نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 عضو هیئت علمی دانشگاه ارومیه

2 دانش آموخته کارشناسی ارشد دانشگاه ارومیه

چکیده

اسکلروتینیا از بیماری های قارچی مهم آفتابگردان در ایران می باشد که عملکرد این محصول را تحت تأثیر قرار می دهد.
در پژوهش حاضر تغییرات بیوشیمیایی و آنزیمی لاین های آفتابگردان (100 و C39) در شرایط کنترل شده طی زمان های مختلف پس از آلودگی با جدایه های قارچ اسکلروتینیا (SSKH41 و SSU107) بصورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور خصوصیاتی مانند میزان پراکسیداسیون لیپیدها و تجمع مالون دی آلدهید (MDA)، فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانتی مانند کاتالاز (CAT)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گایاکول پراکسیداز (GPX) بررسی شد. نتایج نشان داد که بیماری اسکلروتینیا باعث افزایش تغییرات بیوشیمیایی و آنزیمی در گیاهان آلوده به قارچ شد. لاین های حساس و مقاوم نیز پاسخ های متفاوتی در واکنش به این بیماری از خود نشان دادند. طوری که میزان مالون دی آلدهید در لاین های مقاوم کاهش پیدا کرد که کمترین این میزان مربوط به لاین مقاوم C39 در مواجه با جدایه قارچی SSU107 بود. همچنین میزان فعالیت آنزیم های آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز به ترتیب در لاین های مقاوم و حساس به دو جدایه قارچی بیشتر بود. طوری که فعالیت آسکوربات پراکسیداز در لاین مقاوم C39 و فعالیت گایاکول پراکسیداز در لاین حساس C100 پس از آلودگی با قارچ SSU107 افزایش یافت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of biochemical changes and enzymatic activity of sunflower (Helianthus annuus L.) susceptible and resistant lines in response to Sclerotinia disease

چکیده [English]

Sclerotinia is important fungal disease of sunflower in Iran that affects its yield. In this study, biochemical and enzymatic changes of sunflower lines (C39 and C100) were studied during different times after inoculation of the lines with Sclerotinia fungal isolates (SSU107 and SSKH41) under controlled conditions as a factorial based on completely randomized design (CRD). So, characteristics such as lipids peroxidation and accumulation of malon dialdehyde (MDA), antioxidant enzymes' activity like catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and guaiacol peroxidase (GPX) were studied. The results showed that Sclerotinia disease increased the biochemical and enzymatic changes of the plants infected with fungal isolates. Resistant and susceptible lines also showed a different response to the disease, so that the accumulation of MDA in resistant lines decreased, the least of which was related to resistant line C39 inoculation with the SSU107. In addition ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase enzymes' activities were more in resistant and susceptible lines, respectively. So, the APX enzymatic activity increased in the line C39 and the GPX enzymatic activity increased in the line C100 after inoculation with SSU107 fungal isolate. According to the results of this study, the line C39 showed good partial resistance, because of the lowest level of lipid peroxidation and the highest enzymatic activities that causes resistance mechanism of plant against pathogens.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Sunflower
  • Sclerotinia
  • lipid peroxidation
  • Enzymatic activity
  • Resistance

بررسی تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی لاین­های حساس و مقاوم آفتابگردان (Helianthus annuus L.) در واکنش به بیماری قارچی اسکلروتینیا

رضا درویش­زاده1، 2*، نجمه ارجمند3، رقیه نجف­زاده4و رضا حیدری3

 1ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده کشاورزی، گروه اصلاح و بیوتکنولوژی گیاهی

2ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده زیست­فناوری

3ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی

4میاندوآب، دانشگاه ارومیه، مرکز آموزش عالی شهید باکری، گروه گیاهان دارویی

تاریخ دریافت: 17/3/95                تاریخ پذیرش: 15/9/95

چکیده

اسکلروتینیا از بیماری­های قارچی مهم آفتابگردان در ایران می­باشد که عملکرد این محصول را تحت تأثیر قرار می­دهد. از این‌رو، بررسی واکنش فنوتیپی و مولکولی ژنوتیپ­ها به عامل بیماری برای تولید ارقام هیبرید مقاوم از اهمیت ویژه­ای برخوردار می­باشد. در این پژوهش تغییرات بیوشیمیایی و آنزیمی لاین­های آفتابگردان 100) و (C39 در شرایط کنترل شده طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های قارچ اسکلروتینیا (SSKH41 و (SSU107 بصورت فاکتوریل بر پایه طرح کاملاً تصادفی بررسی گردید. بدین‌منظور خصوصیاتی مانند میزان پراکسیداسیون لیپیدها و تجمع مالون­ دی­آلدهید (MDA)، فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی مانند کاتالاز (CAT)، آسکوربات پراکسیداز (APX) و گایاکول پراکسیداز (GPX) بررسی شد. نتایج نشان داد که بیماری اسکلروتینیا باعث افزایش تغییرات بیوشیمیایی و آنزیمی در گیاهان آلوده به قارچ شد. لاین­های حساس و مقاوم نیز پاسخ­های متفاوتی در واکنش به این بیماری از خود نشان دادند. به‌طوری‌که میزان مالون دی­آلدهید در لاین­های مقاوم کاهش پیدا کرد که کمترین این میزان مربوط به لاین مقاوم C39 در مواجه با جدایه قارچی SSU107 بود. همچنین میزان فعالیت آنزیم­­های آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز به‌ترتیب در لاین­های مقاوم و حساس به دو جدایه­ قارچی بیشتر بود. به‌طوری‌که فعالیت آسکوربات پراکسیداز در لاین مقاوم C39 و فعالیت گایاکول پراکسیداز در لاین حساس C100 پس از آلودگی با قارچ SSU107 افزایش یافت. طبق نتایج این تحقیق، لاین C39 به دلیل داشتن کمترین میزان پراکسیداسیون لیپید و بیشترین فعالیت­ آنزیمی که مکانیسم­های دفاعی گیاه را در برابر پاتوژن­ها ایجاد می­کند، مقاومت نسبی خوبی از خود نشان داد. نتایج حاصل از این تحقیق می­تواند در برنامه­های به­نژادی آفتابگردان برای تولید ارقام مقاوم به این بیماری مفید واقع گردد.

واژه‌های کلیدی: آفتابگردان، اسکلروتینیا، پراکسیداسیون لیپید، فعالیت آنزیمی و مقاومت.

