نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه بین المللی امام خمینی

2 دانشجوی دکتری رشته بیوتکنولوژی گیاهی / دانشگاه زنجان

3 کارشناس آزمایشگاه / دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)

چکیده

پایه‌‌ رویشی پسته قزوینی به عنوان یکی از پایه‌های مهم پسته در تحمل به شوری، آهکی و مقاوم به خشکی به‌شمار می‌آید. بمنظور تهیه یک دستور العمل مطمئن و تعیین محیط کشت بهینه برای ریزازدیادی این پایه، کارایی محیط‌کشت‌های GNH تغییریافته (GNH-A و GNH-B) در مقایسه با محیط‌کشت‌های MS، WPM، DKW یا GNH مورد مطالعه قرار گرفت. علاوه بر این تأثیر مقادیر مختلف BAP (1/1، 8/1 یا 6/3 mg/l) و ال-گلوتامین (0/0، 400، 800 یا 1600 mg/l) برای بهبود نرخ نوساقه‌زایی با کمترین نارسایی‌های فیزیولوژیکی بررسی شد. نتایج حاصله نشان داد که بیشترین تعداد جوانه و تعداد نوساقه به‌ازای هر ریزنمونه (جداکشت) با اختلاف معنی‌داری در محیط‌کشت GNH-A (به‌ترتیب 16/3 ± 46/34 و 46/0±23/4 ) در مقایسه با سایر محیط‌کشت‌ها بدست آمد. همچنین اضافه نمودن مقادیر مختلف BAP به محیط‌کشت، تاثیر معنی داری روی تمامی صفات رشدی مورد مطالعه داشت؛ بطوریکه بیشترین تعداد نوساقه به‌ازای هر جداکشت (48/0± 66/6) در محیط-کشت GNH-A حاوی mg/l6/3 BAP به‌دست آمد. افزودنmg/l 800 ال-گلوتامین به محیط‌کشت GNH-A با اختلاف معنی‌داری رشد طولی و وزن تر نوساقه‌های تولید شده را (به ترتیبcm 06/0±20/1 و g02/0 ± 31/0) در مقایسه با سایر مقادیر استفاده شده افزایش داد. علی‌رغم این، در مرحله ریشه‌زایی، درصد ریشه‌زایی با استفاده از NAA در مقایسه با IBA با اختلاف معنی‌داری افزایش یافت. انتظار می‌رود که نتایج ارائه شده در این مطالعه دیدگاه‌های جدیدی در زمینه توسعه محیط‌کشت‌های کارآمد برای گیاهان با ارزش اقتصادی، از جمله پسته پیش روی محققین قرار دهد.

کلیدواژه‌ها

عنوان مقاله [English]

Improvement of culture media and PGRs in Pistacia vera cv. Ghazvini micropropagation

چکیده [English]

Pistacia vera cv. Ghazvini rootstock is considered as one of the important pistachio rootstocks in tolerance to salinity, calcareous and resistant to drought. In order to providing a reliable protocol for micro-propagation of this rootstock, the efficiency of modified GNH media (GNH-A and GNH-B) compared to MS, WPM, DKW or GNH media was studied. Moreover, the effect of different concentration of BAP (1.1, 1.8 or 3.6 mg/l) and L-glutamine (0.0, 400, 800 or 1600 mg/l) to improve shoot-let production rate with the lowest physiological disorders was survived. Results revealed that the greatest buds and shoots number per explants (34.46 ± 3.16 and 4.23 ± 0.46, respectively) were attained significantly on GNH-A medium compared to the other media studied. Integration of BAP at different concentrations, affected significantly all the studied growth traits, producing the highest shoot number (6.66 ± 0.48) when GNH-A was supplemented with 3.6 mg/l BAP. Furthermore, application of exogenous 800 mg/l L-glutamine in GNH-A medium improved significantly both shoots height and fresh weight (1.20± 0.06cm and 0.31±0.02g, respectively), in comparison with control. In rooting stage, the incorporation of NAA into media significantly increased rooting percentage compared to IBA. Finally, we strongly believe that these results will open new insights for researchers towards efficient culture media improvements for economically important woody plants, Pistacia vera species, in particular.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Pistacia vera
  • Ghazvini rootstock
  • micropropagation
  • L-gluthamin
  • Plant Growth Regulators (PGRs)

بهبود محیط کشت و تنظیم­کننده­های رشدی در ریزازدیادی پایه رویشی پسته قزوینی

قاسمعلی گروسی1*، سارا ملکی2 و اسمعیل نظامی آلانق1 

1 قزوین، دانشگاه بین‌المللی امام خمینی (ره)، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه بیوتکنولوژی

2 زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 11/12/94                        تاریخ پذیرش: 2/9/95 

چکیده

پایه­­ رویشی پسته قزوینی به‌عنوان یکی از پایه­های مهم پسته در تحمل به شوری، آهکی و مقاوم به خشکی به­شمار می­آید. به‌منظور تهیه یک دستورالعمل مطمئن و تعیین محیط کشت بهینه برای ریزازدیادی این پایه، کارایی محیط­ کشت­های GNH تغییریافته (GNH-A و GNH-B) در مقایسه با محیط­کشت­های MS، WPM، DKW یا GNH مطالعه شد. علاوه بر این تأثیر مقادیر مختلف BAP  (1/1، 8/1 یا  6/3 mg/l) و ال-گلوتامین (0/0، 400، 800 یا 1600 mg/l) برای بهبود میزان نوساقه­زایی با کمترین نارسایی­های فیزیولوژیکی بررسی شد. نتایج حاصل نشان داد که بیشترین تعداد جوانه و تعداد نوساقه به­ازای هر ریزنمونه (جداکشت) با اختلاف معنی­داری در محیط­ کشت GNH-A (به‌ترتیب 16/3 ± 46/34  و 46/0±23/4 ) در مقایسه با سایر محیط ­کشت­ها بدست آمد. همچنین اضافه نمودن مقادیر مختلف BAP به محیط ­کشت، تأثیر معنی‌داری روی تمامی صفات رشدی مورد مطالعه داشت؛ به‌طوری‌که بیشترین تعداد نوساقه به­ازای هر جداکشت (48/0± 66/6) در محیط ­کشت GNH-A حاوی  mg/l6/3 BAP به­دست آمد. افزودنmg/l  800 ال-گلوتامین به محیط­ کشت GNH-A با اختلاف معنی­داری رشد طولی و وزن تر نوساقه­های تولید شده را (به‌ترتیبcm  06/0±20/1 و g02/0 ± 31/0) در مقایسه با سایر مقادیر استفاده شده افزایش داد. باوجوداین، در مرحله ریشه­زایی درصد ریشه­زایی با استفاده از NAA در مقایسه با IBA با اختلاف معنی­داری افزایش یافت. از این‌رو انتظار می­رود که نتایج ارائه شده در این مطالعه دیدگاه­های جدیدی در زمینه توسعه محیط ­کشت­های کارآمد برای گیاهان با ارزش اقتصادی، ازجمله پسته پیش روی محققان قرار دهد.

