نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 ستادیار پژوهش، بخش تحقیقات منابع طبیعی، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان گلستان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، گرگان، ایران

2 دانشیار دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گروه پاتولوژی جنگل

3 دانشیار دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی

4 کرج، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (AREEO)، پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران (ABRII)، بخش بیوتکنولوژی میکروبی

5 دانشیار دانشگاه گنبد کاوس، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه جنگل‌داری

چکیده

درخت آزاد (Zelkova carpinifolia)، یکی از درختان جنگلی در معرض تهدید در ایران و جهان است که در حال حاضر به بیماری جهانی مرگ نارون توسط قارچ Ophiostoma novo-ulmi نیز مبتلا شده است. بطوریکه ذخیره‎گاه‎های جنگلی این گونه در اثر ابتلا به این بیماری با سرعت بالایی در حال از بین رفتن هستند. این تحقیق به منظور بررسی کالزایی و بازایی در گونه جنگلی Z. carpinifolia در شرایط کشت درون شیشه انجام گرفت. آزمایش‎های بررسی تاثیر محیط کشت و ترکیبات هورمونی، ژنوتیپ و اثرات متقابل آنها بر درصد کالوس‎زایی و جوانه‎زنی کالوس‎ها در قالب طرح کاملا تصادفی با دو نوع ریزنمونه برگ و ساقه انجام شدند. نتایج ریزازدیادی نشان داد که درصد کالوس‎زایی در برگ (2/82 درصد)> نسبت به ریزنمونه ساقه (9/72 درصد) بیشتر بود. محیط کشت MS حاوی 2 میلی‎گرم در لیتر BAPو 1 میلی‎گرم در لیتر NAA بالاترین میزان-کالوس‎زایی (3/94 درصد) را داشت و به عنوان بهترین محیط کشت در نظر گرفته شد. بیشترین درصد القای تشکیل جوانه از کالوس (97/7 درصد) بر روی محیط کشت MS به همراه 05/0 میلی‎گرم در لیتر GA3 مشاهده شد. محیط کشت MS غنی شده با IBA (2 میلی‎گرم بر لیتر) و NAA (2 میلی‎گرم بر لیتر) با 70 درصد ریشه‎دهی، بهترین محیط ریشه‎زایی بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Investigating callus induction and regeneration of Zelkova carpinifolia forest species In vitro

نویسندگان [English]

  • Akram Ahmadi 1
  • Mohammad Reza Kavoosi 2
  • Hasan Soltanloo 3
  • Gholamreza Salehi Jozani 4
  • Ali Sattarian 5

1 Forest Sciences Dept., Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources (GUASNR), Gorgan, I.R. of Iran

2 Gorgan University

3 Gorgan University

4 ABRII, I.R. of Iran

5 Gonbad Kavos University

چکیده [English]

Zelkova carpinifolia is one of the forest trees which is threatened by Dutch elm disease caused by Ophiostoma novo-ulmi. Forest reservoirs of this species are going to extinct, rapidly. This study was carried out in order to optimize callus induction and regeneration in Z. carpinifolia forest species. The research was carried out in completely randomized design with leaf and stem explants. The results of micro-propagation on Z. carpinifolia revealed that percentage of callus induction in leaf (82.2%)>Stem explants (72.9%). The optimum medium for callus induction (94.3) was observed on Murashige and Skoog (MS) supplemented with BAP (2 mg/L) and NAA (1 mg/L). Also, the maximum shoot regeneration response (7.97%) from callus was observed on MS medium supplemented with GA3 (0.05 mg/L). MS medium supplemented with IBA (2 mg/L) and NAA (2 mg/L) provided 70% rooting response which was then selected as optimum rhizo-genesis media.
Keywords: Zelkova carpinifolia, Zelkova tree, Tissue culture, Calligenesis, Regeneration

کلیدواژه‌ها [English]

  • Zelkova carpinifolia
  • Zelkova tree
  • tissue culture
  • Calligenesis
  • Regeneration

بررسی کالزایی و باززایی در گونه جنگلی آزاد (Zelkova carpinifolia) در شرایط کشت درون شیشهای

اکرم احمدی1*، محمدرضا کاوسی2، حسن سلطانلو3، غلامرضا صالحی جوزانی4 و علی ستاریان5

1 ایران، گرگان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان گلستان، بخش تحقیقات منابع طبیعی

2 ایران، گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گروه پاتولوژی جنگل

3 ایران،گرگان، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی

4 ایران، کرج، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (AREEO)، پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران (ABRII)، بخش بیوتکنولوژی میکروبی

5 ایران، گنبد کاوس، دانشگاه گنبد کاوس، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه جنگل‌داری