* نویسنده مسئول، تلفن: 09149734458، پست الکترونیکی: r.darvishzadeh@urmia.ac.ir

مقدمه

 

آفتابگردان (Helianthus annuus L.) یکی از 4 محصول مهم زراعی است که کشت آن به دلیل بهره­برداری از روغن خوراکی حائز اهمیت می­باشد. روغن آفتابگردان علاوه بر مصرف خوراکی، در مصارف صنعتی نیز مورد استفاده قرار می­گیرد (33). همه ساله به علت بیماری­های گوناگونی که انواع قارچ­ها و باکتری­های بیماری­زا در گیاهان مختلف ایجاد می­نمایند، خسارت فراوانی به محصولات کشاورزی وارد می­شود (4). به‌طوری‌که در آفتابگردان نیز تنش­های زیستی یکی از عوامل محدود کننده رشد محصول می‍باشند. Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary یکی از عوامل بیماری گیاهی با دامنه وسیع میزبانی است که می­تواند بیش از 400 گونه گیاهی متعلق به بیش از 70 خانواده را در مراحل مختلف آلوده کند (37، 38 و 40). این پاتوژن در آفتابگردان باعث پوسیدگی ریشه، ساقه، طوقه و طبق شده و موجب بوته­میری گیاه می­گردد و در شرایط آب و هوایی مساعد، خسارت زیادی به محصول وارد می­کند (9، 18 و 35).

گیاهان در مواجه با تنش­های غیرزنده و زنده ازجمله پاتوژن­ها، دچار تغییرات بیوشیمیایی می­شوند (2، 5 و 7). یکی از اولین تغییرات بیوشیمیایی و سریع­ترین پاسخ­های دفاعی در گیاهان آلوده به پاتوژن، انفجار اکسیداتیو (Oxidative burst) می­باشد که باعث تشکیل انواع گونه­های اکسیژن فعال ROS, Reactive oxygen species)) و رادیکال­های آزادی مانند سوپراکسید (O2-) و پراکسیدهیدروژن (H2O2) می­شود (10 و 30) که به‌دنبال آن نیز پراکسیداسیون لیپیدها و تجمع مالون دی­آلدهید MDA, Malon dialdehyde)) رخ می­دهد (35 و 45). رادیکال­های آزاد می­توانند نقش دوگانه­ای داشته باشند. به‌طوری‌که از یکسو باعث تخریب سلول و از سوی دیگر به‌عنوان مولکول سیگنال باعث فعال شدن مکانیسم­های دفاعی در سلول ­شوند. پاکسازی محتویات سیتوپلاسم از رادیکال­های اکسیژن در گیاهان مقاوم، به تحریک سیستم دفاعی آنتی­اکسیدانتی وابسته می­باشند (26). مکانیسم­های حفاظتی آنتی­اکسیدانتی در گیاهان برای مقابله با تنش اکسیداتیو و رادیکال­های آزاد اکسیژن شامل القاء چندین آنزیم آنتی­اکسیدانتی همانند سوپراکسید دیسموتاز
SOD, Superoxide dismutase))، کاتالاز
CAT, Catalase))، آسکوربات پراکسیداز
APX, Ascorbate peroxidase))، گایاکول پراکسیداز
 (GPX, Guaiacol peroxidase)، گلوتاتیون ردوکتاز
GR, Glutathione reductase)) و دیگر سیستم­های آنتی­اکسیدانتی می­باشد (10، 15، 22، 23، 27 و 42). عموماً زمانی که گیاه در معرض شرایط تنش قرار می­گیرد، فعالیت این آنزیم­ها افزایش می­یابد. به‌طوری‌که سوپراکسید دیسموتازها به عنوان اولین خط دفاعی در تبدیل رادیکال سوپراکسید به پراکسیدهیدروژن عمل می­کنند. در مرحله بعد پراکسیدهیدروژن توسط آنزیم آسکوربات پراکسیداز در چرخه آسکوربات-گلوتاتیون و یا توسط گایاکول پراکسیداز و کاتالاز در سیتوپلاسم یا دیگر بخش­های سلول، از بین می­رود (10 و 20). پژوهش­ها نشان داده است که تغییر در بیان یا فعالیت آنزیم­های ROS می­تواند گام مهمی در فعال­سازی سیستم دفاعی گیاه در مواجه با پاتوژن­های زیستی باشد. زیرا فعالیت سیستم آنتی­اکسیدانتی آنزیمی باعث کاهش رادیکال­های آزاد اکسیژن و تنش اکسیداتیو شده و در نهایت موجب حفظ سلول­ در مواجه با نفوذ پاتوژن­های قارچی اسکلروتینیا می­شود (11، 16 و 34). تاکنون مطالعاتی در رابطه با بررسی تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی به هنگام مواجه با انواع پاتوژن­ها در گیاهان نخود، سویا، یونجه، کتان و گوجه­فرنگی (12، 16، 17، 20، 26 و 31) انجام شده است. در آفتابگردان نیز مطالعاتی در رابطه با بررسی این تغییرات به هنگام مواجه با بیماری اسکلروتینیا گزارش شده است (3، 14، 18، 25، 34 و 35). Davar و همکاران (14) در یک تحقیق که به‌منظور بررسی تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی در لاین­های حساس و مقاوم آفتابگردان در پاسخ به بیماری اسکلروتینیا انجام شد، گزارش کردند که میزان تجمع MDA و فعالیت­ آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی CAT، APX و GPX در لاین­های مطالعه شده متفاوت است. به‌طوری‌که میزان این تغییرات در گیاهان مقاوم و حساس در مقایسه با شاهد افزایش یافت. Emamgholi و همکاران (18) افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی را در گیاه آفتابگردان در پاسخ به قارچ اسکلروتینیا گزارش کردند. Peluffo و همکاران (34) نیز گزارش کردند که میزان فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی در آفتابگردان­های آلوده به

قارچ اسکلروتینیا در مقایسه با شاهد افزایش می­یابد.

اسکلروتینیا از بیماری­های قارچی مهم آفتابگردان در ایران می­باشد که عملکرد این محصول را تحت تأثیر قرار می­دهد (1). در سال­های اخیر شیوع و توسعه این بیماری در منطقه شمال­غرب کشور باعث کاهش سطح زیرکشت این محصول شده است. وسعت خسارت در حدی است که در بعضی از مزارع تحت کشت، عملاً محصولی برداشت نمی­شود. با توجه به اینکه مدیریت زراعی این بیماری بسیار مشکل می­باشد، در حال حاضر تأکید بر استفاده از ارقام مقاوم می­باشد. متأسفانه تعداد ارقام آفتابگردان مقاوم به این بیماری در جهان کم می­باشد. بنابراین، بررسی واکنش فنوتیپی و مولکولی ژنوتیپ­ها به عامل بیماری برای تولید ارقام هیبرید مقاوم از اهمیت زیادی برخوردار می­باشد (3، 6 و 18). در این پژوهش تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی در لاین­های حساس و مقاوم آفتابگردان به دو جدایه قارچی اسکلروتینیا بررسی شد.

