)، که توزیع گسترده‌ای در مناطق وسیعی از کشور دارد، از ارزش‌های زیست‌محیطی و دارویی برخوردار است که به ‌دلایل مختلف در معرض فرسایش ژنتیکی قرار گرفته و باید احیا شود. تکثیر رویشی پایه‌های برتر از این گونه مستلزم بهینه‌کردن روش‎های مختلف از جمله ریزازدیادی است. در این پژوهش اثر ژنوتیپ‎های مختلف، هورمون‎پاشی قبل از برداشت نمونه از درخت و محیط کشت بر ویژگی‌های مورد نظر در ریزازدیادی، (تعداد جوانه، تعداد شاخساره، طول شاخساره و شادابی نمونه‌ها) مطالعه شدند. بر اساس نتایج حاصل، تاریخ نمونه‎گیری بعد از هورمون‌پاشی و ژنوتیپ‎های مورد استفاده بر همه صفات مطالعه‌‌شده اثر معنی‎داری داشتند. بهترین تاریخ نمونه‎گیری برای ریزازدیادی این گونه از نظر تعداد جوانه‎های جانبی تولیدی ده روز بعد از هورمون پاشی بود. ژنوتیپ‎های سه‌گانه از نظر تولید تعداد جوانه متفاوت بودند و واکنش‎های متفاوتی به‎شرایط عمومی ریز‎ازدیادی نشان دادند. از نظر تعداد شاخه تولیدی، برداشت‎های ده روز بعد از هورمون‎پاشی بیشترین تعداد شاخه را تولید کردند. به‌طور کلی می‌توان گفت که پایه‌های مختلف بادام واکنش‌های متفاوتی به ریزازدیادی نشان دادند و ارائه محیط کشت واحدی که برای ژنوتیپ‌های مختلف آثار یکسانی داشته باشد نیاز به مطالعات گسترده‌تری دارد. هورمون‌پاشی قبل از نمونه‌برداری بر روی درختان هدف و در تاریخ مناسب به نوعی می‌تواند این اثر را تعدیل کند. با این حال ژنوتیپ شماره 1 از نظر تعداد جوانه و طول شاخه نتیجه بهتری داشت و محیط کشت DKW هم از برتری‎های نسبی برخوردار بود.

واژه های کلیدی: بادام کوهی، تکثیر غیر جنسی، تنوع ژنتیکی، ریزازدیادی، تنظیم‌کننده رشد گیاهی

* نویسنده مسئول، تلفن:  02144787286 ،  پست الکترونیکی: nodoushan2003@yahoo.com

مقدمه

 

بادام کوهی (Amygdalus scoparia Spach.) یا بادامک (از خانواده گل سرخیان، Rosaceae) یکی از گونه‌های مهم و فراگیر عرصه‎های طبیعی کشور ماست که در مناطق وسیعی از دامنه‎های کوهستانی و ارتفاعات کشور از جمله در بخش کوهستانی منطقه ایران و تورانی در مرکز، شرق و غرب کشور پراکنش‎ دارد (23). بادام کوهی علاوه بر ارزش‎ زیست‌محیطی، در صنایع دارویی، غذایی و عطرسازی اهمیت دارد. مغز این گونه از بادام به‎دلیل داشتن اسیدهای چرب غیر اشباعی چون اسیداولئیک (حدود 63%) و اسیدلینولئیک (حدود 24%) که ارزش غذائی و پایداری اکسایشی مناسبی دارد نیز اهمیت زیادی یافته است (9). علاوه بر این، از این گونه بدلیل داشتن گل‎های فراوان و خوش‌رنگ می‎توان بعنوان یک گیاه زینتی در منظرسازی هم استفاده کرد (16 و 32). از طرفی، بدلیل ویژگی‎هایی نظیر مقاومت به خشکی، طول عمر بالا و نیز مقاومت فیزیکی بالای چوب و قابلیت رشد در اراضی فقیر، آنها را بعنوان پایه ارقام تجاری بادام معمولی هم توصیه می‎کنند (12 و 32). این گونه در بیش از 80% از مناطق رویشی خشک و نیمه خشک کشور ما قابلیت رویش دارد (1).