واژه‌های کلیدی: Pistacia vera، پایه ­رویشی قزوینی، ریزازدیادی، ال-گلوتامین و تنظیم­کننده­های رشدی.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02833901159 ، پست الکترونیکی: agaroosi90@yahoo.com

مقدمه

 

پایه­رویشی پسته قزوینی (Pistacia vera cv. Ghazvini) به عنوان یکی از پایه­های ­رویشی مهم متحمل به خاک­های شور و آهکی (26، 29) و مقاوم به تنش­های خشکی (7 و 40) محسوب می­شود. تلاش برای ریزازدیادی آن در شرایط درون­شیشه (in vitro) بجای استفاده از روش­های تکثیر سنتی باغبانی (45 ، 46)، با هدف تولید مقرون ­به­صرفه نونهال­های یکدست و عاری از هرگونه بیماری می­تواند از راهکارهای مهم و عملی در تولید و کشت نهال پسته به‌ویژه در مناطق بیابانی و شوره­زار کشور محسوب شود. علی­رغم مزایای یاد شده، در این روش دستیابی به دستورالعمل­های بومی بمنظور ریزازدیادی سریع و اقتصادی گیاهان باغی نیازمند بهینه­سازی متغیرهای متعددی از قبیل ترکیبات معدنی محیط کشت و تنظیم­کننده­های رشدی می­باشد. مطالعات اخیر نشان داده­اند که ریز­ازدیادی برخی کولتیوارهای P. vera بااستفاده از محیط کشت­های متداول شامل DKW (19)، WPM (31) و MS (41) به­دلیل مشکلات متعددی از جمله سرعت پایین نوساقه­زایی و نارسایی­های رشدی و فیزیولوژیکی همراه بوده است (4، 21، 45، 56). بدین منظور بهینه­سازی ترکیبات مختلف محیط کشت ازجمله منبع کربنی، تنظیم­کننده­های رشدی و یا شرایط محیطی (نور، دما یا رطوبت محیط) مورد توجه بسیاری از محققان بوده است (4، 6، 11، 48، 51). نظر به تأثیر بارز ترکیبات معدنی محیط ­­کشت روی شاخص­های رشدی از قبیل میزان نوساقه­زایی و وزن تر تولید شده در ریزازدیادی درختان میوه (44)، این مهم در مطالعات ریزازدیادی پسته کمتر مورد توجه قرار گرفته است. از اینرو در این مطالعه تأثیر برخی از عناصر پرمصرف روی متغیرهای رشدی پایه رویشی قزوینی بررسی خواهد شد. گزارش­های متعددی از تأثیر تنظیم­کنندهای رشدی مختلف از قبیل BAP (6-benzylaminopurine) در ریزازدیادی پسته توسط سایر محققان ارائه شده است (27، 48، 55). با توجه به­ اینکه عموما نیاز گیاه به تنظیم­کننده­های رشدی، در شرایط درون­شیشه با توجه به نوع و غلظت ترکیبات معدنی محیط­ کشت متفاوت است (22، 23، 54)؛ در این مطالعه تأثیر مقادیر مختلف این تنظیم­کننده رشدی روی میزان نوساقه­زایی همراه با محیط­کشت­های تغییر یافته بررسی خواهد شد. ال-گلوتامین از مهمترین اسید آمینه­های درون­سلولی می­باشد که به عنوان منبع نیتروژن نقش­های متعددی را در متابولیسم سلولی ایفا می­نماید. افزودن این اسید آمینه به ترکیبات محیط­ کشت در بهبود بازدهی باززایی از کالوس، دانه گرده، جنین­زایی سوماتیکی و همچنین بهبود شاخص­های رشدی در مرحله ریزازدیادی گونه­های چوبی تأثیر بارزی داشته است (5، 15، 25، 52). در این مطالعه تأثیر ال-گلوتامین در مرحله نوساقه­زایی پسته، به عنوان منبع نیتروژن در محیط­کشت­های تغییر یافته روی میزان نوساقه­زایی و رشد کیفی پایه رویشی مذکور مورد مطالعه قرار خواهد گرفت. ریشه­زایی پسته در شرایط درون­شیشه به عوامل مختلفی ازجمله ژنوتیپ، نوع و غلظت تنظیم­کننده­های رشدی بستگی دارد؛ به‌طوری‌که استفاده از IBA (Indole-3-butyric acid) و  NAA(1-Naphtaleneacetic acid) در گونه­های مختلف Pistacia بیشترین درصد موفقیت را داشته­اند (4، 51، 55)؛ از اینرو در این مطالعه تأثیر مقادیر مختلف این تنظیم­کننده­های رشدی در ریشه­زایی پایه­­رویشی قزوینی مطالعه خواهد شد.

مواد و روشها

الف) ماده گیاهی، ضدعفونی و شرایط کشت: سرشاخه­های پایه­رویشی پسته قزوینی (P. vera, cv. Ghazvini) در بازه زمانی اواخر زمستان تا اوایل بهار از مرکز تحقیقات کشاورزی استان قزوین تهیه و به آزمایشگاه منتقل گردید. قطعات ساقه دارای 1-2 جوانه حدود 2 سـاعت در زیر آب جاری شستـشو، سـپس بـا الکـل 96 درصد بـه مـدت 4-3 ثانیـه و کلریـد جیـوه 05/0 درصد به مـدت 4-3 دقیقـه ضـدعفونی و در نهایت 3 مرتبه با آب مقطـر اسـتریل شستـشو شدند. سپس هر دو طرف قطعات ساقه بمنظور حذف مناطق آسیب دیده بریده شده و در محیط ­کشت MS حاوی BAP و IBA به‌ترتیب با غلظت­های 1/1 و 1/0 میلی­گرم در لیتر، 30 گرم در لیتر ساکارز، 7/5 : pHو 7/5گرم در لیتر فیتوآگار (Merck) به‌ عنوان جامد­کننده، کشت و در اتاق رشد در دمایC° 2±25 و شرایط نوری 8/16 ساعت (تاریکی/روشنایی) با لامپ‌های سرد-سفید با شدت روشنایی mol m-2 S-1µ 40 قرار گرفتند. پس از شروع رشد جوانه­های جانبی و انتهایی، در دوره رشدی 30 روزه بمنظور تولید ماده گیاهی مورد نیاز، نوساقه­های رشد یافته به جداکشت­های حاوی 1 تا 2 جوانه تقسیم و به محیط ­کشت جدید منتقل گردید (16).