مواد و روشها

مواد گیاهی و کشتآنها: 2 لاین آفتابگردان با واکنش متفاوت به 2 جدایه قارچی اسکلروتینیا بر اساس نتایج پژوهش­های پیشین (3 و 6) انتخاب شدند. بدین منظور از لاین C100 (به ترتیب حساس و مقاوم ­به جدایه قارچی SSU107 و SSKH41) و لاین C39 (به ترتیب مقاوم و حساس به SSU107 و SSKH41) استفاده شد. بذرهای لاین­ها از مؤسسه آگرونومی فرانسه
(INRA, Institut National de la Recherche Agronomique) تهیه شدند و در گلدان­های مستطیلی شکل در قالب طرح کاملاً تصادفی با 3 تکرار و هر تکرار شامل 18 نمونه در محیط پیت ماس کشت گردیدند. گیاهان تا مرحله 8 برگی در شرایط دمایی 1±25 درجه سانتی­گراد، رطوبت %65 و دوره نوری 12 ساعت روشنایی نگه­داری شدند (37).

کشت جدایه­های قارچی و تلقیح  گیاهان:  جدایه­های

قارچی    در    محیط    آگار    دکستروز     سیب   زمینی

 (PDA, Potato Dextrose Agar, 39 g L-1, pH=6) کشت شده و به اتاق تاریک با دمای 1±25 درجه سانتی­گراد منتقل شدند. سپس دیسک­های میسیلیومی با قطر 3 میلی­متر از حواشی کلنی در حال رشد (با عمر 3 روز) بریده شدند و در مرحله 8 برگی گیاهان در ناحیه طوقه ساقه آنها قرار گرفتند. برای حفظ رطوبت، بر اساس روش Price و Colhoun (36) اطراف ساقه و دیسک میسیلیومی با پارافیلم بسته شد. نمونه­برداری از قسمت پایه­ای ساقه گیاهان در زمان­های 3، 6، 12، 24 و 48 ساعت پس از آلودگی با قارچ انجام شد. در تیمار کنترل، آلودگی لاین­ها با جدایه­های قارچی انجام نشد.

اندازه­گیری خصوصیات: پراکسیداسیون لیپیدها ومیزان مالوندی­آلدهید (MDA): برای اندازه­گیری میزان تجمع MDA که به‌عنوان معیاری از پراکسیداسیون لیپیدها مطرح می­باشد، ‌از روش Heath و Packer (21) استفاده شد. بدین منظور 2/0 گرم از بافت تر ساقه گیاه در 5 میلی­لیتر ﺗـﺮیﮐﻠﺮواﺳـتیک­اسید (TCA) یک درصد ساییده شد. ترکیب یکنواخت حاصل به مدت 10 دقیقه با سرعت 8000 دور سانتریفیوژ و بعد روی یک میلی­لیتر از محلول رویی، 4 میلی­لیتر محلول حاویTCA  %20 و تیوباربیتوریک­اسید (TBA) %5/0 اضافه شد. نمونه­ها به مدت 30 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 95 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند و پس از آن بلافاصله در آب یخ سرد شدند. سپس به مدت 5 دقیقه با سرعت 8000 دور سانتریفیوژ شدند و در نهایت جذب نمونه­ها در طول موج­های 532 و 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Biowave DAD, S2100, England) قرائت گردید. میزان MDA با ضریب خاموشیmM-1cm-1)  155 (و فرمول زیر محاسبه شد:

MDA (μmol /gFw)= [A532-A600/155] × 1000

سنجش فعالیت آنزیمی: برای سنجش فعالیت آنزیمی، ابتدا عصاره گیاهی به روش Kang و  Saltiveit(23) استخراج شد. بدین منظور 5/0 گرم از بافت تر ساقه به همراه 3 میلی­لیتر بافر استخراج تریس-اسیدکلریدریک 50 میلی­مولار (pH=7) حاوی (3 میلی­مولار MgCl2 و یک میلی­مولار EDTA) در هاون سرد ساییده شد. بافر استخراجی برای آنزیم آسکوربات پراکسیداز علاوه بر ترکیبات ذکر شده، محتوی 2/0 میلی­مولار آسکوربیک­اسید نیز بود. ترکیب یکنواخت حاصل به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد با سرعت 5000 دور سانتریفیوژ شده و محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیم­های زیر استفاده شد.

آنزیم کاتالاز (CAT): سنجش فعالیت آنزیم CAT با استفاده از روش  Aebi(8) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلی­لیتر بافر فسفات 50 میلی­مولار (pH=7)، 2/0 میلی­لیتر H2O2 یک درصد و 3/0 میلی­لیتر عصاره استخراجی بود. فعالیت آنزیم CAT به صورت کاهش در جذب طی یک دقیقه در طول موج 240 نانومتر محاسبه شد. برای سنجش میزان فعالیت این آنزیم از ضریب خاموشی (mM-1cm-1 0436/0) و فرمول زیر استفاده شد )اختلاف جذب (doD::

12Unit mM/m=doD/minSlopeأ—Vol. of assay (0.0003) Extinction cofficient (0.0436)" o:preferrelative="f">

آنزیمآسکوربات پراکسیداز (APX): سنجش فعالیت APX با استفاده از روش Nakano و Asada (29) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلی­لیتر بافر فسفات 50 میلی­مولار (pH=7) حاوی EDTA) 1/0 میلی­مولار و آسکوربات سدیم یک میلی­مولار)، 2/0 میلی­لیتر H2O2 یک درصد و 1/0 میلی­لیتر عصاره استخراجی بود. فعالیت APX به صورت کاهش در جذب طی یک دقیقه در طول موج 240 نانومتر محاسبه شد. برای سنجش میزان فعالیت این آنزیم از ضریب خاموشی (mM-1cm-1 8/2) و فرمول زیر استفاده شد:

12Unit mM/m=doD/minSlopeأ—Vol. of assay (0.0001) Extinction cofficient (2.8)" o:preferrelative="f">

آنزیمگایاکولپراکسیداز (GPX): سنجش  فعالیت  آنزیم

GPX با استفاده از روش Upadhyaya و همکاران (44) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/2 میلی­لیتر بافر فسفات 50 میلی­مولار (pH=7)، یک میلی­لیتر گایاکول یک درصد، یک میلی­لیتر H2O2 یک درصد و 1/0 میلی­لیتر عصاره  استخراجی بود. فعالیت GPX به صورت افزایش در جذب طی یک دقیقه در طول موج 420 نانومتر محاسبه شد. برای سنجش فعالیت این آنزیم از ضریب خاموشی
(mM-1cm-1 6/26) و فرمول زیر استفاده شد:

12Unit mM/m=doD/minSlopeأ—Vol. of assay (0.0001) Extinction cofficient (26.6)" o:preferrelative="f">

تجزیه ‌و تحلیل آماری: داده­های به‌دست آمده بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفیبا 3 تکرار تجزیه‌وتحلیل شدند. تجزیه واریانس توسط نرم­افزار SAS 9.2 و مقایسه­ میانگین­ اثرات معنی­دار با آزمون LSD در نرم­افزار MSTATC انجام شد. در مواردی که اثر متقابل عامل­ها معنی­دار بود، مقایسه میانگین اثرات اصلی انجام نشد. در ضمن نمودارها با نرم­افزار Excel رسم شد.