امروزه، در شرایطی که مدیریت و ارائه روش‎های مناسب بمنظور احیای عرصه‎های تخریب شده جنگلی در کانون توجه دستگاه‎های تحقیقاتی و اجرایی قرار گرفته است، استفاده از گونه‎های مقاوم به‎شرایط سخت محیطی، بویژه گونه‎های درختی و درختچه‎ای بومی، مناسب‎ترین گزینه‎ها در تأمین این هدف هستند. در بسیاری از عرصه‎های رویشی جنگلی بدلیل شکل و شدت تخریب اکوسیستم، امکان استفاده از گونه‎های درختی فراهم نیست و استفاده از گونه‎های درختچه‎ای، نظیر گونه‌های مختلف بادام، می‎تواند نقش پیش‎آهنگ را در این عرصه‎ها ایفا کند. بادام کوهی دگرگشن بوده و به‎همین دلیل از تنوع ژنتیکی بالایی برخوردار است. برغم اهمیت این گونة درختچه‌ای، بدلایل مختلف در برخی از مناطق کشور ما با خطر فرسایش ژنتیکی مواجه شده است. خشکی و خشکسالی یکی از عوامل عمده خشکیدگی تعداد زیادی از پایه‌های بادام کوهی است. بعبارت دیگر بنظر می‎رسد مهمترین عامل در صدماتی که در برخی از عرصه‎های رویشگاهی این گونه به آن وارد شده است به‎سبب کمبود رطوبت و خشکسالی باشد که باید هرچه زودتر برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه تدابیری اندیشیده شود. تکثیر این گونه بطور عمده از طریق بذر است که حاصل آن تفرق و تنوع ژنتیکی بیشتر است. اگرچه در مواردی از تکثیر غیرجنسی و با استفاده از قلمه و پیوندک هم در تکثیر گونه‎های بادام بویژه گونه اهلی آن استفاده می‎شود. گستردگی توزیع طبیعی گونه‎های بادام وحشی بویژه گونه اسکوپاریا در مناطق مختلف با شرایط متفاوت اقلیمی حاکی از آن است که این گونه قابلیت استفاده بعنوان منبع مقاومت به انواع تنش‎های زیستی و غیر زیستی را دارد و می‎تواند در برنامه‎های اصلاحی بادام اهلی بکار گرفته شود (11). تکثیر پایه‌های برتر و ژنوتیپ‎هایی که در شرایط نامناسب مقاومت مناسبی از خود نشان داده‌اند و پایه‎هایی که با سایر معیارها بعنوان پایه‎های برتر بادام کوهی قلمداد می‌شوند و نیز تکثیر رویشی پایه‎هایی که جهت تشکیل باغ بذر انتخاب شده‎اند مستلزم بهینه‌کردن روش‎های مختلف تکثیر رویشی از جمله ریزازدیادی است. ریزازدیادی بادام در گذشته نیز با اهدافی نظیر تثبیت ژنوتیپ در پایه‌های وحشی بادام، مورد توجه برخی از محققین قرار گرفته است (2). در تکثیر رویشی از طریق ریزازدیادی پایه‎های تلخ و شیرین با استفاده از کشت جوانه و جنین در فصل بهار، امام و همکاران (1392)، محیط کشت DKW (Driver and Kuniyuki Walnut) به همراه هورمون‎های BA، (Benzyladenine)، TDZ (Thidiazuron) و IBA (Indole-3-Butyric Acid) در غلظت‎های 05/0، 1/0 و 5/0 میلی‎گرم در لیتر را برای ریزازدیادی تعیین کردند (2). در تکثیر ژنوتیپ GF677، که بعنوان پایه در بادام اهلی استفاده می‎شود، Kamali و همکاران (2001) بهترین شاخه‎زایی را از جوانه‎های انتهایی و جانبی شاخه‎های جوان و در حال رشد درختان بالغ در فصول مختلف در محیط کشت MS حاوی هورمون‎های BA و IBA بترتیب با غلظت‎های 1 و 01/0 میلی‎گرم در لیتر گزارش کردند (17). در تکثیر رقم Nonpareil‌ از بادام خوراکی محیط کشت MS حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز، 5/0 و 1 میلی‎گرم در لیتر BA و 7 گرم در لیتر آگار موجب تولید تعداد مناسبی شاخه قابل استفاده به ازای هر جنین کشت شده طی 28 روز پس از کاشت شد. بهترین محیط کشت برای تکثیر شاخه‎ها محیط MS و 1 میلی‎گرم در لیتر BA و بهترین محیط ریشه‌زایی نیز محیط 1/2MS به همراه 8 میلی‎گرم در لیتر IAA بود (16).

در یک گونه درختی یا درختچه‎ای ممکن است ژنوتیپ‎های متفاوت واکنش‎های مختلفی به ریزازدیادی نشان دهند. بعبارت دیگر نمی‌توان یک روش ریزازدیادی برای همه ژنوتیپ‎های آن گونه ارائه کرد. دلیل آن هم می‎تواند اثرات متقابلی باشد که بین ژنوتیپ و محیط در گیاهان وجود دارد و در ریزازدیادی سایر گونه‎های درختی و غیر درختی هم تاکنون گزارش شده است (18 و 30).

با توجه به اینکه تشکیل باغ بذر و ذخیره‌گاه‎های ژنتیکی پایه‎های برتر بادام کوهی جهت تکثیر و نگهداری و در نهایت تولید نهال در دستور کار مسئولین و متولیان امر قرار گرفته است، شناسایی پایه‎های برتر و تکثیر غیر جنسی جهت تثبیت ژنوتیپ آنها اهمیت دارد. به‎همین منظور در این پژوهش، ضمن بررسی امکان ریزازدیادی بادام کوهی، اثر ژنوتیپ، هورمون‎پاشی، محیط کشت و اثرات متقابل بین این عوامل بر فرایند ریزازدیادی ‎ مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها

سه پایه سالم بادام کوهی از باغ گیاهشناسی ملی ایران واقع در عرض جغرافیایی35 درجه و 41 دقیقه شمالی و طول جغرافیایی 51 درجه و 19 دقیقه شرقی در ارتفاع 1320 متری از سطح دریا، در اواخر اسفند‌ماه بعنوان شاهد نمونه‎برداری شد. بلافاصله پس از برداشت نمونه شاهد، درختان مورد نظر با استفاده از محلول 1/0 درصد از هورمون IBA هورمون‎پاشی شدند بنحوی که هورمون بصورت کامل شاخه‎های درختان را آغشته کرد. نمونه‌گیری از درختچه‌ها در روزهای 5، 10 و 15 بعد از تیمار هورمون انجام شد. پس از زدودن آلودگی‌های سطحی سرشاخه‌ها با استفاده از مایع ظرفشوئی، برس‌کشی و شستشو با آب معمولی، نمونه‌ها در دوره‌های زمانی مختلف (5 و 8 دقیقه) در معرض هیپوکلریت سدیم 20 درصد (1% کلر فعال) قرار گرفتند و سپس سه بار با آب‌مقطر سترون شستشو شدند. برای کشت اولیه و استقرار ریزنمونه‌ها، که قطعاتی از شاخه‌های گیاه به طول تقریبی 2 سانتی‌متر و دارای دست کم یک جوانه جانبی بود، از محیط کشت DKW (Driver and Kuniyuki, 1984) حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز، 68/0 درصد آگار و ترکیب هورمونی IBA، BA و TDZ با مقادیر بترتیب 01/0، 5/0 و 05/0 میلی‌گرم در لیتر استفاده شد(جدول 1) (8). ریزنمونه‎های سترون شده از هر تیمار در سه تکرار و در هر تکرار در 4 ویال حاوی محیط کشت سترون کاشته شدند. نمونه‎ها در شرایط نوری 16 ساعت نور،  8 ساعت تاریکی و دمای 1±24 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. سی روز بعد از کشت ریزنمونه‌ها، شاخساره‎های مناسب ظاهر شدند که در کشت‎های بعدی جهت پرآوری مورد استفاده قرار گرفتند. در آزمون پرآوری، از دو محیط کشت DKW و MS (Murashige and Skooge, 1962) به صورت جامد (19) با ترکیب‏های هورمونی متفاوت استفاده شد (29). در ساخت محیط کشت MS همه منابع نیتراتی نصف شدند و محیط کشت‌ها بمدت 20 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی‌گراد و فشار یک اتمسفر در داخل اتوکلاو سترون شدند. با انتقال نمونه‎ها از محیط استقرار به محیط پرآوری، پس از 60 روز تعداد شاخه تولیدی، تعداد جوانه‌های جانبی بر روی شاخه‎ها، میانگین طول شاخه‎ها و شادابی مورد ارزیابی قرار گرفت، سپس نمونه‌ها به‎محیط ریشه‎زایی منتقل شدند.

آزمایش در قالب طرح فاکتوریل با سه تکرار انجام شد و تحلیل آماری داده‌ها با استفاده از نگارش نهم از نرم‌افزار SAS صورت گرفت. میانگین‌های صفات در ژنوتیپ‌ها و محیط‎های کشت‌ با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد دسته‌بندی شدند. از نرم‌افزار Excel جهت رسم نمودارها استفاده شد. برای ریشه‌زایی شاخه‌های تولید شده از محیط کشت DKW به همراه 1 میلی‎گرم در لیتر از هورمون IBA استفاده شد.

نتایج

بر اساس نتایج تجزیه واریانس، تاریخ نمونه‎گیری و ژنوتیپ‎های مورد استفاده بر همه صفات مطالعه شده (تعداد جوانه، تعداد شاخساره تولید شده، طول شاخساره و شادابی نمونه‌ها) اثر معنی‎داری داشتند. اثر محیط کشت نیز بر طول شاخه‎های حاصل از ریزازدیادی در سطح 5% معنی‎دار بود. اثرات متقابل برای تمام صفات مورد مطالعه در سطوح پنج و یک‌درصد معنی‎دار شدند. نتایج بررسی تأثیر تاریخ نمونه‌گیری بر تعداد جوانه‌های جانبی ایجاد شده حاکی از معنی‌دار بودن مدت زمان تیمار هورمونی بر تعداد جوانه‌های ایجاد شده بود (دامنه میانگین‌ها بین 32/1 تا 22/3 عدد متغیر بود) به‌طوری که از نظر تعداد جوانه تولیدی، ده روز بعد از هورمون‎پاشی بهترین تاریخ نمونه‎گیری برای ریزازدیادی این گونه تعیین شد. برداشت‎های بعد از هورمون‎پاشی به‌طور معنی‌داری تعداد شاخه بیشتری نسبت به شاهد تولید کردند. در بررسی طول شاخه‌های حاصل مشخص شد که نمونه‌گیری پس از ده روز تیمار با هورمون، بیشترین طول شاخه را موجب شد که البته تفاوت معنی‎داری با شاهد نداشت. هورمون‎پاشی تاثیری بر روی شادابی نمونه‎ها نداشت (جدول 2).

 

 

جدول 1- تیمارهای محیط کشت و تنظیم‌کننده‌های رشد در مرحله پرآوری

هورمون

محیط کشت

BAP (mg.l-1)

2iP (mg.l-1)

IBA (mg.l-1)

TDZ (mg.l-1)

25/0

5/0

25/0

5/0

01/0

05/0

1 – DKW

-

+

-

-

+

+

2 – DKW

-

-

-

+

+

+

3 – DKW

+

-

+

-

+

+

4 – MS (با نصف غلظت نیترات)

-

+

-

-

+

+

5 - MS (با نصف غلظت نیترات)

-

-

-

+

+

+

6 - MS (با نصف غلظت نیترات)

+

-

+

-

+

+

علامت + نشان‌دهنده حضور و – نشان‌دهنده عدم حضور هورمون مورد نظر در محیط کشت است. همه منابع نیتراتی (آمونیم و پتاسیم) در محیط MS نصف شدند.

جدول 2 - میانگین صفات تعداد جوانه، تعداد شاخه، طول شاخه‌ها و شادابی نمونه‌ها در تاریخ‎های مختلف نمونه‎برداری پس از هورمون‎پاشی در همه سطوح ژنوتیپ‎ها و محیط‎های کشت مورد استفاده در ریزازدیادی بادام کوهی.

تاریخ نمونه‌برداری

تعداد جوانه

تعداد شاخه

طول شاخه

(cm)

شادابی برگ

(درجات 1 تا 4)

قبل از هورمون‎پاشی (شاهد)

4/0±

d 32/1

0/1±

b 64/2

6/0±

a 86/1

4/0±

a 71/1

5 روز بعد از هورمون‎پاشی

1/1±

b 51/2

3/1±

a 97/3

6/0±

b 39/1

7/0±

a 82/1

10 روز بعد از هورمون‎پاشی

0/1±

a 22/3

1/1±

a 36/4

2/1±

a 96/1

9/0±

a 89/1

15 روز بعد از هورمون‎پاشی

1/1±

c 98/1

2/1±

a 94/3

6/0±

b 58/1

8/0±

a 87/1

حروف متفاوت در هر ستون بیانگر اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 5% است. داده‌های موجود در جدول به ‌طور متوسط میانگین داده‌های حاصل از 38 واحد آزمایشی است و مقادیر انحراف‌معیار با علامت ± نشان داده شده است.