تاریخ دریافت: 12/12/94              تاریخ پذیرش: 15/9/95

چکیده

درخت آزاد (Zelkova carpinifolia)، یکی از درختان جنگلی در معرض تهدید در ایران و جهان است که در حال حاضر به بیماری جهانی مرگ نارون توسط قارچ Ophiostoma novo-ulmi نیز مبتلا شده است. به‌طوری‌که ذخیره‎گاه‎های جنگلی این گونه در اثر ابتلا به این بیماری با سرعت بالایی در حال از بین رفتن هستند. این تحقیق به‌منظور بررسی کالزایی و باززایی در گونه جنگلی Z. carpinifolia در شرایط کشت درون شیشه انجام شد. آزمایش‎های بررسی تأثیر محیط کشت و ترکیبات هورمونی، ژنوتیپ و اثرات متقابل آنها بر درصد کالوس‎زایی و جوانه‎زنی کالوس‎ها در قالب طرح کاملا تصادفی با دو نوع ریزنمونه برگ و ساقه انجام شدند. نتایج ریزازدیادی نشان داد که درصد کالوس‎زایی در برگ (2/82 درصد)> نسبت به ریزنمونه ساقه (9/72 درصد) بیشتر بود. محیط کشت MS حاوی 2 میلی‎گرم در لیتر BAPو 1 میلی‎گرم در لیتر NAA بالاترین نرخ کالوس‎زایی (3/94 درصد) را داشت و به‌عنوان بهترین محیط کشت در نظر گرفته شد. بیشترین درصد القای تشکیل جوانه از کالوس (97/7 درصد) بر روی محیط کشت MS به همراه 05/0 میلی‎گرم در لیتر  GA3مشاهده شد. محیط کشت MS غنی شده با IBA (2 میلی‎گرم بر لیتر) و NAA (2 میلی‎گرم بر لیتر) با 70 درصد ریشه‎دهی، بهترین محیط ریشه‎زایی بود.

واژه‌های کلیدی: Zelkova carpinifolia، درخت آزاد، کالوس‎زایی، کشت بافت، باززایی

* نویسنده مسئول، تلفن: 01732162814 ، پست الکترونیکی: ahmadi.1870@gmail.com

مقدمه

 

درخت آزاد با نام علمی Zelkova carpinifoliaو نام انگلیسی Caucasian elm از تیره نارون (Ulmaceae) می‎باشـد (24). از 10 گونه جنس Zelkova که در سراسر جهان وجود دارد، تنها یک گونه در کشور ما یافت می‎شود که در استان‎های گلستان، گیلان، مازندران، آذربایجان، کردستان، خراسان و تهران پراکنش دارد. این گونه ازجمله گونه‎های نزدیک به تهدید معرفی شده است (10). بررسی‎های انجام شده حاکی از افزایش روند نابودی این درختان در ذخیره‎گاه‎های جنگلی کشور به‌ویژه در ذخیره‎گاه جنگلی دلند (استان گلستان) می‎باشد.

تکنیک کشت بافت همواره به عنوان یکی از روش‎های مطلوب در تکثیر سریع گیاهان عاری از بیماری و یکنواخت  و همچنین تولید گیاهان مقاوم استفاده شده است. تا به حال مطالعات بسیاری بر روی باززایی گیاهان چوبی در حال انقراض انجام شده است (31). برای مثال، کال‎زایی و باززایی گیاهچه‎های گونه Z. sinica با استفاده از ریزنمونه جنین نابالغ توسط Jin و همکاران (2006) انجام شد و بیشترین باززایی گیاهچه در محیط کشت WPM حاوی هورمون‎های  BAP و NAA بدست آمد (16). همین محققان، در سال 2009 باززایی گونه Z. schneideriana را با استفاده از ریزنمونه برگ در شرایط درون شیشه‎ای انجام دادند و محیط کشت WPM را به همراه هورمون‎های (μM 44/4) BAP و (μM 68/2) NAA برای باززایی گیاهچه از کالوس‎ توصیه نمودند (15).

براساس بررسی‎های انجام شده تاکنون مطالعه ای در زمینه تکثیر این گونه بومی ایران انجام نشده است. با توجه به نبود مطالعات کافی در تکثیر این گونه نزدیک به تهدید، که هر ساله به انقراض نزدیکتر می‎شود، کمبود پژوهش در زمینه تکثیر این گونه درختی بسیار ضروری به نظر رسید. لذا این تحقیق با هدف دستیابی به روشی برای تکثیر Zelkova carpinifolia در شرایط کشت بافت و جلوگیری از نابودی این گونه مهم جنگلی انجام شد.

مواد و روشها

پارک جنگلی دلند یکی از ذخیره‎گاه‎هایZ. carpinifolia  در شرق استان گلستان به عنوان منطقه مورد مطالعه انتخاب شد. قلمه‎هایی از شاخه‎ها و سرشاخه‎هایی به قطر یک سانتیمتر از درختان سالم و درختان بیمار به عنوان نمونه جدا شد. از آنجایی‌که قلمه گیری و ریشه زایی قلمه های گونه آزاد بسیار مشکل بوده و موفقیت اجرای آن بسیار ناچیز است، لذا این پژوهش با استفاده از روش کشت بافت و کالوس‎زایی انجام شد. لذا بدین منظور، ریزنمونه‎های برگ و ساقه از قلمه جدا و با استفاده از مایع ظرفشویی به مدت 3 دقیقه آلودگی‎های سطحی آن زدوده شد. ریزنمونه‎ها پس از استریل شدن با قارچ کش بنومیل (g/l 4) به مدت یک ساعت و محلول HgCl2 1/0 درصد به مدت 7 دقیقه، با آب مقطر استریل سه بار شستشو داده شد.