ب) تأثیر محیط­کشت­های مختلف روی متغیر­های رشدی: در این آزمایش تأثیر محیط­ کشت­های MS، DKW، WPM ، GNH (41)، GNH-A یا GNH-B (جدول 1) روی متغیرهای رشدی پایه رویشی قزوینی مورد ارزیابی قرار گرفت. به هریک از ترکیبات محیط­ کشت، BAP و IBA به‌ترتیب 1/1 و 1/0 میلی گرم درلیتر، 30 گرم در لیتر ساکارز و 7/5 گرم در لیتر آگار (Merck) اضافه و پس از تنظیم 7/5:pH اتوکلاو گردید (18). به ازای هرتیمار 4 ظرف شیشه­ای حاوی 280 سی­سی با درب­های کریستالی در نظر گرفته شده و در هر ظرف 4 جداکشت با 1-2 جوانه جانبی (به عبارتی 16 تکرار به‌ازای هرتیمار محیط کشت) کشت و به اتاق رشد با شرایط نوری و دمای یاد شده در بالا منتقل گردیدند. پس از 30 روز از شروع آزمایش صفات رشدی از قبیل تعداد جوانه، تعداد نوساقه، طول نوساقه (cm) و وزن تر (g) تولید­ شده به ازای هر جداکشت، یادداشت­برداری گردید.


جدول 1- ترکیبات معدنی محیط­ کشت­های مورد استفاده برای ریز ازدیادی پایه رویشی قزوینی

 

Media (mg/l)

 

MS

Murashige and Skoog, 1962

DKW

Driver and Kuniyuki, 1984

WPM

McCown, 1980

GNH

Nezami et al, 2010

GNH-A*

GNH-B*

Macroelements

 

 

 

 

 

NH4NO3

1650

1416

400

1650

800

400

KNO3

1900

-

-

25

25

25

MgSO4.7H2O

370

740

370

540

540

540

CaCl2.2H2O

440

147

96

-

-

-

Ca(NO3)2.4H2O

-

1960

556

800

400

400

KH2PO4

170

259

170

300

300

300

NaH2PO4

-

-

-

50

50

50

K2SO4

-

1650

990

-

-

1560

Microelements

 

 

 

 

 

MnSO4.H2O

9/16

5/33

3/22

9/16

9/16

9/16

ZnSO4.7H2O

6/8

17

6/8

6/8

6/8

6/8

H3BO3

2/6

8/4

2/6

2/6

2/6

2/6

FeSO4.7H2O

8/27

4/33

8/27

8/27

8/27

8/27

Na2EDTA

3/37

7/44

3/37

3/37

3/37

3/37

KI

83/0

-

-

83/0

83/0

83/0

CuSO4.5H2O

025/0

25/0

25/0

025/0

025/0

025/0

CoCl2.6H2O

025/0

-

-

025/0

025/0

025/0

Na2MoO4.2H2O

25/0

39/0

25/0

25/0

25/0

25/0

Vitamins

 

 

 

 

 

 

Thiamine-HCl

1/0

2

1

1/0

1/0

1/0

Nicotinic acid

5/0

1

5/0

5/0

5/0

5/0

Pyridoxine-HCl

5/0

2

5/0

5/0

5/0

5/0

Glycine

2

2

2

2

2

2

myo-Inositol

100

100

100

100

100

100

* Nezami-Alanagh  و همکاران (42)


ج) تأثیر ال-گلوتامین و BAP روی متغیرهای رشدی: براساس نتایج حاصل از تأثیر محیط ­کشت­، تأثیر مقادیر مختلف BAP (1/1، 8/1 یا 6/3 mg/l) و ال-گلوتامین (0/0، 400، 800 یا 1600 mg/l) در محیط ­کشت­های GNH-A و GNH-B روی متغیرهای رشدی جداکشت­های قزوینی مورد ارزیابی قرار گرفت. شرایط آزمایش و نگهداری جداکشت مطابق روش یادشده در قسمت بالا بود.

د) تأثیر نوع اکسین روی ریشه­زایی: براساس نتایج گزارش شده توسط سایر محققان (4، 51، 55)، در این آزمایش تأثیر IBA و NAA بطور جداگانه در مقادیر 0/0، 1، 2 یا 3 میلی­گرم درلیتر روی القاء و توسعه ریشه نوساقه­های پایه­رویشی قزوینی در محیط­کشت GNH حاوی 30 گرم در لیتر ساکارز و 7/5 گرم در لیتر آگار مطالعه شد. به ازای هر تیمار 4 تکرار با 4 جداکشت در هر تکرار در نظر گرفته شده و پس از 30 روز میزان ریشه­زایی، درصد ریشه­زایی، تعداد و طول ریشه­­های ایجاد شده به ازای هر ریزنمونه یادداشت­برداری گردید.

تجزیه ‌و تحلیل آماری: آزمایش­ها به­صورت فاکتوریل در قالب طرح­های کاملا تصادفی انجام شدند. برای تجزیه و تحلیل داده­ها از نرم­افزارهای آماری SAS 9.1 استفاده شد. لازم به ذکر است که قبل از تجزیه و تحلیل داده­ها، باقیمانده داده­های خام محاسبه شده و بعد از نظر نرمال بودن با آزمون Shapiro- Wilk  مورد بررسی قرار گرفته و در صورت نیاز برای داده­های شمارشی (از قبیل تعداد نوساقه تشکیل شده، تعداد جوانه و غیره)  از تبدیل ریشه دوم () و تبدیل زاویه­ای (Arcsin ) برای داده­های درصدی (درصد ریشه­زایی) استفاده شد. مقایسه میانگین­ها توسط آزمون چند دامنه دانکن در سطح (01/0 =α) انجام شد.