 

نتایج بررسی اثر ژنوتیپ بر تعداد جوانه‌های جانبی نشان داد که ژنوتیپ‌ها قابلیت متفاوتی در تولید جوانه داشتند. به‌طوری که ژنوتیپ‌های 1 و 2 به مقدار معنی‌داری بیش از ژنوتیپ سوم جوانه جانبی تولید کردند (دامنه تغییرات بین 79/1 تا 65/2 قرار داشت). با این حال ژنوتیپ‌های 2 و 3 بیش از ژنوتیپ 1 شاخه تولید کردند (جدول 3). در مقابل ژنوتیپ 1 از نظر طول شاخه برتر از دو ژنوتیپ دیگر بود و از نظر شادابی، همراه با ژنوتیپ 2، در شرایط بهتری از ژنوتیپ 3 قرار داشتند. میانگین طول شاخه در تیمار شاهد نسبت به سایر تیمارها روند منطقی نشان نداد که می‌تواند ناشی عوامل متعددی باشد. از جمله اینکه قسمت‌های مختلف شاخه اولیه مورد نمونه‌گیری، که ممکن است ضخامت متفاوتی هم داشته‌باشند، می‌توانند واکنش متفاوتی به ریزازدیادی از خود نشان دهند و سبب روند غیر منطقی در میانگین‌های صفات در سطوح یک عامل (در اینجا تاریخ نمونه‌گیری) شوند.

اختلاف مشاهده شده در تعداد جوانه­ها، تعداد شاخه و شادابی برگ در نمونه­های کشت شده در محیط کشت­های مورد بررسی معنی­دار نبود. ولی طول شاخه در محیط‎های کشت DKW میانگین‎های بالاتری داشت (تا بیشترین مقدار 94/1 سانتی‎متر) و در محیط‎های کشت MS میانگین‎ها کاهش یافت ( تا کمترین مقدار 45/1 سانتی­متر) که به طور معنی‌داری کمتر از سایر تیمارها بود (جدول 4).

 

جدول 3 - میانگین صفات تعداد جوانه، تعداد شاخه، طول شاخه‌ها و شادابی نمونه‌ها در ژنوتیپ‎های‎ مختلف در همه سطوح تاریخ‎ نمونه‎گیری و محیط‎ کشت‌های مورد استفاده در ریزازدیادی بادام کوهی.

ژنوتیپ‎های مورد مطالعه

تعداد جوانه

تعداد شاخه

طول شاخه

(cm)

شادابی برگ

(درجات 1 تا 4)

ژنوتیپ شماره 1

2/1±

a 65/2

1/1±

b 26/3

0/1±

a 07/2

7/0±

a 99/1

ژنوتیپ شماره 2

1/1±

a 49/2

0/1±

a 02/4

6/0±

b 46/1

7/0±

a 99/1

ژنوتیپ شماره 3

0/1±

b 79/1

2/1±

a 07/4

6/0±

b 56/1

6/0±

b 59/1

حروف متفاوت در هر ستون بیانگر اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 5% است. داده‌های موجود در جدول به‌طور متوسط میانگین داده‌های حاصل از 50 واحد آزمایشی است و مقادیر انحراف‌معیار با علامت ± نشان داده شده است.

 

جدول 4 - میانگین صفات تعداد جوانه، تعداد شاخه‌ها، طول شاخه‌ها و شادابی نمونه‌ها در محیط‎های کشت مورد استفاده در همه سطوح تاریخ‎ نمونه‎گیری و ژنوتیپ‎‎های مورد مطالعه در ریزازدیادی بادام کوهی.

محیط‎های کشت

تعداد جوانه

تعداد شاخه

طول شاخه

(cm)

شادابی برگ

(درجات 1 تا 4)

DKW

3/1±

a 48/2

2/1±

a 06/4

1/1±

a 94/1

8/0±

a 79/1

DKW

0/1±

a 03/2

9/0±

a 42/3

7/0±

ab 71/1

6/0±

a 60/1

DKW

1/1±

a 13/2

1/1±

a 67/3

5/0±

 b49/1

7/0±

a 70/1

MS (با نصف غلظت نیترات)

2/1±

a 60/2

4/1±

a 96/3

8/0±

ab 78/1

7/0±

a 08/2

MS (با نصف غلظت نیترات)

1/1±

a 09/2

2/1±

a 13/4

8/0±

b 56/1

8/0±

a 00/2

MS (با نصف غلظت نیترات)

3/1±

a 36/2

0/1±

a 54/3

6/0±

 b45/1

9/0±

a 09/2

حروف الفبای متفاوت در ستونها حاکی از اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها در سطح 5% است. داده‌های موجود در جدول به‌طور متوسط میانگین داده‌های حاصل از 25 واحد آزمایشی است و مقادیر انحراف‌معیار با علامت ± نشان داده شده است.