به‌منظور بررسی کالزایی ریزنمونه‎ها، محیط کشت‎های MS و WPM حاوی 7/0 درصد آگار و 2 درصد ساکارز با ترکیبات مختلفی از تنظیم کننده‎های رشد گیاهی شامل نفتالین استیک اسید (NAA)، 6- بنزیل آمینوپورین (BAP)، 2، 4 دی کلرو فنوکسی استیک اسید (2,4-D) و کینیتین (Kin) مورد استفاده قرار گرفتند. برای باززایی و تولید گیاهچه، سه نوع محیط کشت MS (25)، 1/2 MS و WPM با ترکیب متفاوتی از NAA، Kin، BAP، 2, 4-D و IAA استفاده شد. پس از تنظیم اسیدیته (7/5pH=) محیط کشت‏ها به مدت 20 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی گراد در اتوکلاو استریل گردید. نوع محیط کشت‎ها و تیمارهای هورمونی مورد استفاده در مرحله کالوس‎زایی در جدول شماره یک نشان داده شده است.

به‌منظور کالوس‎زایی، قطعاتی از برگ (5/0 × 5/0 سانتی‎متر) و ساقه (4-3 میلی‎متر) بر روی محیط‏های کشت قرار داده شدند. کشت‌ها در مرحله کالوس‎زایی و تکثیر کالوس در تاریکی و از مرحله جنین‎زایی به بعد در اتاق رشد با شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، با شدت نور 5000-4500 لوکس و دمای 25 درجه سانتی‏گراد نگهداری و هر چهار هفته در محیط کشت مشابه واکشت شدند (3، 2، 21، 18).

برای رشدکالوس‎ها از محیط‎ کشت MS حاوی 7/0 درصد آگار، 2% ساکارز، 2 میلی‎گرم در لیتر BAP  و  1  میلی‎گرم

در لیتر NAA استفاده شد.

 

جدول 1- نوع محیط کشت‎ها و تیمارهای هورمونی مورد استفاده در مرحله کالوس‎زایی

محیط کشت

کد محیط کشت

هورمون‎ها (میلی‎گرم بر لیتر)

 

 

Kin

2,4-D

BAP

NAA

MS

*MBN

-

-

2

1

MS

**M2K

2

1

-

-

WPM

***WBN

-

-

1

1

                *MBN: MS+ BAP+ NAA, **M2K= MS+ 2,4-D + Kin, ***WBN= WPM+ BAP+ NAA


قرار دادن کالوس‎ها در محیط جنین‎زایی سوماتیکی و انتقال به محیط کشت باززایی: به منظور جنین‎زایی سوماتیکی کالوس‎ها به سه روش متفاوت مورد استفاده قرار گرفت.

- به منظور جنین‎زایی سوماتیکی، کالوس‎ها به محیط کشت MS دارای NH4NO3 (MS+1.9mg/l NH4NO3) منتقل شدند. بعد از دو هفته، کالوس‎ها به محیط کشت MS به همراه (1 mg/l) KNO3 به منظور بلوغ جنین منتقل شدند (KNO3 برای القای جنین مناسب نیست ولی برای بلوغ جنین بسیار مؤثر است). سپس، بعد از 5 هفته کالوس‎ها به محیط کشت MS دارای 05/0  میلی گرم بر لیتر GA3 منتقل شدند (11).

- به منظـور تمایز جنین‎هایی با ساختار گلوبولار از محیط کشت MS به همراه BAP 1.0 mg/l و 0.5 mg/l 2,4-D استفاده گردید. سپس برای ادامه تشکیل جنین گلوبولار شکل و جوانه‎زنی جنین‎های محیط MS حاوی 1 mg/l BAP، NAA 1 mg/l و KN 0.5 mg/l مورد استفاده قرار گرفت (9).

- به منظور جنین‎زایی اولیه از محیط (MS3%+2 BAP+0.5 IAA) و جنین‎زایی ثانویه از محیط کشت (MS3%+1.5 BAP mg/l+0.5 mg/l IAA) استفاده گردید. به منظور جوانه‎زنی و تولید گیاهچه، جنین‌های سوماتیکی به محیط کشت Half-MS3% بدون هورمون انتقال یافتند (14).

روش آماری و تجزیه و تحلیل داده‎ها در مطالعات کشت بافت: مطالعات کشت بافت آزاد در شرایط درون شیشه‎ای به‎صورت آزمایشی در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار ده تایی و همچنین آزمایش فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. تجزیه واریانس و مقایسه میانگین داده‎ها از طریق آزمون دانکن با استفاده از نرم افزار SPSS انجام گردید.