نتایج  

بیش از 60 درصد جداکشت­های ضدعفونی شده براساس روش یاد­شده در قسمت مواد و روش­ها عاری از هرگونه آلودگی باکتریایی و قارچی بود. باوجوداین، ترشح ترکیبات فنولی به‌ویژه در طول 2 تا 3 ماه اول شروع آزمایش به عنوان یکی از محدودیت­های رشدی پایه­رویشی قزوینی بود. بدین ­منظور انتقال جداکشت­ها به محیط ­کشت جدید و شستشوی جداکشت­ها در زیر لامین­ایرفلو به مدت 2-3 دقیقه با آب مقطر استریل هر 2-3 روز، تأثیر بسیار زیادی روی بقای جداکشت­ها و جوانه­زنی سریع آنها داشت.

الف) تأثیر محیط­کشت­ روی متغیرهای رشدی: نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس بیانگر تأثیر معنی­دار محیط­ کشت­های مختلف روی میزان نوساقه­زایی (0003/0=P)، تعداد جوانه (0001/0> P)، رشد طولی (0080/0=P) و وزن تر (0524/0=P) بود (جدول 2).

 

جدول 2- آنالیز تجزیه واریانس تاثیر نوع محیط­کشت روی برخی صفات رشدی 

منبع تغییرات

میانگین مربعات (MS)

درجه آزادی

میزان نوساقه­زایی

تعداد جوانه

رشد طولی نوساقه cm))

وزن تر (g)

محیط­کشت

5

** 0863/0

**2373/0

**5941/1

* 0346/0

خطا

74

0163/0

0318/0

4681/0

0149/0

کل

79

 

 

 

 

*بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح   05/0=α و ** بیانگر اختلاف معنی دار در سطح 01/0=α می­باشد

جدول3- مقایسه آزمون چند دامنه­ای دانکن تاثیر نوع محیط­کشت روی برخی صفات رشدی

نوع محیط­کشت

میزان نوساقه­زایی

تعداد جوانه

رشد طولی نوساقه (cm)

وزن تر (g)

MS

bc32/0 ± 83/2

c43/2±08/17

ab19/0 ± 36/1

ab05/0 ± 38/0

DKW

c32/0 ± 5/2

c79/1±11/16

a24/0 ± 91/1

b02/0 ± 29/0

WPM

ab5/0 ± 83/3

bc24/2±00/21

b11/0 ± 00/1

b03/0 ± 29/0

GNH

ab3/0 ± 92/3

bc31 /2±30/23

a11/0 ± 48/1

a03/0 ± 39/0

GNH-A

a46/0 ± 23/4

a16/3±46/34

ab18/0 ± 43/1

ab03/0 ± 34/0

GNH-B

a51/ 0± 66/4

b93/2±66/25

b1/0 ± 08/1

b03/0 ± 27/0

حروف مختلف در هر ستون بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح 01/0=α  بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن می­باشد.

 

براساس آزمون مقایسه چند دامنه دانکن، در حالیکه بیشترین میزان نوساقه­زایی و تعداد جوانه به­ازای جداکشت با اختلاف معنی­دار در محیط­کشت­های GNH-B و GNH-A به‌ترتیب 51/ 0± 66/4 و 16/3 ± 46/34 بدست آمد؛ رشد طولی نوساقه­های رشد یافته در محیط­کشت­های DKW و GNH به‌ترتیب با  cm24 /0 ± 91/1 و  cm11/0 ± 48/1 از میانگین بیشتری برخوردار بودند. همچنین بیشترین وزن تر در محیط­کشت GNH ( g03/0 ± 39/0) بدست آمد (جدول 3). 

ب) تأثیر ال-گلوتامین و BAP روی متغیرهای رشدی: با توجه به نتایج مطلوب استفاده از محیط کشت­های تغییر یافته GNH-A و GNH-B روی برخی صفات رشدی از قبیل نوساقه­زایی و تعداد جوانه، به‌منظور بهبود رشد طولی و وزن تر نوساقه­های رشد یافته، تأثیر مقادیر مختلف ال-گلوتامین و BAP روی هر دو محیط­کشت مزبور بطور جداگانه بررسی شد. نتایج حاصل از جدول تجزیه واریانس بیانگر تأثیر متقابل معنی­دار نوع محیط ­کشت تغییریافته × BAP روی میزان نوساقه­زایی و تعداد جوانه تولید شده (به‌ترتیب 0192/0=P و0001/0> P)؛ معنی­دار بودن اثرات اصلی BAP و ال-گلوتامین روی رشد طولی (به‌ترتیب با 0001/0> P و 0180/0=P)؛ نوع محیط ­کشت (0019/0=P)، BAP (0001/0=P) و ال-گلوتامین (0297/0=P) روی وزن تر بود (جدول 4).

بر اساس نتایج حاصل از آزمون مقایسه چند دامنه­ دانکن (جدول 5)، تأثیر مقدار تنظیم­کننده رشدی روی میزان نوساقه­زایی بطور معنی­داری متأثر از نوع محیط ­کشت به­کار برده شده بود؛ به‌طوری­که بیشترین تعداد نوساقه به­ازای ریز­نمونه (48/0± 66/6) با اختلاف معنی­داری نسبت به سایر تیمارهای هورمونی مورد مطالعه در این آزمایش، در محیط ­کشت GNH-A حاوی mg/l 6/3 BAP مشاهده گردید. استفاده از BAP  (1/1 یا 8/1 mg/l) یا ال-گلوتامین (mg/l800) منجر به افزایش طول نوساقه­ها تا cm22/1 با اختلاف معنی­دار نسبت به سایر تیمارها گردید. صفت وزن تر نیز که براساس آنالیز تجزیه واریانس بطور معنی­داری متأثر از اثرات اصلی تیمارهای بکار برده شده در این آزمایش شده بود؛ به‌نحوی‌که بیشترین وزن تر (تا g 01/0± 31/0) بطور جداگانه در محیط­ کشت  GNH-Aهمراه با mg/l 8/1 BAP یا mg/l800 ال-گلوتامین بدست آمد.  