 

 

اثرات متقابل بین تاریخ نمونه‌برداری و محیط کشت‌های مورد استفاده در صفات تعداد جوانه، طول شاخه و شادابی برگ‌ها در سطح یک‌درصد معنی‌دار شدند. اثر متقابل بین ژنوتیپ و محیط کشت هم در تعداد جوانه در سطح یک‌درصد و در بقیه صفات مورد مطالعه در سطح پنج‌درصد معنی‌دار شدند. اثر متقابل ژنوتیپ و تاریخ نمونه‌برداری از درختان، که از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است، در همه صفات در سطح یک‌درصد معنی‌دار شد. بررسی اثر متقابل ژنوتیپ و تاریخ نمونه­برداری نشان داد که بیشترین تعداد شاخه توسط ژنوتیپ شماره 3 در نمونه‎برداری پنج روز پس از هورمون‎پاشی تولید شد (1/5 عدد) در حالی‌که همین ژنوتیپ در نمونه‎برداری در 15 روز پس از هورمون‎پاشی کمترین تعداد شاخه (7/3) را در آن سطح هورمون‌پاشی ایجاد کرد (شکل 2 الف). بهترین تاریخ نمونه‎برداری از نظر تعداد شاخه تولیدی برای ژنوتیپ‌های 1، 2 و 3 به ترتیب 10، 10 و 5 روز پس از هورمون‎پاشی بود. ژنوتیپ 1 در نمونه‌برداری 10 روز پس از هورمون­پاشی، بیشترین تعداد جوانه را ایجاد کرد (6/5 عدد) که نسبت به سایر تاریخ­ها و ژنوتیپ­ها تفاوت معنی‌دار داشت. برداشت نمونه از این ژنوتیپ قبل از هورمون‌پاشی و 5 روز پس از هورمون‌پاشی، کمترین تعداد جوانه (به ترتیب 3/1 و 5/1 عدد) را ایجاد کرد (شکل 2ب). ژنوتیپ‎های 1 و 2، از نظر تعداد جوانه، میانگین عمومی بیش از ژنوتیپ 3 داشتند (جدول 3).

 

 

 

شکل 1 – کشت سرشاخه‌های سه ژنوتیپ متفاوت بادام کوهی در محیط کشت DKW پس از 60 روز؛  ژنوتیپ 1 : الف و ب،  ژنوتیپ‌ 2:  پ و ت،  ژنوتیپ 3: ث و ج.

 

 

 

شکل 2- اثرات متقابل موجود بین تاریخ نمونه‌گیری و ژنوتیپ‌های مورد مطالعه بر اساس صفات تعداد شاخه (الف)، تعداد جوانه (ب)، شادابی نمونه‌ها (ج) و طول شاخه‌ها (د) در ریزازدیادی بادام کوهی.

 

بعبارت دیگر تغییرات میانگین تعداد جوانه­های حاصل از ژنوتیپ‎های مورد بررسی در تاریخ­های مختلف نمونه‎برداری روند ثابتی نداشت. بهترین تیمار هورمونی برای ریزازدیادی این گونه از نظر تولید جوانه جانبی در ژنوتیپ 1، 2 و 3 به ترتیب محیط‌های کشت شماره 5، 1 و 4 بود (داده‌ها نشان داده نشده‌اند). از نظر شادابی هم، ژنوتیپ شماره 1 در نمونه‎برداری 15 روز بعد از هورمون‎پاشی بیشترین شادابی را در نمونه‎های ریزازدیادی شده نشان داد (3/2). در حالی‎که در نمونه‎برداری 5 روز پس از هورمون‎پاشی ژنوتیپ 2 بیشترین شادابی (3/2) را از خود نشان داد (شکل 2 ج). علاوه بر این، در نمونه­های برداشت شده 10 و 15 روز پس از هورمون­پاشی، ژنوتیپ 1 طول شاخه بیشتری نسبت به سایر ژنوتیپ­های مورد بررسی داشت. این حالت در نمونه­برداری 5 روز پس از هورمون­پاشی مشاهده نشد (شکل 2د).

با وجود اثرات متقابل بین عوامل مورد مطالعه در ویژگی‎های بررسی شده، همبستگی‎ مثبت بین ویژگی‎های مذکور مشاهده شد (جدول 5). بعبارت دیگر، به‎غیر از همبستگی تعداد شاخه با طول شاخه که معنی‎دار نبود، سایر همبستگی‎ها در سطوح 5 و 1 درصد معنی‎دار بودند. همه همبستگی‎های دوگانه مشاهده شده مثبت بود به این مفهوم که افزایش یکی موجب افزایش دیگری شد. بعبارت دیگر اگر نمونه‎ای تعداد جوانه بیشتری تولید کرد، همان نمونه ظرفیت تعداد شاخه، طول شاخه و شادابی بیشتری از خود نشان داد. شکل 1 ژنوتیپ‌های سه گانه مورد مطالعه بادام را در مرحله پرآوری نشان می‌دهد.

 

 

جدول 5- همبستگی‎های دوگانه بین صفات مورد مطالعه در نمونه‎های ریزازدیادی شده از سه ژنوتیپ مختلف از بادام کوهی.

صفات مورد مطالعه

تعداد جوانه

طول شاخه

شادابی برگ

تعداد شاخه

تعداد جوانه

1

 

 

 

طول شاخه

**44/0

1

 

 

شادابی برگ

**35/0

*19/0

1

 

تعداد شاخه

**28/0

ns05/0

**20/0

1

                          ** و * : همبستگی معنی‎دار در سطح یک و پنج درصد،  :nsهمبستگی غیر معنی‎دار

 

 

در آزمایش ریشه‌زایی اگرچه بر اساس تجربیات دیگران (2) از یک محیط کشت استفاده شد ولی در این محیط کشت ژنوتیپ‌های مختلف تفاوت آشکاری در ریشه‌زایی از خود نشان دادند. به طوریکه متوسط طول ریشه‌های تولید شده در ژنوتیپ شماره یک 5/2 سانتی‌متر بود در حالی‌که این عدد در ژنوتیپ‌های شماره 2 و 3 به ترتیب 25/1 و 6/1 سانتی‌متر محاسبه شد. این تفاوت در استقرار ژنوتیپ‌ها در محیط کشت و در شرایط گلخانه نیز قابل مشاهده بود (شکل های3 و 4).