نتایج

نتایج تجزیه واریانس داده­ها نشان داد که اثر لاین (گیاه میزبان)، جدایه قارچی و زمان آلودگی با قارچ روی برخی خصوصیات بیوشیمیایی و فعالیت­های آنزیمی معنی­دار می­باشد. به‌طوری‌که لاین اثر معنی­داری بر میزان مالون دی­آلدهید و فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در سطح احتمال 1 درصد (P<0.01) و اثر معنی­داری بر فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در سطح احتمال 5 درصد (P<0.05) دارد. اثر جدایه قارچی در سطح احتمال 1 درصد (P<0.01) بر فعالیت آنزیم­های کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز معنی­دار بود. در ضمن اثرات مدت زمان پس از آلودگی نیز در سطح احتمال 1 درصد (P<0.01) بر فعالیت آنزیم­های کاتالاز و آسکوربات پراکسیداز و در سطح احتمال  5  درصد  (P<0.05)  بر  فعالیت  آنزیم  گایاکول

پراکسیداز معنی­دار بود.

 

جدول 1- تجزیه واریانس خصوصیات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی در لاین­های آفتابگردان طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا

 

منبع تغییرات

 

میزان مالون دی­آلدهید (MDA)

 

آنزیم کاتالاز (CAT)

 

آنزیم آسکوربات پراکسیداز(APX)

 

آنزیم گایاکول پراکسیداز(GPX)

 

    df

 

Ms

 

df

 

Ms

 

df

 

Ms

 

df

 

Ms

لاین

1

**31/5515

1

ns61/571115

1

**09/922

1

*57/0

جدایه

2

ns92/615

2

**27/8436198

2

**75/720

2

ns02/0

زمان

4

ns68/647

4

**05/4696650

4

**23/190

4

*32/0

لاین ´ جدایه

2

**08/1504

2

ns08/355886

2

**60/843

2

*51/0

لاین  ´زمان

4

ns29/233

4

ns91/989439

4

**83/183

4

*29/0

جدایه ´ زمان

8

*05/665

8

ns80/2433440

8

**07/234

8

*27/0

لاین ´ جدایه ´ زمان 

8

ns83/393

8

ns25/1494804

8

**32/255

8

**32/0

اشتباه

54

02/256

55

7/1254262

59

18/50

60

11/0

df: درجه­آزادی، Ms: میانگین مربعات. ** معنی­دار در سطح احتمال 1 درصد (01/0)، * معنی­دار در سطح احتمال 5 درصد (05/0) و nsعدم معنی­دار.

 

معنی­دار بودن اثر متقابل بین تیمارها نشان می­دهد که اختلاف بین لاین­ها از سطحی به سطح دیگر جدایه قارچ و از زمانی به زمان دیگر در مواجه با قارچ متفاوت است (جدول 1).

نتایج مقایسه میانگین­ها نشان داد که آلودگی با جدایه­های قارچ اسکلروتینیا باعث تغییرات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی در گیاهان آلوده در مقایسه با شاهد شده است. لاین­های حساس و مقاوم طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های قارچ اسکلروتینیا، پاسخ­های متفاوتی به بیماری نشان دادند (جدول های­ 2، 3 و 4).

 

 

 

جدول 2- میانگین مالون دی­آلدهید (MDA) در آفتابگردان روغنی در واکنش به بیماری قارچی اسکلروتینیا

مقایسه میانگین لاین ´ جدایه

لاین/جدایه

SSU107

SSKH41

شاهد

C100

a 45/68

a  54/61

a 01/58

C39

b 41/38

a 03/59

b 56/44

مقایسه میانگین زمان ´ جدایه

زمان (ساعت)/جدایه

SSU107

SSKH41

شاهد

3

 ab08/60

a 35/72

bc 29/51

6

 c46/33

 ab92/60

bc 29/51

12

bc 42/43

b 65/53

bc 29/51

24

a 52/73

 ab85/55

bc 29/51

48

a 77/73

 ab57/58

bc 29/51

         

 

جدول 3- میانگین آنزیم کاتالاز (CAT) در آفتابگردان روغنی در واکنش به بیماری قارچی اسکلروتینیا

مقایسه میانگین اثر اصلی جدایه

 

SSU107

SSKH41

شاهد

 

 

میانگین آنزیم کاتالاز

b  57/861

a60/1768

b38/651

 

 

مقایسه میانگین اثر اصلی زمان

 

3

6

12

24

48

میانگین آنزیم کاتالاز

ab 73/1477

bc 87/796

a 46/1649

c 89/467

abc 59/964

             


پراکسیداسیون لیپیدها ومیزان مالوندی­آلدهید: نتایج نشان داد که طی زمان­های 3، 24 و 48 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSU107 و در تمامی زمان­های پس از آلودگی با قارچ SSKH41، میزان پراکسیداسیون لیپید و تجمع مالون دی­آلدهید گیاهان آلوده در مقایسه با شاهد افزایش یافت. کمترین میزان پراکسیداسیون لیپید و تجمع MDA در لاین مقاوم به قارچ SSU107 (لاین C39) مشاهده شد که حاکی از مقاومت نسبی بالای این لاین به بیماری اسکلروتینیا می­باشد (جدول 2 و نمودار 1).

آنزیم کاتالاز: نتایج نشان داد که بیماری اسکلروتینیا باعث افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز می­شود، به‌طوری‌که میزان فعالیت این آنزیم به ترتیب در گیاهان آلوده شده با قارچ SSKH41 و SSU107 در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش داشت. طبق این نتایج، بیشترین فعالیت آنزیمی در زمان­های 12 و 3­ ساعت پس از آلودگی گیاهان مشاهده شد (جدول 3 و نمودار 2).

آنزیم آسکوربات پراکسیداز: نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در بین لاین­های مطالعه شده طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های قارچ اسکلروتینیا متفاوت بود. به‌طوری‌که لاین مقاوم C39 بیشترین فعالیت APX را به ترتیب طی 6 و 3 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSU107 به خود اختصاص داد (جدول 4).