 

 

جدول 4- آنالیز تجزیه واریانس تاثیر  نوع محیط کشت، ال-گلوتامین و BAP روی برخی صفات رشدی

منبع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات (MS)

میزان نوساقه­زایی

تعداد جوانه

رشد طولی نوساقه(cm)

وزن تر (g)

محیط کشت

1

*0770/0

**2356/0

ns5332/0

**1351/0

BAP

2

**2159/0

**2013/0

**8170/2

**2669/0

ال-گلوتامین

3

ns 0426/0

ns0497/0

*6052/0

*1248/0

محیط کشت BAP  ×

2

*0854/0

**2938/0

ns5271/0

ns0226/0

محیط کشت×  ال گلوتامین

3

ns 0441/0

*1041/0

ns0520/0

ns 0705/0

× BAP ال-گلوتامین  

6

ns 0233/0

ns0518/0

ns0832/0

ns 1404/0

ال-گلوتامین× محیط­کشت  BAP ×

6

ns 0271/0

ns0436/0

ns1761/0

ns0545/0

خطا

248

0212/0

0290/0

1769/0

0136/0

کل

271

 

 

 

 

ns بیانگر اختلاف غیر معنی­دار؛ * اختلاف معنی­دار در سطح   05/0=α و ** اختلاف معنی­دار در سطح 01/0=α براساس آزمون چند دامنه­ای دانکن می­باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


ج) تأثیر اکسین روی ریشه‌زایی پایه­های رویشی قزوینی: نتایج حاصل از تجزیه واریانس نشان داد که درصد ریشه­زایی بطور معنی­داری متأثر از نوع تنظیم­کننده رشدی (0004/0=P) و غلظت مورد استفاده (0559/0=P) بود (جدول 6)؛ به‌طوری‌که بیشترین درصد ریشه­زایی (%5 ±20) در محیط­ کشت GNH حاوی mg/l 2 NAA مشاهده شد (شکل 1الف و ب). براساس جدول تجزیه واریانس تأثیر متقابل نوع تنظیم­کننده رشدی × غلظت برای دو صفت تعداد ریشه (0388/0=P) و طول ریشه (0146/0=P) معنی­دار بود؛ به‌نحوی‌که غلظت mg/l 2 NAA منجر به حصول  75/0± 93/1 ریشه در هر جداکشت با طول  cm26/0± 78/0 گردید (جدول 6 و شکل 1).


 

جدول 6- آنالیز تجزیه واریانس تاثیر تنظیم­کنند­ه­های رشدیIBA  و NAA  روی صفات ریشه­زایی

منبع تغییرات

درجه آزادی

درصد ریشه­زایی  (%)

تعداد ریشه

طول ریشه (cm)

تنظیم کننده رشد

1

**2770/1

**4133/0

*9707/2

غلظت

3

*2483/0

*0891/0

*8196/0

غلظت × تنظیم کننده رشد

3

ns2128/0

*0856/0

*9759/0

خطا

120

0957/0

0297/0

2673/0

کل

127

 

 

 

 

(mg/l)NAA

 

(mg/l)IBA

 

3

2

1

0/0

 

3

2

1

0/0

 

تعداد ریشه به ازای ریزنمونه#

ab51/0±93/0

a75/0±93/1

b24/0±43/0

b0/0

a06/0±06/0

a0/0

a0/0

a0/0

طول ریشه به ازای ریزنمونه

ab10/0±21/0

a26/0±78/0

b18/0±34/0

b0/0

a12/0±12/0

a0/0

a0/0

a0/0

                         

ns بیانگر اختلاف غیر معنی­دار؛ * اختلاف معنی­دار در سطح   05/0=α و ** اختلاف معنی­دار در سطح 01/0=α می­باشد؛#حروف مختلف در هر سطر بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح 01/0=α  بر اساس آزمون چند دامنه­ای دانکن می­باشد.

 

 

 

 

شکل1-مقایسه آزمون چند دامنه­ای دانکن تاثیر عوامل اصلی نوع (الف) و غلظت تنظیم­کننده رشدی (ب) روی درصد ریشه­زایی. حروف  متفاوت بالای ستون­ها بیانگر اختلاف معنی­دار در سطح 01/0=α می­باشد.


بحث و نتیجه‌گیری

مرحله ضدعفونی و استقرار جداکشت درختان میوه به‌ویژه پسته باتوجه به پوشیده شدن جوانه­ها توسط فلس­های متعدد و تولید ترکیبات فنولی مختلف با مشکلات متعددی ازجمله آلودگی باکتریایی، قارچی و مرگ جوانه­ها بدلیل تولید ترکیبات فنولی سمی همراه است. با توجه به اینکه سن گیاه و همچنین زمان نمونه­برداری به‌عنوان یکی از عوامل تأثیرگذار در افزایش بازدهی ضدعفونی محسوب می­شود (22)؛ طی نمونه­برداری­های متعدد در بازه زمانی اسفند ماه تا اردیبهشت ماه، استقرار مواد گیاهی مربوط به فرودین ماه به دلیل میزان آلودگی پایین و تولید فنول کمتر، با موفقیت بیشتری همراه بود (نتایج نشان داده نشده است). علاوه بر این تأثیر نوع ماده ضدعفونی در مراحل ضدعفونی و استقرار بخوبی شناخته شده است. کلرید جیوه براساس نفوذپذیری سریع و قدرت بیشتر آن در ضدعفونی جوانه­های پسته بازدهی ضدعفونی را بیش از %60 افزایش داد.

استفاده از محیط ­کشت بهینه به‌عنوان یکی از ملزومات اصلی دستیابی به دستورالعمل­های موفق در زمینه ریزازدیادی گونه­های مختلف در شرایط درون­شیشه ازجمله پسته به‌شمار می­آید. مشکلات متعددی از قبیل شیشه­ای شدن (Hyperhydricity)، نکروزگی نوک ساقه (shoot-tip necrosis) و تولید کالوس پایه در انتهای نوساقه در نتیجه استفاده از محیط ­کشت­های رایج از قبیل MS، WPM و DKW گزارش شده است (3، 4، 18، 56). باتوجه به اینکه عموما هریک از محیط­ کشت­های MS،  DKW و WPM بطور اختصاصی برای برخی از گونه­های گیاهی بهینه­سازی شده­اند، استفاده آنها به شکل رایج در ریزازدیادی گونه­های مختلف گیاهی، در موارد متعدد عموما همراه با بروز مشکلاتی از قبیل فقر یا مسمویت عنصر و عناصر خاص (ناشی از کمبود یا بیش از حد آستانه تحمل رشدی گیاه) در شرایط درون­شیشه همراه بوده است (8، 9، 28). در مطالعات پیشین استفاده از محیط ­کشت GNH به دلیل برخی تغییرات در عناصر پرمصرف در مقایسه با MS، منجر به کاهش و یا حذف برخی از نارسایی­های رشدی فیزیولوژیکی در پسته گردید (16-17، 34-37). در این پژوهش بر اساس گزارش قبلی (44)، محیط کشت­های تغییر یافته (GNH-A و GNH-B) طراحی و تاثیر آنها همراه با سایر محیط­ کشت­های MS، DKW، WPM یا GNH روی برخی صفات رویشی پسته مورد بررسی قرار گرفت (جدول 1). نتایج حاصل از مقایسات چند دامنه­ای دانکن (جدول 3) نشان داد که استفاده از محیط­کشت تغییر یافته GNH-A در مقایسه با سایر محیط کشت­های مورد استفاده، منجر به افزایش معنی­دار در میزان نوساقه­زایی و تعداد جوانه به­ازای هر جداکشت گردید.