بحث

استفاده از ریزازدیادی در تکثیر رویشی گونه‎های جنگلی و استفاده از ژنوتیپ‌های مناسب از یک گونه برای تولید تعداد زیادی نهال، مورد توجه فراوان قرار گرفته است تا هم ژنوتیپ مطلوب تثبیت شود و هم اهدافی چون تشکیل باغ بذر با استفاده از ژنوتیپ‎های منتخب محقق گردد. بیشتر تجربیات در این زمینه مبتنی بر بهینه‎کردن محیط کشت برای تکثیر یک ژنوتیپ یا رقم خاص از یک گونه جنگلی است و بیشترین تأکید هم بر تنظیم املاح معدنی، هورمونها و ویتامین‌های مورد استفاده در محیط کشت بوده است. در کنار این عوامل، عوامل دیگری نظیر هورمون‌های درونی که بشدت تحت تأثیر عوامل بیرونی نظیر نور و دمای محیط هستند در ریزازدیادی تأثیر دارند (3، 6، 14، 26 و 27). نور و هورمون‌های درونی در گیاهان نقش مهمی را در رشد و نمو (28) و تقسیم سلولی در مریستم انتهایی (29) گیاهان ایفا می‎کنند. در هر فصلی از سال، سطح هورمون‌های درونی گیاهان متفاوت است و به‎همین دلیل نمونه‎هایی که در فصل‌های متفاوت از درختان جنگلی گرفته می‎شوند واکنش متفاوتی به ریزازدیادی نشان می‎دهند (25). ولی اینکه با استفاده از هورمون‌پاشی بر روی گیاه بتوان سطح هورمون‌های درونی گیاه را در هر فصلی از سال به‎نحوی تنظیم‎کرد که پاسخ دلخواه را به ریزازدیادی بدهد موضوعی است که تا کنون کمتر به آن پرداخته شده است.

 

 

شکل 3-تفاوت بین ژنوتیپ‌های مختلف بادام کوهی از نظر تعداد و طول ریشه تولید شده. شماره‌های درج شده در شکل نشان‌دهنده شماره ژنوتیپ‌ها هستند

 

 

شکل 4- مرحله استقرار نمونه‌ها در گلدان و در شرایط گلخانه (ژنوتیپ شماره 1).

تنوع ژنتیکی در گونه‎های جنگلی به‎وفور وجود دارد و انتظار می‎رود که به‌نژادگران از این تنوع استفاده بهینه کنند. برای استفاده از بادام کوهی (Amygdalus scoparia Spach) بعنوان پایه در توسعه بادام اهلی، ضمن شناسایی بهترین پایه‎های ممکن، بهترین روش تکثیر و محیط کشت نیز باید مورد استفاده قرار گیرد. این پژوهش، اثر هورمون‎پاشی قبل از نمونه‎گیری از درختان بالغ، تفاوت موجود بین سه پایه انتخابی از این گونه را در پاسخ به دو نوع محیط کشت DKW و MS با چند ترکیب‌ هورمونی متفاوت جهت ریزازدیادی بادام کوهی آشکار کرد. در ضمن با توجه به این‌که در بسیاری از پژوهش‌های انجام شده در گونه‌های گیاهی ثابت شده است که هورمون‌هایی چون BA و TDZ سبب افزایش تعداد شاخه و رشد طول آن می‌شوند (4) از این دو هورمون به‌صورت ثابت در شش ترکیب هورمونی محیط کشت استفاده شد.

لازم بذکر است که در تکثیر رویشی گونه‎های جنگلی از طریق ریزازدیادی همیشه این نگرانی وجود داشته است که تنوع ژنتیکی گونه‌ای که تکثیر می‎شود کاهش یابد و ریزازدیادی سبب یکنواختی درون جمعیت‌ها و کلنی‌های تولیدی شود (5 و 31). از این رو در صورتیکه از این روش تکثیر در تولید نهال هم استفاده می‎شود باید تعداد زیادی ژنوتیپ تکثیر شوند تا تنوع ژنتیکی در حد مطلوبی باقی بماند. در باغ بذر گونه‎های جنگلی، تعداد زیادی ژنوتیپ مطلوب انتخاب شده و با ریزازدیادی یا روش‌های رویشی دیگر نظیر قلمه و پیوند، به باغ بذر منتقل می‌شوند. از این رو در تکثیر ژنوتیپ‎های مطلوب، باید از روشی استفاده شود که خاص یک ژنوتیپ نبوده و بتواند در تکثیر تعداد زیادی از ژنوتیپ‎های همان گونه مورد استفاده قرار گیرد.

ژنوتیپ‌های مطالعه شده، در همه صفات مورد بررسی (تعداد جوانه، تعداد شاخه، طول شاخه و شادابی) پاسخ متفاوتی نشان دادند. تفاوت بین ژنوتیپ‎های مختلف در پاسخ به ریزازدیادی در سایر گونه‌های درختی و درختچه‎ای نیز گزارش شده است (7 و 22). بعنوان نمونه در مطالعاتی که Xing و همکاران (2010) بر روی چندین ژنوتیپ گونه‌ای از رز (Rosa rugosa) انجام دادند تفاوت‌های معنی‎داری از نظر ضریب تکثیر، ارتفاع شاخه‌های تولیدی و شاخص رشد بین ژنوتیپ‌های مختلف از این گونه در واکنش به ریزازدیادی مشاهده شد (30). همینطور در پژوهش انجام شده توسط Rutledge‌ و Douglas (1988)، بر روی 12 کلون تجاری صنوبر مشخص شد که ژنوتیپ‎های مختلف در تشکیل و توسعه ساقه‌ها و استقرار گیاهچه‌ها نسبت به محیط کشت نقش بیشتری داشتند (21). تفاوت ژنوتیپ‌های مختلف در پاسخ به تکثیر از طریق ریزازدیادی در گونه‌ای از پالونیا  (Paulownia fortunei) که یک گونة درختی سریع‌الرشد جنگلی است هم گزارش شده است (24).