 

 

جدول 4- میانگین فعالیت آنزیم­های آسکوربات پراکسیداز (APX) و گایاکول پراکسیداز (GPX) در لاین­های آفتابگردان طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا

زمان (ساعت)

لاین

جدایه

آنزیم آسکوربات پراکسیداز(APX)

μmolmin-1/gFW

آنزیم گایاکول پراکسیداز(GPX)

μmolmin-1/gFW

 

 

SSU107

d 28/0

b 41/0

 

C100

SSKH41

d 19/4

b 34/0

 

3

 

شاهد

d 03/1

b 36/0

 

SSU107

b 29/27

b 15/0

 

C39

SSKH41

d 60/0

b 39/0

 

 

شاهد

d 61/0

b 40/0

 

 

SSU107

d 69/0

b 39/0

 

C100

SSKH41

d 32/2

b 35/0

 

6

 

شاهد

d 03/1

b 36/0

 

SSU107

a 45/51

b 30/0

 

C39

SSKH41

d 99/1

b 34/0

 

 

شاهد

d 61/0

b 40/0

 

 

SSU107

d 92/0

b 24/0

 

C100

SSKH41

d 38/1

b 56/0

 

12

 

شاهد

d 03/1

b 36/0

 

SSU107

bc 94/17

b 22/0

 

C39

SSKH41

d 60/1

b 31/0

 

 

شاهد

d 61/0

b 40/0

 

 

SSU107

d 76/0

b 21/0

 

C100

SSKH41

d 93/0

b 36/0

 

24

 

شاهد

d 03/1

b 36/0

 

SSU107

d 93/0

b 16/0

 

C39

SSKH41

cd 68/6

b 31/0

 

 

شاهد

d 61/0

b 40/0

 

 

SSU107

d 36/1

a 05/2

 

C100

SSKH41

d 62/2

b 43/0

 

48

 

شاهد

d 03/1

b 36/0

 

SSU107

d 78/0

b 17/0

 

C39

SSKH41

d 08/5

b 40/0

 

 

شاهد

d 61/0

b 40/0

LSD 0.05

57/11

53/0

                                               

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1- تغییرات پراکسیداسیون لیپیدها و میزان مالون دی­آلدهید (MDA) در لاین­های C100 و C39 آفتابگردان
طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا

1: C100/SSU107, 2: C100/SSKH41, 3: C100/Control, 4: C39/SSU107, 5: C39/SSKH41, 6: C39/Control

 


طبق نمودار 3، اگرچه فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در لاین­های مقاوم به 2 قارچ در مقایسه با گیاهان شاهد بیشتر بود، اما این فعالیت طی زمان­های پس از آلودگی کاهش یافت. با توجه به این نتایج، بیشترین فعالیت آنزیم APX مربوط به لاین مقاوم C39 در مواجه با قارچ SSU107 (گروه 4) بود. این لاین در مقایسه با لاین حساس C100 (گروه 1) فعالیت آنزیمی بیشتری در زمان­های 3، 6 و 12 ساعت پس از آلودگی از خود نشان داد. در جدایه قارچی SSKH41 نیز، لاین حساس C39 در مقایسه با لاین مقاوم C100 طی زمان­های 24 و 48 ساعت پس از آلودگی، فعالیت آنزیمی بیشتری داشت. البته میزان آنزیم در لاین­ حساس به 2 جدایه قارچی تغییرات معنی­داری نسبت به شاهد نشان نداد. طبق این نتایج، بیشترین فعالیت آنزیمی در بیشتر زمان­های آلودگی به 2 قارچ در لاین C39 مشاهده شد که حاکی از مقاومت نسبی بالای این لاین می­باشد.

آنزیم گایاکول پراکسیداز: میزان فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در بین لاین­های مطالعه شده طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های قارچ اسکلروتینیا متفاوت بود. به‌طوری‌که بیشترین فعالیت این آنزیم در لاین حساس  C100طی زمان 48 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSU107 مشاهده شد (جدول 4). با توجه به نمودار 4، لاین حساس C100 (گروه 1) بیشترین و لاین مقاوم C39 (گروه 4) کمترین فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز را در مواجه با قارچ SSU107 داشتند. به‌طوری‌که لاین C100 در مقایسه با C39 در تمامی زمان­های پس از آلودگی، فعالیت آنزیمی (GPX) بیشتری داشت. در گیاهان آلوده به قارچ SSKH41 نیز، لاین مقاوم C100 (گروه 2) در مقایسه با لاین حساس C39 (گروه 5) بیشترین فعالیت آنزیمی را در تمامی زمان­های پس از آلودگی با این قارچ دارا بود. بنابراین به نظر می­رسد برخلاف نتایج آنزیم آسکوربات پراکسیداز، لاین C100 در مقایسه با C39 در تمامی زمان­های پس از آلودگی، فعالیت آنزیمی بیشتری را دارا بود.

 

 

 

نمودار 2- تغییرات فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) در لاین­های C100 و C39 آفتابگردان
طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا

1: C100/SSU107, 2: C100/SSKH41, 3: C100/Control, 4: C39/SSU107, 5: C39/SSKH41, 6: C39/Control

 

 

نمودار 3- تغییرات فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز  (APX)در لاین­های C100 و C39 آفتابگردان
طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا

1: C100/SSU107, 2: C100/SSKH41, 3: C100/Control, 4: C39/SSU107, 5: C39/SSKH41, 6: C39/Control

 

 

نمودار 4- تغییرات فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز ((GPX در لاین­های C100 و C39 آفتابگردان
طی زمان­های مختلف پس از آلودگی با جدایه­های SSU107 و SSKH41 قارچ اسکلروتینیا

1: C100/SSU107, 2: C100/SSKH41, 3: C100/Control, 4: C39/SSU107, 5: C39/SSKH41, 6: C39/Control

 

 

بیشترین تفاوت فعالیت آنزیم بین دو لاین C39 وC100  نیز در فاصله زمانی 48 ساعت پس از آلودگی با قارچSSU107  و 12 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSKH41 مشاهده شد.

بحث

پراکسیداسیون لیپیدها ومیزان مالوندی­آلدهید: هنگام مواجه با پاتوژن­ها، پراکسیداسیون لیپیدها رخ می­دهد (35 و 45). پراکسیداسیون لیپیدها باعث تغییر در میزان مالون دی­آلدهید می­شود که به‌عنوان شاخصی معتبر در آفتابگردان در پاسخ به قارچ اسکلروتینیا در نظر گرفته می­شود (14 و 35). در پژوهشی که Garcia-Limones و همکاران (20) روی برهم‌کنش نخود با قارچ فوزاریوم (Fusarium oxysporum) انجام دادند، افزایش پراکسیداسیون لیپیدها بر اثر واکنش­های اکسیداتیو گزارش شد. به‌طوری‌که میزان مالون دی­آلدهید در گیاهان حساس و مقاوم افزایش یافت. اگرچه این افزایش در گیاهان مقاوم بیشتر و سریع­تر از گیاهان حساس رخ داد. Malencic و همکاران (26) گزارش کردند که سطوح بالای ROS در سویا، باعث آسیب غشاء پلاسمایی و افزایش میزان مالون دی­آلدهید در گیاهان آلوده به اسکلروتینیا می­شود. Prats و همکاران (35) انفجار اکسیداتیو در گیاهان آفتابگردان آلوده به اسکلروتینیا را گزارش کردند. در پژوهش آنان میزان مالون دی­آلدهید در مواجه با قارچ اسکلروتینیا افزایش یافت که این نشان­دهنده القاء تنش اکسیداتیو بر اثر بیماری بود. در پژوهشی دیگر، میزان مالون دی­آلدهید به طور قابل توجهی در ریشه­های گیاه آفتابگردان آلوده به قارچ تریکودرما (Trichoderma harzianum) افزایش یافت (43). در این پژوهش تجمع مالون دی­آلدهید در گیاهان آلوده به بیماری بیشتر بود. این افزایش در لاین حساس بیشتر از لاین مقاوم مشاهده شد، به‌طوری‌که کمترین میزان مالون دی­آلدهید مربوط به لاین مقاوم C39 در مواجه با قارچ SSU107 بود. احتمالاً افزایش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی برای جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء سلولی در این ترکیب لاین-جدایه کافی نبوده است. این نتیجه با پژوهش Davar و همکاران (14) مبنی بر افزایش میزان مالون دی­آلدهید در هر 2 لاین مقاوم و حساس آفتابگردان آلوده به قارچ اسکلروتینیا تطابق داشت. همچنین در گزارش آنان افزایش در لاین حساس بیشتر از لاین مقاوم بود.