نظر به­ اینکه در محیط کشت GNH-A مقدار نمک NH4NO3 در مقایسه با محیط کشت GNH به 2/1 تقلیل یافته است؛ یکی از دلایل افزایش در میزان نوساقه­زایی را می­توان به تغییر نسبت یون­های نیترات به آمونیوم مرتبط دانست. نسبت NO3- به NH4+ همراه با مقدار مناسب نیتروژن کل از متغیرهای مؤثر در افزایش میزان ریزازدیادی گونه­های گیاهی به ­شمار می­آید (13، 28، 32، 44). همچنین در برخی گزارش­ها، غلظت NO3- توصیه شده در محیط کشت MS (mM4/39( از عوامل مهم محدود کننده رشدی در ریزازدیادی برخی گونه­های گیاهی حساس به ترکیبات محیط ­کشت ذکر شده است. به‌طوری‌که کاهش غلظت NO3- به MS2/1 منجر به بهبود صفات رشدی در Prunus sp.، از گونه های حساس به ترکیبات محیط کشت گردید (20، 23، 28، 44، 49). از طرفی، مقدار کم نیتروژن توصیه شده در محیط ­کشت WMP (mM71/14) منجر به فقر غذایی همراه با بروز برخی نارسایی­های رشدی از قبیل علائم کلروزگی با تأثیرات متعاقب منفی روی تعداد نوساقه و رشد کیفی آنها در ریزازدیادی زردآلو، از گونه­های حساس جنس Prunus sp. به منابع نیتروژن محیط ­کشت گردید (10). بررسی و مقایسه دقیق­تر تأثیر 40 نوع محیط ­کشت مختلف توسط شبکه عصبی مصنوعی (Artificial Neural Networks) روی یکی از پایه­های ­رویشی جنس Prunus (GF677)، ضمن مشخص کردن تأثیر یون­های عناصر پر مصرف روی صفات رشدی مورد مطالعه از قبیل میزان نوساقه­زایی، تعداد جوانه و وزن تر، کاهش غلظت نمک­های  NH4NO3 و Ca(NO3)2.4H2O به GNH2/1 در بهبود هرچه بیشتر شاخص­های رشدی پیش­بینی گردید (44) که با نتایج حاصل از این پژوهش مطابفت دارد. اخیرا پوتونگ و رید (2016) میزان نوساقه­زایی را در Prunus sp. با ایجاد تغییرات در نسبت­های NH4+:NO3- (mM40:mM10؛ mM60:mM30؛ mM60:mM45 در مقایسه با محیط کشت MS بطور معنی­داری افزایش دادند (50). در این مطالعه تغییر نسبت NH4+:NO3- به حدود 1:1 (mM24/10:mM10) در مقایسه با سایر تیمارهای مورد مطالعه تأثیر معنی­داری در بهبود میزان نوساقه­زایی داشت؛ که احتمالا بیانگر نیاز­های متفاوت گونه­های گیاهی به مقادیر مختلف عناصر پر­مصرف و کم­مصرف می­باشد.

افزودن BAP به محیط کشت در مقادیر mg/l 5/0-0/4 در ریزازدیادی گونه­های مختلف Pistacia sp. منجر به افزایش معنی­دار در میزان نوساقه­زایی گردیده است (12-13، 38-39، 44-48)، باوجوداین نظر به این مهم که میزان تنظیم­کننده رشدی مورد نیاز در مرحله ریزازدیادی با توجه به توازن ترکیبات محیط ­کشت متغیر است (1، 2، 23)، در این مطالعه تأثیر BAP روی تمامی صفات رشدی معنی­دار بود به‌طوری‌که بیشترین میزان نوساقه­زایی در غلظت mg/l 6/3 BAP در محیط کشت GNH-A دیده شد. باوجوداین، استفاده از مقادیر بیشتر از mg/l 8/1 این هورمون تأثیر منفی روی برخی صفات رشدی (مانند رشد طولی) داشت. در گزارش قبلی (17) نتایج بدست آمده نشان داد که افزون mg/l 1 BAP در ترکیب با mg/l 2/0-1/0 IBA منجر به افزایش معنی­دار روی برخی صفات رشدی از قبیل روند نوساقه­زایی و وزن تر گردید؛ که با نتایج ما در این مطالعه مطابقت دارد.

 ال-گلوتامین به­عنوان یکی از مهمترین آمینواسیدهای داخل سلولی با تأمین نیتروژن مورد نیاز در متابولیسم سلولی، نیتروژن مورد نیاز سلول را برای بیوسنتز اسیدهای­ آمینه، اسیدهای نوکلئیک و سایر ترکیبات حاوی نیتروژن را فراهم می­سازد (24)­. ال-گلوتامین اضافه شده به ترکیب محیط­ کشت در بهبود شاخص­های رشدی سایر گونه­های گیاهی در شرایط درون­شیشه مؤثر بوده است (5، 24، 52، 53). در این مطالعه براساس نتایج حاصل (جدول 5)، افزودن mg/l800 ال-گلوتامین در بهبود رشد طولی نوساقه­ها و وزن تر تأثیر معنی­داری داشت. با وجود تاثیر معنی­دار هر دو نوع تیمار ال-گلوتامین و BAP در بهبود صفات رشد طولی و وزن تر، با­توجه به پایین بودن مقدار این صفات در مقایسه با محیط­ کشت­های استاندارد مانند GNH (نمودار1 و جدول 3)، به نظر می­رسد که مطالعات بیشتری با در نظر گرفتن تأثیر سایر عوامل رشدی از قبیل منابع کربنی و یا سایر تنظیم­کننده­های رشدی برای بهبود هرچه بیشتر محیط ­کشت تغییر یافته GNH-A لازم است.

مرحله ریشه­زایی با توجه به نوع ژنوتیپ متأثر از انواع مختلف تنظیم­کننده­های رشدی است. به‌طوری‌که استفاده از NAA در تطابق با نتایج گزارش شده توسط سایرین (39) منجر به افزایش معنی­دار بازدهی ریشه­زایی گردید. در حالیکه در برخی کولتیوارهای P. vera بازدهی ریشه­زایی در حضور IBA به‌مراتب بیشتر از NAA گزارش شده است (30، 33، 55، 56)؛ که با نتایج ما مغایرت دارد.