اثر سن نمونه گیاهی مورد استفاده نیز ژنوتیپ به‎ژنوتیپ متفاوت است. با توجه به اینکه عوامل محیطی از جمله دما و شدت تابش نور خورشید بر گیاه بالغ در طول روز می‌توانند در تعیین سطح هورمون‌های درونی گیاه تاثیر بگذارند، در انتخاب پایه‌های مورد مطالعه در این پژوهش بسیاری از عوامل محیطی ثابت گرفته شد تا اثر عوامل محیطی تا جای ممکن حذف شوند. از این رو درختان مورد مطالعه، هم‌سن و در یک شیب یکسان عرصه با جهت ثابت انتخاب شدند تا تنها اثر ژنوتیپ‌های مختلف در بروز عوامل درونی مؤثر بر ریزازدیادی تعیین‌کننده باشند. از این‌رو اثر ژنوتیپ بر ویژگی‎های مورد مطالعه بصورت بارز قابل مشاهده بود. ثابت شده است که توفیق در تکثیر از طریق روش‌هایی چون ریزازدیادی به کنترل ریخت‌زایی بستگی دارد که خود تحت تأثیر چندین عامل از جمله عقبه ژنتیکی نمونه، نوع بافت مورد استفاده، ترکیب مواد غذایی محیط کشت، هورمون‌های تنظیم کننده رشد و شرایط محیطی می‎باشد (10، 20 و 24). از این رو با وجود عوامل متعددی که در رشد و توسعه این گونه گیاهی مؤثرند شاید ارائه یک روش واحد جهت تکثیر این گونه ممکن نباشد. از طرفی این گونه از انعطاف‌پذیری خوبی برخوردار است بطوری که با توجه به‎شرایط رویشگاهی خود را تطبیق می‎دهد. بعنوان مثال این گونه در شیب‎های شمالی و دره‎ها و مناطقی که از نور کمتری برخوردارند با گسترش تاج خود سعی در جذب نور بیشتری دارد (13). در مناطقی که میزان نور و رطوبت کمتری وجود دارد و یا وزش بادهای شدید وجود دارد و کم عمق بودن خاک و نظایر آن محیط را نامساعد می‎کند با کاهش تعداد درخت در واحد سطح خود را تطبیق می‎دهد (15). این انعطاف‎پذیری می‌تواند در ویژگی‎های مورد مطالعه در ریزازدیادی نیز مشاهده شود. به همین دلیل تنوع در پاسخ به ریزازدیادی و اثرات متقابل مشاهده شده مورد انتظار بود. اگرچه در این پژوهش محیط‌ها و ژنوتیپ‌های مختلف مورد آزمون قرار گرفتند ولی توصیه می‌شود جهت رفع آلودگی‌های درون‌زاد که در برخی از نمونه‎ها در این پژوهش آشکار شدند نیز مطالعات تکمیلی صورت گیرد.

به عنوان نتیجه‎گیری کلی می‎توان تاکید کرد که ژنوتیپ‎های مختلف بادام کوهی واکنش‎های متفاوتی به محیط کشت مورد استفاده در ریزازدیادی از خود نشان می‎دهند. از این رو توصیه می‎شود اگر ژنوتیپی از بادام کوهی به عنوان پایه برای بادام اهلی انتخاب شد، در صورت نیاز به ریزازدیادی، از یک محیط کشت اختصاصی که بهترین نتیجه را داشته باشد برای تکثیر آن ژنوتیپ استفاده شود. در ضمن هورمون‎پاشی قبل از نمونه‎برداری برای ریزازدیادی نیز سبب افزایش تعداد جوانه و تعداد شاخساره‎های حاصل از ریزازدیادی می‎شود و به‌دلیل وجود اثرات متقابل، بهترین تاریخ نمونه‎برداری بعد از هورمون‎پاشی هم بسته به ژنوتیپ متفاوت است.

تشکر و سپاسگزاری

بدین‌وسیله از مسئولین محترم مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور که امکانات انجام این پژوهش را در اختیار گذاشتند کمال تشکر را داریم. همینطور از رئیس و همکاران محترم گروه زیست‌فن‌آوری این مؤسسه، بویژه از سرکار خانم مهندس میرجانی و سرکار خانم مهرآبادی، که از هیچ کمکی دریغ نکردند بسیار سپاسگزاریم.