نتایج

اثر محیط کشتهای مختلف و تنظیم کننده‎های رشد بر القای کالوس: نتایج نشان داد ریزنمونه‎های برگ و ساقه، در هر 3 محیط کشت مورد استفاده قادر به القای کالوس بودند ولی شروع و سرعت کالوس‎زایی در آنها متفاوت بود. کالوس‎زایی از قسمت‎های در تماس با محیط کشت به‌ویژه از قسمت‎های حاشیه که برش یافته بودند، شروع شد و گسترش یافت. در ریزنمونه برگ، 4 تا 5 روز بعد از کشت در محیط MS با تیمار هورمونی 2 میلی‎گرم در لیتر BAP و 1 میلی‎گرم در لیتر NAA کالوس تشکیل شد (شکل 2). القای کالوس تا 5 هفته بعد از کشت ادامه داشت، اگرچه تعویق بیشتر آن، موجب از دست رفتن قابلیت کالوس‎زایی شد.

در ریزنمونه ساقه، کالوس‎زایی تقریبا یک هفته بعد از کشت در محیط MS حاوی 2 میلی‎گرم در لیتر BAP و 1 میلی‎گرم در لیتر NAA اتفاق افتاد. به عبارت دیگر، سرعت کالوس‎زایی در ریزنمونه برگ بیشتر از ساقه بود. تمام نمونه‎هایی که سریع‎تر کالوس‎زایی نمودند دارای رنگ نسبتا سبز روشن بودند ولی دیگر نمونه‎هایی که دیرتر کالوس‎زایی کرده بودند، کمی تیره بود. بافت تمام کالوس‎ها سفت و ترد بودند.

 

جدول 2- اثرات محیط کشت‎های مختلف بر روی القای کالوس از ریزنمونه‎های برگ و ساقه Z. carpinifolia

محیط کشت

ریزنمونه

زمان ظهور اولین کالوس (روز)

رنگ کالوس

بافت کالوس

1*

برگ

5-4

سبز روشن

سفت و ترد

ساقه

7

سبز روشن

سفت و ترد

2**

برگ

8-6

سبز روشن

سفت و ترد

ساقه

10-9

سبز تیره

سفت و ترد

3***

برگ

11-8

سبز تیره

سفت و ترد

ساقه

12-10

سبز تیره

سفت و ترد

*MS+BAP (2 mg/l)+NAA (1 mg/l); **MS+2, 4-D (1 mg/l)+Kn (2 mg/l); ***WPM+BAP (1 mg/l)+NAA (1 mg/l)

 

نتایج تجزیه واریانس کالوس‎زایی ریزنمونه‎های برگ و ساقه درخت آزاد از 5 پایه درختی متفاوت نشان داد که متغیرهای محیط کشت و ریزنمونه در سطح یک درصد و ژنوتیپ در سطح 5 درصد معنی‎دار بودند. اما هیچ یک از اثرات متقابل آنها تفاوت معنی‎داری با یکدیگر نداشتند (p>0.05).

بر اساس نتایج حاصل (جدول 3)، محیط کشت MS حاوی 2 میلی‎گرم در لیتر BAP و 1 میلی‎گرم در لیتر NAA بالاترین درصد کالوس‎زایی (3/94 درصد) و محیط کشت WPM به همراه (1 mg/l) BAP و (1 mg/l) NAA کمترین درصد کالوس‎زایی (3/60 درصد) را نشان داد (01/0 p≤). درصد کالوس‎زایی ریزنمونه برگ (2/82 درصد) بیشتر از ساقه (9/72 درصد) بود.

 

جدول 3- میانگین درصد کال‎زایی ریزنمونه برگ و ساقه در محیط کشت‎های MS و WPM با تیمارهای هورمونی

متغیر

انواع متغیر

درصد کالوس‎زایی

محیط کشت

MS+BAP (2 mg/l)+NAA (1 mg/l)

a 3/94

MS+2, 4-D (1 mg/l)+Kn (2 mg/l)

b 78

WPM+BAP (1 mg/l)+NAA (1 mg/l)

c 3/60

ریزنمونه

برگ

a 2/82

ساقه

b 9/72

 

با توجـه به اینکه نرخ رشـد کالوس‎ها در محیط کشت MS حاوی 2 میلی‎گرم در لیتر BAP و 1 میلی‎گرم در لیتر NAA بیشتر بود (جدول 3)، این محیط کشت برای تکثیر کالوس (Proliferation) انتخاب شد.