در این پژوهش در راستای بومی­سازی ریزازدیادی یکی از پایه­های مهم رویشی پسته، ضرورت اعمال برخی تغییرات در ترکیبات محیط کشت، استفاده از BAP و همچنین کارایی استفاده از گلوتامین به‌عنوان اسید آمینه تأمین کننده منبع نیتروژن به‌منظور بهبود پارامترهای رشدی تشریح گردید. همچنین در مرحله ریشه­زایی، نتایج گرفته شده بیانگر تأثیر بارز NAA در مقایسه با IBA روی افزایش صفات ریشه­زایی بود. 

سپاسگزاری

این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه بین­المللی امام خمینی(ره) و با کد طرح پژوهشی 11606 در آزمایشگاه­ کشت بافت گروه بیوتکنولوژی دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی انجام شده است. بدین­وسیله نویسندگان مراتب تشکر و امتنان خود را از حمایت­های انجام شده در طی اجرای پروژه ابراز می­دارند.

1-      زبرجدی ع، معتمدی م، طراوت ا، اسماعیلی 1 (1392) ریزازدیادی گیاه دارویی سرخاگل (Echinacea purpurea L.) با استفاده از قطعات کوتیلدون و هیپوکوتیل انجمن زیست شناسی ایران 26(3): 311-319 .

2-کاویانی ب، غفاری ایسی زاد (1394) اثر غلظت‌های مختلف نفتالن‌استیک‌اسید و کینتین بر روی ریزازدیادی گیاه زینتی لیسیانتوس (Eustoma grandiflorum) مجله زیست شناسی ایران 28 (5): 920-933 .

 

3-Abousalim A, Mantell SH (1992) Micrografting of pistachio (Pistacia vera L. cv. Mateur). Plant Cell Tissue Organ Cult 29:231–234.

4-Akdemir H, Süzerer V, Onay A, et al (2013) Micropropagation of the pistachio and its rootstocks by temporary immersion system. Plant Cell, Tissue Organ Cult 1–12.

5-Ali A, Ahmad T, Abbasi NA, Hafiz IA (2009) Effect of different media and growth regulators on in vitro shoot proliferation of olive cultivar “moraiolo.” Pakistan J Bot 41:783–795.

6-Al-Safadi B, Elias R (2013) Enhancement of Pistachio (Pistacia vera L.) Propagation In Vitro Utilizing the Shoot and Embryo Culture Techniques. Int J Fruit Sci 10:96–108.

7-Arzani K, Ghasemi M, Yadollahi A, Hokmabadi H (2013) Study of foliar epidermal anatomy of four pistachio rootstocks under water stress. IDESIA (Chile) 31:101–107.

8-Ashrafi EN, Vahdati K, Ebrahimzadeh H, Mirmasoumi M (2010) Analysis of in vitro explants mineral contents to modify medium mineral composition for enhancing growth of Persian walnut (Juglans regia L.). Int J food, Agric Environ 8:325–329.

9-Bairu MW, Stirk A, Van Staden J (2009) Factors contributing to in vitro shoot-tip necrosis and their physiological interactions. Plant Cell, Tissue Organ Cult 98:239–248.

10-Bell RL, Srinivasan C, Lomberk D (2009) Effect of nutrient media on axillary shoot proliferation and preconditioning for adventitious shoot regeneration of pears. Vitr Cell Dev Biol 45:708–714.

11-Benmahioul B, Dorion N, Kaid-Harche M, Daguin F (2012) Micropropagation and ex vitro rooting of pistachio (Pistacia vera L.). Plant Cell, Tissue Organ Cult 108:353–358.

12-Benmahioul B, Kaïd-Harche M, Daguin F (2016) In vitro regeneration of Pistacia vera L. from nodal explants. J For Sci 62:198–203.

13-Can C, Ozaslan M, Toremen H, et al (2006) In vitro micrografting of pistachio, Pistacia vera L. var. Siirt, on wild pistachio rootstocks. J Cell Mol Biol 5:25–31.

14-Cao W, Tibbitts TW (1993) Study of various NH4+/NO3- mixtures for enhancing growth of potatoes. J Plant Nutr 16:1691–704.

15-Das P (2010) Mass cloning of Rose and Mussaenda, popular garden plants, via somatic embryogenesis. Hort. Sci. (Prague) 37(2): 70-78.

16-Delijam MA, Garoosi GA (2013) In vitro micropropagation of Pistachio (Pistacia vera. cv. Qazvini). MSc Thesis  Imam Khomeini International University (IKIU). pp. 107

17-Delijam MA, Garoosi GA, Nezami-Alanagh E, Hosseini R (2016) Improving Pistacia vera micropropagation: with emphasis on the efficiency of minerals , vitamins and PGRs. J. Plant Mol. Breed. 4:43–54.

18-Dolcet-Sanjuan R, Claveria E (1995) Improved shoot-tip micropropagation of Pistacia vera L. and the beneficial effects of methyl jasmonate. J Am Soc Hortic Sci 120:938–942.

19-Driver JA, Kuniyuki AH (1984) In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. HortScience 19:507–509.

20-Gago J, Pérez-Tornero O, Landin M, Burgos L, Gallego PP. (2011) Improving knowledge of plant tissue culture and media formulation by neurofuzzy logic: a practical case of data mining using apricot databases. J Plant Physiol 168:1858–1865.

21-García Martín E, Imbroda I, Lorente P, Andreu A (2012) Micropropagation and in vitro grafting techniques to assist the selection of a pistachio rootstock from a population of terebinth (Pistacia terebinthus L.) collected in the SE of Spain. Acta Hort (961):245-252.

22-George EF (1993) Plant propagation by tissue culture. Part 1: the technology. Exegetics Limited

23-George EF, Hall MA, De Klerk G-J (2008) Plant Propagtion by Tissue Culture 3rd Edtition. Springer The Netherlands, pp 205–226.

24-Hamasaki RM, Purgatto E, Mercier H (2005) Glutamine enhances competence for organogenesis in pineapple leaves cultivated in vitro. Brazilian J Plant Physiol 17:383–389.

25-Haque M, Siddique AB, Islam SS (2015) Effect of Silver Nitrate and Amino Acids on High Frequency Plants Regeneration in Barley (Hordeum vulgare L.). Plant Tissue Cult Biotechnol 25:37–50.