فعالیت آنزیم کاتالاز: کاتالاز اولین آنزیم آنتی­اکسیدانتی است که باعث تجزیه پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن می­شود (10 و 13). Djebali و همکاران (16) علت تفاوت در فعالیت کاتالاز و فرایندهای بیوشیمیایی اساسی در ریشه یونجه (Medicago truncatula) آلوده به کپک (Aphanomyces euteiches) را، بیان ژن­های دخیل در مقاومت دانستند.Peluffo  و همکاران (34) نیز در بررسی فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت در آفتابگردان­های آلوده به اسکلروتینیا گزارش کردند که میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در لاین مقاوم به طور قابل توجهی حدود 3 برابر در مقایسه با شاهد افزایش پیدا کرد. افزایش آنزیم­های آنتی­اکسیدانت در مطالعه El-Khallal (17) نیز در مواجه گیاه گوجه­فرنگی با فوزاریوم گزارش شده است. همچنینNaglaa  و Hebe (31) گزارش کردند که فعالیت آنزیم کاتالاز به طور قابل توجهی در برگ­های لاین­های حساس و مقاوم کتان تحت بیماری کپک پودری افزایش می­یابد. Davar و همکاران (14) گزارش کردند که بیشترین فعالیت آنزیم کاتالاز در لاین­های مقاوم و کمترین آن در لاین­های حساس­ آفتابگردان در مواجه با اسکلروتینیا می­باشد. همچنین در پژوهشی دیگر روی گیاه آفتابگردان توسط Emamgholi و همکاران (18) فعالیت بیشتر این آنزیم گزارش شده است. طبق نتایج حاصل از این پژوهش لاین­های حساس و مقاوم در مقایسه با گیاهان شاهد در بیشتر زمان­های پس از آلودگی، فعالیت کاتالازی بیشتری داشتند. بیشترین فعالیت آنزیمی طی زمان­های 12 و 3 ساعت پس از آلودگی گیاهان مشاهده شد.

فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز: آسکوربات پراکسیدار یکی از آنزیم­های آنتی­اکسیدانت می­باشد که در فرایند تبدیل پراکسیدهیدروژن به آب نقش دارد (10، 19 و 41). در گیاه برنج مشاهده شده است که افزایش پراکسیدهیدروژن در شرایط تنش، باعث افزایش بیان ژن­های آسکوربات پراکسیداز شده است. در گیاه آرابیدوپسیس نیز افزایش پراکسیدهیدروژن تحت تأثیر نور زیاد، سبب تغییراتی در انتقال الکترون در پلاستوکینون شد که احتمالاً این تغییر سبب القای ژن­های مرتبط با آن می­شود (41). مشخص شده است که افزایش فعالیت پراکسیدازها اغلب همراه با تشکیل تعدادی از فرم­های جدید و از بین رفتن تعدادی از فرم­های آنزیم آسکوربات پراکسیداز می­باشد (32). Singh و همکاران (43) گزارش کردند که فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاه آفتابگردان آلوده به قارچ تریکودرما افزایش می­یابد. گیاهچه­های حساس و خیلی حساس گوجه­فرنگی نیز در مقایسه با انواع مقاوم، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز کمتری را در مواجه با پوسیدگی باکتریایی از خود نشان دادند (12). در این پژوهش، میزان آنزیم آسکوربات پراکسیداز در گیاهان مقاوم و حساس افزایش پیدا کرد، اما این افزایش در گیاهان مقاوم محسوس­تر و بیشتر بود. این نتایج با نتایج دیگر پژوهش­ها (3 و 14) مطابقت داشت. بیشترین فعالیت این آنزیم نیز در بیشتر زمان­های پس از آلودگی، در لاین C39  مشاهده شد.

فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز: پراکسیدازها متعلق به خانواده بزرگ آنزیم­هایی می­باشند که در همه موجودات وجود دارند. آنزیم گایاکول پراکسیداز یکی از مهمترین پراکسیدازها می­باشد (29). این آنزیم در واکنش­های دفاعی به پاتوژن­ها و در حذف پراکسیدهیدروژن نقش دارد. به‌طوری‌که حضور پاتوژن در سلول­های پارانشیمی بافت میزبان، باعث فعال نمودن چرخه آسکوربات-گلوتاتیون و تجزیه مولکول­های پراکسیدهیدروژن می­شود (20). Malencic و همکاران (25) لاین­های خالص آفتابگردان با حساسیت­های متفاوت را به قارچ اسکلروتینیابا اگزالیک اسید تیمار کردند. نتایج آنان نشان داد که تفاوت قابل ملاحظه­ای در فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در لاین­های بررسی شده دیده می­شود. به‌طوری‌که این میزان در ساقه و برگ لاین­های مقاوم بیشتر بود. در پژوهش Singh و همکاران (43) نیز میزان این آنزیم در گیاه آفتابگردان آلوده به قارچ تریکودرما افزایش یافت. در نتایجDavar  و همکاران (14) میزان فعالیت این آنزیم با توجه به زمان و لاین­ مورد مطالعه آفتابگردان متفاوت بود.  به‌طوری‌که در هر 2 لاین­ مقاوم و حساس میزان فعالیت این آنزیم افزایش یافت. اما در بیشتر زمان­های پس از آلودگی، میزان این فعالیت در انواع مقاوم در مقایسه با شاهد بیشتر بود. طبق نتایج حاصل از این پژوهش، بیشترین فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز در لاین حساس C100 در 48 ساعت پس از آلودگی با قارچ SSU107 مشاهده شد. بنابراین به نظر می­رسد مسیر تحریک ژن­های آنتی­اکسیدانتی مختلف متفاوت است و تابع ژنتیک رقم می­باشد، در نتیجه پیام واحدی برای تحریک کل سیستم دفاع آنتی­اکسیدانتی صادر نمی­شود.