القای کالوس‌های جنینی: در هر دو نوع ریزنمونه مورد بررسی، با توجه به رنگ، بافت و زمان آغاز کالوس‎زایی، دو نوع کالوس  مشاهده شد. کالوس نوع اول، نرم، آبدار و به رنگ  سبز متمایل به زرد و کالوس نوع دوم، سفت، سبز رنگ و دارای بافت گره‎دار با رشد کم بود. در هر دو نوع کالوس شروع کالوس‎زایی از حاشیه و قسمت‎های در تماس با محیط کشت به‌ویژه در قسمت‎های بریده شده، طی چهار هفته بود (شکل 1).

 

 

شکل 1- انواع کالوس ایجاد شده از ریزنمونه برگ و ساقه: الف: نوع اول (نرم، آبدار و به‌رنگ سبز متمایل به زرد) و ب: نوع دوم (سفت، سبز رنگ و دارای بافت گره‎دار)

 

القای جوانه‌های نابجا: در کالوس‎های سبز و ترد، پریموردیوم (Primordium) در یک یا دو هفته تشکیل شد و طی دو تا سه هفته جوانه‎های نابجا رشد کردند. بر اساس نتایج تجزیه واریانس، فقط تأثیر محیط کشت بر روی جوانه‎زنی کالوس‎ها معنی‎دار بود (p<0.01)، اما ریزنمونه و اثرات متقابل ریزنمونه و محیط کشت معنی‎دار نبودند (p>0.05). درصد جوانه زنی کالوس‎ها در محیط کشت I (97/7 درصد) نسبت به محیط‏های کشت II و III به‌ترتیب با 22/2 درصد و 86/1 درصد جوانه زنی، به‌طور معنی داری بیشتر بود (جدول 4). به‎طور کلی، میانگین تعداد جوانه در هر کالوس بین صفر تا 13/0 در هر کالوس بود.

 

جدول 4- میانگین درصد جوانه‎زنی کالوس‎ها در محیط کشت­های مختلف

محیط کشت

درصد جوانه‎زنی کالوس‎ها

1*

a 97/7

2**

b 22/2

3***

b 86/1

*MS+ GA3 (0.05 mg/l); **MS+ BAP (1 mg/l)+ NAA (1 mg/l)+ KN (0.5 mg/l); ***MS+ BAP (1 mg/l)+ NAA (1 mg/l)+ KN (0.5 mg/l)

ریشه‎دهی: به‌منظور ریشه‎زایی، کالوس‎هایی که اندام زایی کرده بودند به محیط کشت‎ با تنظیم کننده‎های رشد (IBA (2 mg/l)+NAA (2 mg/l)) منتقل شدند. از این طریق کالوس‎هایی که اندام‎زایی کرده بودند، ریشه‎دار شدند (شکل 2).

شکل 2- باززایی ریزنمونه برگ Z. carpinifolia در شرایط درون شیشه‎: الف) برگ‎های تازه رشد کرده، ب) کشت برگ بر روی محیط کشت به‌منظور کالوس‎زایی، پ) کالوس‎زایی از ریزنمونه برگ، ت) تشکیل کالوس‎های جنین‎زا از ریزنمونه برگ، ث) شروع جوانه‎زنی از کالوس‎های جنین‎زا، ج) بزرگ شدن جوانه بر روی محیط کشت باززایی، چ) ریشه‎زایی و تولید گیاهچه از کالوس برگ

بحث

کشت بافت درخت آزاد و باززایی گیاهچه: این بررسی به منظور حصول کالوس و تولید گیاهان عاری از آلودگی و همچنین باززایی درخت جنگلی آزاد (Z. carpinifolia) انجام شد.

براساس نتایج حاصل، هر دو نوع ریزنمونه و تمامی محیط کشت‎های مورد بررسی قادر به کالوس‎زایی بودند ولی شروع و سرعت کالوس‎زایی در هر یک متفاوت بود. کالوس‎زایی از قسمت‎هایی از محیط که در معرض محیط کشت بودند و به‌ویژه قسمت‎های حاشیه برش یافته بیشتر بود. این موضوع بخوبی نشان داد که زخمی شدن بافت در قسمت حاشیه‎ها باعث فعال شدن بیشتر کالوس‎زایی در مقایسه با دیگر قسمت‎های بافت ‎شد. سرعت کالوس‎زایی در ریزنمونه برگ بالاتر از ساقه بود.