26-Hokmabadi H, Arzani K, Grierson PF (2005) Growth, chemical composition, and carbon isotope discrimination of pistachio (Pistacia vera L.) rootstock seedlings in response to salinity. Crop Pasture Sci 56:135–144.

27-Hussain N, Zaka MA, Tahir M, et al (2002) Growth response of barley to calcium under saline conditions. Pak J Agron 1(2-3): 77-79.

28-Ivanova M, Van Staden J (2009) Nitrogen source, concentration, and NH4+: NO3 ratio influence shoot regeneration and hyperhydricity in tissue cultured Aloe polyphylla. Plant Cell, Tissue Organ Cult 99:167–174.

29-Karimi S, Rahemi M (2012) Growth and Chemical Composition of Pistachio Seedling Rootstock in Response to Exogenous Polyamines under Salinity Stress. Int J Nuts Relat Sci 3:21–29.

30-Kılınc FM, Suzerer V, Ozden Y, Onay A(2015) Clonal micropropagation of Pistacia lentiscus L. and assessment of genetic stability using IRAP markers. Plant Growth Regul. 75(1):75-88.

31-Lloyd G, McCown B (1980) Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. In: Combined Proceedings, International Plant Propagators’ Society. pp 421–427.

32-Lopes MS, Araus JL (2008) Comparative genomic and physiological analysis of nutrient response to NH4+, NH4+:NO3- and NO3- in barley seedlings. Physiol Plant 134:134–150.

33-Mahdia F. Gabr SAH (2012) In vitro propagation of Pistacia vera L. rootstock 21:300–304.

34-Maleki S (2014a)  Study the effect of auxin transfer inhibitors on Peroxidase and IAA-Oxidase activity in micropropagation of Ghazvini and UCB1 hybrid pistachio rootstocks . Thesis, Imam Khomeini International University (IKIU) pp. 98.

35-Maleki S, Garoosi GA, Haddad R, Nezami A E (2013) A step towards providing micropropagation protocol in Pistacia vera cv. Ghazvini rootstock: with emphasis on the effect of Scopoletin. In: National conference on the latest scientific research and Pistachios .  University of Torbat Heydarieh, Pster.

36-Maleki S, Garoosi GA, Haddad R, Nezami-Alanagh E (2014b) The antioxidative effect of some shoot and root inducers in Pistacia vera (Ghazvini and UCB-1 rootstocks) under in vitro conditions. Genet Eng Biosaf J 2:135–144.

37-Maleki S, Garoosi GA, Haddad R, Nezami-Alanagh E (2015) Extraction and evaluation of peroxidases from Pistacia vera ( UCB-1 and Gazvini rootstocks ) in in vitro conditions. J Interam Soc Trop Hortic 56:21–27.

38-Marín JA, García E, Lorente P, Andreu1 P, Arbeloa1 A (2016) A novel approach for propagation of recalcitrant pistachio cultivars that sidesteps rooting by ex vitro grafting of tissue cultured shoot tips. Plant Cell Tissue Organ Cult 124:191–200.

39-Mascarello C, Fascella G, Zizzo GV, Mantovani E RB (2007) In vivo and in vitro propagation of Pistacia lentiscus L. vol 764, ISHS,. In: Proc. XXVII IHC-S10 Plant Biotechnology. In: Chief Read PE (ed) Acta Hortic., pp 299–306

40-Mohammadi AH, Banihashemi Z, Maftoun M (2007) Interaction between salinity stress and Verticillium wilt disease in three pistachio rootstocks in a calcareous soil. J Plant Nutr 30:241–252.

41-Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15:473–497.

42-Namli S, Ayaz E (2007) Influence of different cytokinins used in in vitro culture on the stoma morphology of pistachio (Pistacia vera L. cv. Siirt). African J Biotechnol 6:561–563.

43-Nezami-Alanagh E, Garoosi GA, Haddad R (2010) The effect of PGRs on in vitro shoot multiplication of GF677 hybrid (Prunus persica× P. amygdalus) rootstock on GNH medium. Iran J Gen Plant Breed 1: 34-43.

44-Nezami-Alanagh E, Garoosi GA, Haddad R, Maleki S., Landin M, Gallego PP. (2014) Design of tissue culture media for efficient Prunus rootstock micropropagation using artificial intelligence models. Plant Cell, Tissue Organ Cult 117:349–359.

45-Onay A (2000) Micropropagation of pistachio from mature trees. Plant Cell Tissue Organ Cult 60:159–163.

46-Onay A (2003) Micropropagation of pistachio. In: Micropropagation of Woody Trees and Fruits. Springer, pp 565–588

47-Onay A, Pirinc V, Yildirim H, Basaran D (2004) In vitro micrografting of mature pistachio (Pistacia vera var. Siirt). Plant Cell Tissue Organ Cult 77:215–219.

48-Ozden-Tokatli Y, Ozudogru EA, Akcin A (2005) In vitro response of pistachio nodal explants to silver nitrate. Sci Hortic (Amsterdam) 106:415–426.

49-Pérez-Tornero O, Burgos L (2000) Different media requirements for micropropagation of apricot cultivars. Plant Cell Tissue Organ Cult 63:133–141.

50-Poothong S, Reed BM (2016) Optimizing shoot culture media for Rubus germplasm: the effects of NH4+, NO3, and total nitrogen. Vitr Cell Dev Biol - Plant. 52(3):265-275doi: 10.1007/s11627-016-9750-0

51-Safari Z, Mehrabi AA, Arminian A (2013) In Vitro proliferation and ex vitro rooting of wild pistachio (Pistacia atlantica spp Mutica, accession: Kabirkuh). Int J Agr Env 2:23–31.

52-Seran TH (2007) Anther Culture in Tea Improvement. Med Aromat Plant Sci Biotechnol 1(2): 234-239.

53-Siwach P, Gill AR (2011) Enhanced shoot multiplication in Ficus religiosa L. in the presence of adenine sulphate, glutamine and phloroglucinol. Physiol Mol Biol Plants 17:271–280.

54-Smiciklas KD, Below FE (1992) Role of cytokinin in enhanced productivity of maize supplied with NH4+ and NO3. Plant Soil An Int J Plant-Soil Relationships 142:307–313.

55-Tilkat E, Onay a., Yildirim H, Çetin Ozen H (2008) Micropropagation of mature male pistachio Pistacia vera L. J Hortic Sci Biotechnol 83:328–333.

56-Yıldırım H (2012) Micropropagation of  Pistacia lentiscus L. from axenic seedling-derived explants. Sci Hortic (Amsterdam) 137:29–35.