نتیجه­گیری کلی

نتایج این پژوهش نشان داد که بیماری اسکلروتینیا باعث افزایش تغییرات در خصوصیات بیوشیمیایی و فعالیت آنزیمی گیاهان آلوده می­شود. لاین­های حساس و مقاوم نیز پاسخ­های متفاوتی در واکنش به این بیماری نشان دادند که این خود به علت تفاوت گیاهان مقاوم و حساس می­باشد. طبق این نتایج، میزان پراکسیداسیون لیپیدها و تجمع مالون دی­آلدهید در لاین­های مقاوم کاهش یافت که کمترین این میزان در لاین مقاوم C39 در مواجه با قارچ SSU107 مشاهده شد. همچنین میزان فعالیت آنزیم­­های آسکوربات پراکسیداز و گایاکول پراکسیداز به‌ترتیب در لاین­های مقاوم و حساس به جدایه­های­ قارچی بیشتر بود. به‌طوری‌که لاین مقاوم C39 بیشترین فعالیت آسکوربات پراکسیداز را پس از آلودگی با قارچ SSU107 به خود اختصاص داد. این در حالی است که لاین حساس C100 فعالیت گایاکول پراکسیداز بیشتری پس از آلودگی با قارچ SSU107 داشت. طبق نتایج این تحقیق، لاین  C39به دلیل دارا بودن کمترین میزان پراکسیداسیون لیپید و بیشترین فعالیت­ آنزیمی که ازجمله مکانیسم­های دفاعی گیاه را در برابر پاتوژن­ها است، مقاومت نسبی مناسبی از خود نشان داد. با بررسی­ تغییرات بیوشیمیایی و مکانیسم­های مقاومت به بیماری اسکلروتینیا در لاین­های آفتابگردان، می­توان تحقیقات وسیع و دقیق­تری در دیگر لاین­های این محصول و سایر مکانیسم­های مقاومت به این بیماری انجام داد. نتایج حاصل از این پژوهش می­تواند در برنامه­های به­نژادی این گیاهان برای تولید ارقام مقاوم به این بیماری مفید واقع شود. امید است با تحقیقات تکمیلی در برنامه­های به­نژادی این محصول، به شناسایی مکان­های ژنی مرتبط با مقاومت برای دستیابی به ارقام مقاوم به بیماری اسکلروتینیا دست یافت.

سپاسگزاری

بدین‌وسیله نویسندگان از مسئولان محترم دانشکده کشاورزی، پژوهشکده زیست­فناوری دانشگاه ارومیه و همچنین از دست اندرکاران انستیتو تحقیقات آگرونومی تولوز فرانسه به دلیل در اختیار گذاشتن بذر لاین­های مورد مطالعه، تشکر و قدردانی می­نمایند.

1- ارشاد، ج.، 1374. قارچ­های ایران. انتشارات سازمان تحقیقات، ترویج و آموزش کشاورزی. 874 ص.

2- امینی، ز.، معلمی، ن.، و سعادتی، ص.، 1393. مقایسه اثر تنش کم آبی بر تغییرات میزان پرولین و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان در سه رقم زیتون (Olea europaea L.). مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست­شناسی ایران)، 27 (2): 167-156.

3- داور، ر.، 1389. برهمکنش گیاه آفتابگردان و قارچ اسکلروتینیا: بررسی مقایسه ای ساختار تشریحی، تغییرات ساختاری و تکوینی ساقه در لاین های مقاوم و حساس و ژنتیک مقاوم به بیماری. رساله دکتری، دانشکده علوم پایه، گروه زیست­شناسی، دانشگاه تربیت معلم تهران.

4- روحی، ل.، زمانی، م.ر.، و مطلبی، م.، 1392. انتقال ژن بتا 1 و 3 گلوکاناز (bgnI) از Trichoderma virens به گیاه کلزا جهت ایجاد مقاومت علیه قارچ Sclerotinia sclerotiorum. مجله زیست­شناسی ایران، 26 (1): 40-28.

5- عموآقایی، ر.، قربان­نژاد نی­ریزی، ه.، و مستاجران، ا.، 1393. بررسی اثر شوری بر رشد گیاهچه، میزان کلروفیل، محتوای نسبی آب و پایداری غشا در دو رقم کلزا. مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست­شناسی ایران)، 27 (2): 268-256.

6- عموزاده، م.، 1391. شناسایی مکان ژن­های کنترل­کننده مقاومت جزئی به بیماری پوسیدگی اسکلروتینیایی طوقه در آفتابگردان (Helianthus annuus L.). پایان­نامه کارشناسی­ارشد، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات، دانشگاه ارومیه.

7- محمدی، ع.، ابراهیم­زاده، ح.، هادیان، ج.، و میرمعصومی، م.، 1394. واکاوی اثر تنش خشکی بر برخی پارامترهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه به لیمو Lippia citriodora H.B.K... مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست­شناسی ایران)، 28 (3): 628-617.

 

8- Aebi, H. 1984. Catalase in vitro. Methods in Enzymology, 105: 121–126.

9- Amoozadeh, M., Darvishzadeh, R., Davar, R., Abdollahi-Mandoulakani, B., Haddadi, P. and Basirnia, A. 2015. Quantitative trait loci associated with isolate specific and isolate non-specific partial resistance to Sclerotinia sclerotiorum in sunflower. Journal of Agricultural Science and Technology, 17: 213–226.

10- Barbosa-Nascimento, J., Freitas Barrigossi, J.A. 2014. The role of antioxidant enzymes in plant defense against herbivorous insects and phytopathogens. Agrarian Academy, Centro Científico Conhecer–Goiânia, 1: 234–250. 

11- Burhenne, K., Gregersen L. 2001. Up-regulation of the ascorbate-dependent antioxidative system in barley leaves during powdery mildew infection. Molecular Plant Pathology, 1: 303–314.

12- Chandrashekar, S., Umesha, S. 2012. Induction of antioxidant enzymes associated with bacterial spot pathogensis in tomato. International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences, 2: 22–34.

13- Dat, J., Vandenabeele, S., Vranova, E., Van, M.M., Inzé, D.V. and Breusegem, F. 2000. Dual action of the active oxygen species durino plant stress responses. Cellular and Molecular Life Sciences, 57: 779–795.

14- Davar, R., Darvishzadeh, R. and Majd, A. 2013. Changes in antioxidant systems in sunflower partial resistant and susceptible lines as affected by Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Biologia, 68: 821–829.

15- Deponte, M. 2013. Glutathione catalysis and the reaction mechanisms of glutathione-dependent enzymes. Biochimica et Biophysica Acta, 1830: 3217–3266.

16- Djebali, N., Mhadhbi, H., Lafitte, C., Dumas, B., Esquerre-Tugaye, M.T., Aouani, M.E. and Jacquet, C. 2011. Hydrogen peroxide scavenging mechanisms are components of Medicago truncatula partial resistance to Aphanomyces euteiches. European Journal of Plant Pathology, 131: 559–571.