در این بررسی، محیط کشت MS حاوی 2 میلی‎گرم در لیتر BAP و 1 میلی‎گرم در لیتر NAA به عنوان بهترین محیط کشت برای القای کالوس در ریز نمونه ها تعیین شد. در بررسی Wu و همکاران (2006) محیط کشت WMP در ترکیب با BAP و NAA با 1/59 درصد کالزایی به عنوان بهترین محیط کشت در القای کالوس معرفی شد (31). در این تحقیق نیز این ترکیب محیط کشت بر روی ریزنمونه ساقه و برگ Z. carpinifolia نتیجه تقریبا مشابهی (3/60 درصد بدون توجه به نوع ریزنمونه) داشت ولی محیط کشت MS به همراه BAP و NAA توانست کالزایی بالاتری (3/94 درصد) را ایجاد کند. در این پژوهش، از بین دو محیط کشت پایه MS و WPM کارایی محیط کشت MS برای کالزایی این گونه بالاتر از WPM بود. به طور کلی،‌ متداول‎ترین محیط کشتی که برای گونه‎های درختی سخت چوب به‌کار می‎رود، محیط کشت موراشی و اسکوگ (1962) (25) و یا نوع تغییر یافته آن است. عمدتا، غلظت نمک‎های عناصر میکرو و ماکرو نقش مهمی را در ریزازدیادی گیاهان چوبی بازی می‎کنند (1). با توجه به اینکه مقدار نیتروژن در محیط کشت MS و  WPM متفاوت است (به ترتیب 60 و 12 میلی مولار)، بنابراین کارایی بیشتر محیط کشت MS در تکثیر کالوس در مقایسه با محیط WPM می‎تواند به دلیل حضور مقدار نیتروژن بیشتر باشد (6).

از دو نوع کالوس ایجاد شده، کالوس نوع اول، نرم، آبدار و سبزکمرنگ متمایل به زرد بود. ظاهرا این کالوس‎ نوع اول، غیرجنینی بود و در طی زیرکشت‎های بعدی قهوه‎ای شد. Xu و همکاران (2005) نیز در تحقیق خود بر روی گونه‎ای انگور به این امر اشاره نمودند (32). گاهی اوقات کالوس‎ها رنگ‎های قهوه‎ای و سیاه را نشان دادند که به‌دلیل تأخیر در زیرکشت مشاهده گردید که با نتایج Manjula  و همکاران (2000) مطابقت دارد (20).

کالوس‎های غیر جنین‎زا معمولا قادر به ایجاد کالوس‎های جنین دار نیستند که این ممکن است به مراحل رشدی آنها و بیان ژن در کالوس‎ها مرتبط باشد. در بسیاری از گونه‎های گیاهی نشان داده شده است که بین کالوس‎های جنین‎زا و غیر جنین‎زا، تفاوت‎هایی برحسب مورفولوژی، فیزیولوژی، متابولیسیم و الگوی بیان ژن وجود دارد (6). جنین‎‎زایی در کالوس‎های گونه آزاد، بسیار پایین بود و بسیاری از کالوس‎ها غیرجنین‎زا باقی ماندند و جنین‎زا نشدند.  Wu et al.و همکاران (2005) به نتایج مشابهی رسیدند (31).

فاکتورهای بسیاری مانند نوع تنظیم کننده‎های رشد گیاهی و ریزنمونه در جنین‎زایی موفق کالوس‎ها دخیل هستند. هر چند جنین‎زایی در بسیاری از گیاهان از ریزنمونه‎های مختلفی مشاهده شده است (30). اما در بسیاری از گونه‎های گیاهی نشان داده شده است که ژنوتیپ‎های فردی در یک گونه نیز ظرفیت‎های جنین‎زایی متفاوتی دارند. چنین تفاوت‎های ژنوتیپی در ظرفیت جنین‎زایی ممکن است بدلیل وجود تفاوت‎هایی در توانایی فعال‎سازی عناصر کلیدی در مسیرهای جنین‎زایی باشد (22). Prange  و همکاران در سال 2010، در بررسی بر روی باززایی گونه های مختلف سیکلامن از طریق جنین زایی با کالوس، کشت سوسپانسیون و پروتوپلاست به این نتیجه رسیدند که توانایی تشکیل کالوس جنین‎زا و باززایی از طریق جنین‎زایی سوماتیکی در هر گونه به شدت وابسته به ژنوتیپ است. آنان همچنین ذکر کردند که وابستگی شدید به ژنوتیپ یک عامل محدود کننده در باززایی درون شیشه ای است که برای حفظ ژرم پلاسم مورد استفاده قرار می‎گیرد (26). Bradai  و همکاران (2016) با بررسی جنین زایی سوماتیکی بر روی زیتون (Olea europeae L.) به این نتیجه رسیدند که زمینه ژنوتیپی تمامی مراحل فرایند جنین زایی ژنوتیپی را تحت تأثیر قرار می‎دهد (5).

در القای جوانه‎های نابجا از کالوس‎های انتقال یافته به محیط کشت‎های جدید، در کالوس‎های سبز و ترد، پریموردیا در طی یک یا دو هفته تشکیل شدند و در طی دو تا سه هفته جوانه‎های نابجا رشد کردند. در این بررسی، درصد جوانه‎زنی در محیط کشت (I) (97/7 درصد) به طور معنی داری بیشتر از دو محیط کشت دیگر مورد بررسی بود. Haq (2005) نیز محیط کشت (I) را بهترین محیط کشت برای باززایی پنبه از طریق تکثیر کالوس معرفی نمود (11). اگرچه Gopi & Ponmurugan (2006)، محیط کشت (II) را بهترین محیط کشت برای باززایی در Ocimum basilicum L. معرفی کردند اما در گونه آزاد بدلیل سخت باززا بودن محیط کشت مناسبی نبود (9). Jain در سال (2002) محیط کشت (III) را بهترین محیط کشت برای باززایی در Phlox  paniculata معرفی کرد (14).