  1. الوانی‌نژاد، س.، 1378. بررسی عوامل مؤثر بر پراکنش گونه بادام کوهی(Amygdalus scoparia) در دو منطقه مختلف استان فارس. پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه تربیت مدرس.
  2. امام، م.، قمری زارع، ع.، اسدی‌کرم، ف.، و لوکی انارکی، ک.، 1392. ریزازدیادی بادام کوهی (Amygdalus scoparia) از طریق کشت جوانه و جنین. تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران، 21: 77-86.
  3. امام، م.، قمری زارع، ع.، میرجانی، ل.، و شریعت، آ.، 1394. بررسی مقایسه‌ای ریزازدیادی به شیوه شبه فتواتوتروفیک و فتواتوتروفیک گیاه تیس (Sorbus aucopa L.). مجله پژوهشهای گیاهی، 28: 235-242.
  4. پیوندی، م.، کاظمی، ل.،  و مجد، ا.، 1394. تأثیر سیتوکنین‌های مختلف بر ریزازدیادی گیاه اسطوخودوس (Lavandula vera). مجله پژوهشهای گیاهی، 28: 257-263.
    1. Bengtsson, B.O., 2003. Genetic variation in organisms with sexual and asexual reproduction. Journal of Evolutionary Biology, 16: 189-199.
    2. Carnes, M.G. and Wright, M.S., 1988. Endogenous hormone levels of immature corn kernels of A188, Missouri-17 and Dekalb XL-12. Plant Science, 57: 195-203.
    3. Douglas, G.B., McIvor, I.R. and Lioyd-West, C.M., 2016. Early root development of field-grown poplar: effects of planting material and genotype. New Zealand Journal of Forestry Science, 46: 1-14.
    4. Driver, J.A. and Kuniyuki, A.H., 1984. In vitro propagation of paradox walnut Juglans hindsii x Juglans regia rootstock. HortScience, 19: 507-509.
    5. Farhoosh, R. and Tavakoli, J., 2008. Physicochemical properties of kernel oil from Amygdalus scoparia growing wild in Iran. Journal of Food Lipids, 15:433-443.
    6. Giri, C.C., Shyamkumar, B. and Anjaneyulu, C., 2004. Progress in tissue culture, genetic transformation and applications of biotechnology to trees: an overview. Trees, 18: 115–135.
    7. Gradziel, T.M., Martinez-Gómez, P., Dicenta, F. and Kester, D.E., 2001. The utilization of Prunus species for almond variety improvement. Journal of American Pomology Society, 55:100-108.
    8. Grasselly, C., 1990. Almond production and industry in Europe, North Africa and the Middle East. In: Nut Production and Industry in Europe, Near East and North Africa. FAO, REUR Technical Series, 13: 95-105.
    9. Hardtle, W., Oheimb, G.V. and Westphal, Ch., 2003. The effects of light and soil conditions on the species richness of the ground vegetation of deciduous forests in northern Germany (Schleswig- Holstein). Forest Ecology and Management, 182: 327-338.
    10. Hess, J.R. and Carman, J.G., 1998. Embryogenic competence of immature wheat embryos: Genotype, donor plant environment, and endogenous hormone levels. Crop Science, 38: 249-253.
    11. Hokkanen, P.J., 2006. Environmental patterns and gradients in the vascular plants and bryophytes of eastern Fennoscandian herb rich forests. ForestEcology and Management, 229:73 - 87.
    12. Isikalan, C., Adyaman Akbas, F., Naml, S., Tilkat, E. and Basaran, D., 2008. In vitro micropropagation of almond (Amygdalus communis L. cv. Nonpareil). African Journal of Biotechnology, 7: 1875-1880.
    13. Kamali, K., Majidi, E. and Zarghami, R., 2001. Determination of the most suitable culture medium and growth conditions for micropropagation of GF677 (Hybrid of almond x peach) rootstocks. Journal of Seed and Seedling, 17: 234-243.
    14. Mohebodini, M., Jalali Javaran, M., Mahboudi, F. and Alizadeh, H., 2011. Effects of genotype, explant age and growth regulators on callus induction and direct shoot regeneration of lettuce (Lactuca sativa L.). Australian Journal of Crop Science, 5: 92-95.
    15. Murashige, T. and Skooge, F., 1962. A revised medium for rapid growth and bio- assays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, 15: 473-597.
    16. Ozaslan, M., Can, C. and Aytekin, T., 2005. Effect of explant source on in vitro propagation of Paulownia tomentosa Steud. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 19: 20–26.
    17. Rutledge, C.B. and Douglas, G.C., 1988. Culture of meristem tips and micropropagation of 12 commercial clones of poplar In vitro. Physiologia Plantarum, 72: 367-373.
    18. Schwaegerle, K.E., 2005. Quantitative genetic analysis of plant growth: biases arising from vegetative propagation. Evolution, 6: 1259-67.
    19. Sedaghat, N. and Pazhouhanmehr, S., 2014. The evaluation of the quality properties of kernel oil from Amygdalus scoparia growing wild in Iran under different storage conditions and packaging. Journal of Food Science and Technology, 43: 11-23.
    20. Shtereva, L., Vassilevska-Ivanova, R., Karceva, T. and Kraptchev, B., 2014. Micropropagation of six Paulownia genotypes through tissue culture. Journal of Central European Agriculture, 15: 147-156.
    21. Sulusoglu, M., 2012. Development of a rooted cutting propagation method for selected Arbutus unedo L. types and seasonal variation in rooting capacity. Journal of Agricultural Science, 4: 216-225.
    22. Suzuki, R.M. and Kerbauy, G.B., 2006. Effects of light and ethylene on endogenous hormones and development of Catasetum fimbriatum (Orchidaceae). Brazilian Journal of Plant Physiology, 18: 359-365.
    23. Suzuki, R.M., Kerbauy, G.B. and Zaffari, G.R., 2004. Endogenous hormonal levels and growth of dark-incubated shoots of Catasetum fimbriatum (Morren) Lindl. Journal of Plant Physiology, 161:929-935.
    24. Symons, G.M. and Reid, J.B., 2003. Hormone levels and response during de-etiolation in pea. Planta, 216:422-431.
    25. Von Arnim, A. and Deng, X.W., 1996. Light control of seedling development. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 47:215-243.
    26. Xing, W., Bao, M., Qin, H. and Ning, G., 2010. Micropropagation of Rosa rugosa through axillary shoot proliferation. Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica, 52: 69-75.
    27. Yildirim, H., Akdemir, H., Suzerer, V., Ozden, Y. and Onay, A., 2013. In vitro micrografting of the almond cultivars texas, Ferrastar and Nonpareil. Biotechnology and Biotechnology, 27: 3493-3501.
    28. Yucedag, C. and Gultekin, H.C., 2011. Effects of cold stratification and sowing time on germination of almond (Amygdalus communis L.) and wild almond (Amygdalus orientalis L.) seeds. African Journal of Agricultural Research, 6: 3522-3525.