17- El-Khallal, S.M. 2007. Induction and modulation of resistance in tomato plants against fusarium wilt disease by bioagent fungi (Arbuscular mycorrhiza) and/or hormonal elicitors (jasmonic acid and salicylic acid): 2- changes in the antioxidant enzymes, phenolic compounds and pathogen related proteins. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 1: 717–732.

18- Emamgholi, A., Zaefizadeh, M. and Imani, A. 2015. The proteomic analysis of resistance to Sclerotinia Sclerotiorum fungus in sunflower seedling stage. Trend in Life Science, 4: 2319–5037.

19- Foyer, C.H., Halliwell, B. 1976. The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: a proposed role in ascorbic acid metabolism. Planta, 133: 21–25.

20- Garcia-Limones, C., Hervas, A., Navas-Cortes, j., Jime nes-Diaz, R. and Tena, M. 2002. Induction of an antioxidant enzyme system and other oxidative stress markers associated with compatible and incompatible interaction between chickrea (Cicer arietinum L.). Physiological and Molecular Plant Pathology, 61: 325–337.

21- Heath, R.L., Packer, L. 1968. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. Archives of Biochemistry and Biophysics, 125: 850–857.

22- Jung, S., Kim, J.S., Cho, K.Y., Tae, G.S. and Kang, B.G. 2000. Antioxidant responses of cucumber (Cucumis sativus) to photo inhibition and oxidative stress induced by norflurazon under high and low PPFDs. Plant Science, 153: 145–154.

23- Kang, H.M., Saltiveit, M.E. 2002. Chilling tolerance of maize, cucumber and rice seedling (leaves and roots) and differentially affected by salicylic acid. Physiologia Plantarum, 115: 577–576.

24- Lombardi, L., Sebastiani, L. 2005. Copper toxicity in Prunus cerasifera: growth and antioxidant enzymes responses of in vitro grown plants. Plant Science, 168: 797–802.

25- Malencic, D.J., Vasic, D., Popovic, M. and Devic, D. 2004. Antioxidant systems in sunflower as affected by oxalic acid. Biologia Plantarum, 48: 243–247.

26- Malencic, D., Kiprovski, B., Popovic, M., Prvulovic, D. Miladinovic J. and Djordjevic, V. 2010. Changes in antioxidant systems in soybean as affected by Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary. Plant Physiology and Biochemistry, 48: 903–908.

27- Masella, R., Di-Benedetto, R., Varì, R., Filesi, C. and Giovannini, C. 2005. Novel mechanisms of natural antioxidant compounds in biological systems: involvement of glutathione and glutathione-related enzymes. The Journal of Nutritional Biochemistry, 16: 577–586.

28- Milavec, M., Gruden, K., Ravnikar, M. and Kovac, M. 2008. Peroxidases in the early responses of  different potato cultivars to infection by potato virus YNTN. Plant Pathology, 57: 861–869.

29- Nakano, Y., Asada, K. 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts. Journal of Plant Cell Physiology, 22: 867–880.

30- Nanda, A.K., Andrio, E., Marino, D., Pauly, N. and Dunand, C. 2010. Reactive oxygen species during  plant-microorganism early interactions. Journal of Integrative Plant Biology, 52: 195–204.

31- Naglaa, A.A., Heba, I.M. 2011. Impact of secondary metabolites and related enzymes in flax resistance and or susceptibility to powdery mildew. World Journal of Agricultural Sciences, 7: 78–85.

32- Nagy, Z., Westerberg, H. and Klingberg, T. 2004. Maturation of white matter is associated with the development of cognitive functions during childhood. Journal of Cognitive Neuroscience, 16: 1227–1233.

33- Paniego, N., Heinz, R., Fernandez, P., Talia, P., Nishinakamasu, V. and Hopp, H.E. 2007. Oil seeds, in Genome Mapping and Molecular Breeding in plants, Volume 2, Kole, K. (Ed.). Heidelberg, Germany. Springer, Verlag, pp. 1–21.

34- Peluffo, L., Lia, V., Troglia, C., Maringolo, C., Norma, P., Escande, A., Hopp, H.E., Lytovchenko, A., Fernie, A.R., Heinz, R. and Carrari, F. 2010. Metabolic profiles of sunflower genotypes with contrasting response to Sclerotinia sclerotiorum infection. Phytochemistry, 71: 70–80.

35- Prats, E., Bazzalo, M.E., Leon, A. and Jorrin, J.V. 2003. Accumulation of soluble phenolic compounds in sunflower capitula correlates with resistance to Sclerotinia sclerotiorum. Euphytica, 132: 321–329.

36- Price, K., Colhoun, J. 1975. A study of variability of isolates of Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary from different hosts. Journal of Phytopathology, 83: 159–166.

37- Rojas, E.V. 2014. Physiological, anatomical and molecular characterization of partial resistance against Sclerotinia sclerotiorum in soybean. PhD dissertation, Faculty of Agriculture, University of Guelph, Canada.

38- Saharan, G.S., Mehta, N. 2008. Sclerotinia diseases of crop plants: biology, ecology and disease management. Heidelberg, Germany. Springer, Verlag, p. 486.

39- Schneiter, A.A., Miller, J.F. 1981. Description of sunflower growth stages.Crop Science, 21: 901–903.

40- Sharma, R., Meena, P.D., Verma, P.R., Saharan, G.S., Naresh, M., Singh, D. and Arvind-Kumar, A. 2015. Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary causing Sclerotinia rot in oilseed Brassicas: A review. Journal of Oilseed Brassica, 6: 1–44.

41- Shigeru, S., Takahiro, I., Masahiro, T., Yoshiko, M., Toru, T., Yukinori, Y. and Kazuya, Y. 2002. Regu1ation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes. Journal of Experimental Botany, 5: 1305–1319.

42- Singh, B.N., Singh, B.R., Sarma, B.K. and Singh, H.B. 2009. Potential chemoprevention of N-nitrosodiethylamine-induced hepatocarcinogenesis by polyphenolics from Acacia nilotica bark. Chemico-Biological Interactions, 181: 20–28.

43- Singh, B.N., Singh, A., Singh, S.P. and Singh, H.B. 2011. Trichoderma harzianum-mediated reprogramming of oxidative stress response in root apoplast of sunflower enhances defence against Rhizoctonia solani. European Journal of Plant Pathology, 131: 121–134.

44- Upadhyaya, A., Sankhla, D., Davis, N., Sankhla, N. and Smith, B.N. 1985. Effect of paclobutrazol on the activities of some enzymes of activated oxygen metabolism and lipid peroxidation in senescing soybean leaves. Journal of Plant Physiology, 121: 453–461.

45- Wojtaszek, P. 1997. Oxidative burst: anearly palant response to pathogen infection. Biochemical Journal, 322: 681–692.