به‎طورکلی، درصد جوانه‎زنی در این گونه آزاد بسیار پایین بود. در کالوس‎های مورد بررسی میانگین تعداد جوانه‎های تشکیل شده در هر کالوس بین صفر تا 13/0 در هر کالوس بود. بنابراین، باززایی این گونه درختی جنگلی بسیار مشکل است و ازجمله گیاهان سخت باززا می‎باشد.

مشکلات در ریشه‎زایی‎ یکی از بزرگترین چالش‎ها در ریزازدیادی گونه‎های چوبی در شرایط درون شیشه‎ای است  (12، 15). وجود اکسین در محیط کشت‎های ریشه‎زایی یکی از ملزومات برای آغاز ریشه‎دهی است (19). بدون اکسین، جوانه‎ها سبز می‎مانند و طویل می‎شوند اما ریشه‎زایی اتفاق نمی‎افتد (15، 29). Jin و همکاران (2009) بیان کردند که IBA  در تشدید ریشه‎زایی در طی کشت بافت درختان چوبی بسیار مؤثرتر از NAA است (15). در این تحقیق، کالوس‎ها برای ریشه‎زایی، به محیط کشت  MS‎با تیمار هورمونی 2 میلی‎گرم در لیتر NAA و 2 میلی‎گرم در لیتر IBA منتقل شدند. از این طریق کالوس‎هایی که اندام‎زایی کرده بودند، ریشه‎دار شدند. هاشمی آبادی و صداقت در بررسی خود ترکیب اکسین 2 میلی لیتر بر لیتر IBA و 2 میلی لیتر بر لیتر NAA را بهترین ترکیب برای ریشه دهی عنوان کردند که در این تحقیق نیز ترکیب مؤثری در ریشه دهی بود (13). لازم به ذکر است که ترکیب NAA و IBA در بیشتر تیمارهای مورد استفاده در تحقیقات مختلف نتیجه مؤثرتری را در مقایسه با استفاده هریک از هورمون‎ها به تنهایی دارد (13، 27، 23، 4، 17)، هرچند ژنوتیپ  و عوامل محیطی دو عامل مهم و تأثیرگذار در کشت محسوب می‎شوند (28). Yari و همکاران (2013) نیز در تحقیقات خود عنوان نمودند که اهمیت ژنوتیپ و تنظیم کننده های رشد، احتمالا بیانگر نقش ژنها و بیان متفاوت آنها در پاسخ به تیمارهای بکار رفته است (33). به‌طورکلی، نتایج حاصل نشان داد که امکان باززایی گونه آزاد در شرایط درون شیشه‎ای با وجود سخت باززا بودن وجود داشت.

1. Andreu, P., Marìn, J. A. 2005. In vitro culture establishment and ultiplication of the Prunus rootstock ‘Adesoto 101’ (P. insititia  L.) as affected by the type of propagation of the donor plant and by the culture medium composition. Sci. Hortic. 106: 258–267.

2. Arvin, M. G. 2002. Translation in Wooden Trees Tissue Culture, Bunga, J. M. And Aderkas, P.W. (Authors). Kerman. Shahid Bahonar University. 279 p.

3. Bagheri A, Ziarat-nia SM. Hosseini M. 2004. In vitro translation of trees, Bunga, J. M. And Aderkas, P.W. (Authors). Mashhad. Ferdowsi University of Mashhad. 248 p.

4. Blythe, E. K., Sibley, J. L., Ruter, J. M., Tilt, K. M. 2004. Cutting propagation of foliage crops using a foliar application of auxin,” Scientia Hort. J. 103: 31-37.

5. Bradaï, F., Pliego-Alfaro, F., Sánchez-Romero, C. 2016. Long-term somatic embryogenesis in olive (Olea europaea L.): Influence on regeneration capability and quality of regenerated plants. Scientia Hort. J. 199: 23–31.

6. Ciccotti, A. M, Bisognin, C., Battocletti, I., Salvadori, A., Herdemertens, M., Jarausch, W. 2008. Micropropagation of apple proliferation-resistant apomictic Malus sieboldii genotypes. Agronomy. Research. 6 (2): 445-458.

7. Cresswell, R., Nitsch, C. 1975. Organ culture of Eucalyptus grandis L. Planta 125: 87 –90.

8. Frey, L., Saranga, Y., Bjanik, J. 1992. Somatic embryogenesis     in     carnation.     Hortscience. 27: 63-65.

9. Gopi, C., Ponmurugan, P. 2006. Somatic embryogenesis  and plant regeneration from leaf  callus  of Ocimum basilicum L. J. Biotechnol.. 126 (2): 260-264.

10. Güner, A., Zielinski, J. 1998. Zelkova carpinifolia. In: IUCN 2013. IUCN Red List of Threatened Species.

11. Haq, I. 2005. Callus proliferation and somatic embryogenesis in cotton (Gossypium hirsutum L.). Afr. J. Biotechnol. 4 (2): 206-209.

12. Harada, H., Murai, Y. 1996. Micropropagation of  Prunus mume. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 46: 265–267.

13. Hashemabadi, D.,  Sedaghat, H. 2007. Effect of Auxin (NAA and IBA) on rooting in camellia japonica,” Agriculture Journal, Azad University of Mianeh Branches. 2(5): 33-42.

14. Jain. A,, Rout, G. R., Raina, S. N. 2002. Somatic embryogenesis and plant regeneration from callus  cultures of Phlox paniculata Linn. Scientia Hort. J. 94 (1-2): 137-143.

15. Jin, X. L, Zhang, R. Q, Zhang, D. L, He, P., Cao, F. X. 2009. In Vitro plant regeneration of Zelkova carpinifolia, an endangered woody species in China, from leaf explants. J. Horticult. Sci. Biotechnol. 84 (4): 415-420.

16. Jin, X. L., He, P., Zhang, R. Q. 2006. Induction of calli from immature embryos of Zelkova sinica and regeneration of plantlets. Journal of Central South Forestry University, 26: 98-101.

17. Khoshkhoy, M. 2002. Methods and introduction of plant increment, 2ed Pub. Shiraz University. 522-526.

18. Lindfords, A., Kuusela, H., Hohtola, A., Kupila-Ahvenniemi, S. 1990. Molecular correlates of tissue browning and deterioration in scots pine calli. Biol Plant. 32:171-180.

19. Lu, S. F., Zhao, H. Y., Wei, J. H. 2001. Establishment of in vitro regeneration system of triploid Chinese white poplar. Acta Botanica Sinica. 43: 435–437.

20. Manjula, S., Job. A., Nair, G. M. 2000. Somatic embryogenesis from leaf derived callus of Tylophora indica (Burn. f.) Merrill. Indian J. Exp. Biol. 38: 1069-1072.

21. Mc Cwon, B. H. 1986a. Woody ornamentals, shade trees and conifers. In: RH Zimmerman, RJ Griesbach, F Hammerschlag, RH Lawson (eds) Tissue Culture as a Plant Production system for Horticultural Crops, Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht. 333-342.

22. Merkele, S. A., Parrott, W. and Flin, B. S. 1995. Morphogenic Aspect of Somatic Embryogenesis. In: Torpedoed in vitro Embryogenesis in Plant. Klauwer Academic Publishers, Dordrecht Bosta London. 155-203.

23. Moalemi, N., Chehrazi, M. 2005. Effect of auxin hormone on rooting in Thyme seedlings, in Proc. 3th Conferences of Agriculture Sciences.

24. Mozaffarian, W. 2004. Iran trees and shrubs. Publishing contemporary culture. 991 p.

25. Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays of tobacco tissue cultures. Physiol. Plant.15: 437-497.

26. Prange, A. N. S., Bartsch, M., Serek, M., Winkelmann, T. 2010. Regeneration of different Cyclamen species via somatic embryogenesis from callus, suspension cultures and protoplasts. Scientia Hort. J. 125: 442–450.

  1. 27.  Rahdari, P., Khosroabadi, M., Delfani, K., Hoseini, S. M. 2014. Effect of Different Concentration of Plant Hormones (IBA and NAA) on Rooting and Growth Factors in Root and Stem Cuttings of Cordyline Terminalis. Journal of Medical and Bioengineering 3(3): 190-194.

28. Shirdel-Moghanloo, H., Moini, A., Mousavi, A. 2011. Effects of Cultivar, Pretreatment and Embryo Induction Medium in Isolated Microspore Culture of Hexaploid Wheat (Triticum aestivum L.). Iranian Journal of Biology. 24 (6): 789-799.

29. Vieitez, A. M. Vieitez, M. L. 1980. Culture of chestnut shoots from buds in vitro. J. Hortic. Sci. 55: 83–84.

30. Williams, E. G., Maheswaran, G. 1986. Somatic embryogenesis: Factors influencing coordinated behavior of cell as an embryogenic group. Ann. Bot. 57: 443-462.

31. Wu, A. X., Jin, X. L., Xiong, F. 2006. Advances in tissue culture of rare endangered plants of China. Acta Bot. Boreali-Occidential Sinica. 26: 211–216.

32. Xu, X., Lu, J., Ren, Z., Wang, H., Leong, S. 2005. Callus induction and somatic embryogenesis in muscadine and seedless bunch grapes (Vitis) from immature ovule culture. Proc. Fla. State Hort. Soc. 118: 260-262.

33. Yari, F., Mousavi, A., Mostofi, Y., Seyedi, S.M., Zamani, Z., Limer, M. 2013. Effect of plant growth regulators along with iron-chelate on in vitro multiplication and root induction of three cut rose cultivars (Rosa hybrida L.). Iranian Journal of Biology. 26 (1): 99-110.