مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

تجزیه پروتئوم بذر کلزا تحت تنش شوری

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه تبریز

چکیده

کلزا به عنوان یکی از محصولات تولید کننده دانه‌های روغنی از اهمیت ویژه‌ای برای تولید روغن خوراکی گیاهی برخوردار است ولی تحت تنش شوری به میزان قابل ملاحظه‌ای تحت تاثیر اثرات منفی تنش قرار می‌گیرد. به منظور مطالعه اثرات تنش شوری روی برخی صفات رشدی و تغییرات الگوی پروتئوم بذر تحت تنش شوری شدید، رقم حساس ساری گل در شرایط گلخانه‌ای کشت و تحت تنش شوری در سه سطح 0، 175 و 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم قرار گرفت. کشت بذور در سیسنم هیدروپونیک از نوع بستر جاری صورت گرفت. برای مطالعه تغییرات الگوی پروتئوم بذور، از تکنیک الکتروفورز ژل دوبعدی استفاده شد. نتایج حاصل نشان داد که با افزایش سطح تنش وزن تر، وزن خشک بخش هوایی، ارتفاع بوته، عملکرد دانه و وزن صد دانه به طوری معنی داری کاهش پیدا می‌کنند و میزان پرولین در برگ نیز افزایش پیدا می‌کند. مقایسه الگوی پروتئوم بذور نشان داد که تحت تنش شدید شوری (350 میلی مولار) 29 لکه پروتئینی دچارتغییرات بیان می‌شوند. شناسایی این لکه‌ها مشخص کرد که این پروتئین‌ها در شش گروه عملکردی شامل: متابولیسم کربن، دفاع-سم‌زدایی، پروتئین ذخیره‌ای، فتوسنتز، متابولیسم نیتروژن و سنتز-تجزیه در گیر هستند. بیشتر لکه‌های دارای تغییرات بیان مربوط به گروه متابولیسم کربن و دفاع-سم زدایی بودند. تنش شوری بطور معنی‌داری باعث کاهش خصوصیات رشدی ساری گل و تغییر الگوی پروتئومی و سطح بیان بذور گردید. بیش از 65 درصد لکه‌های پروتئینی در بذر ساری گل کاهش بیان معنی‌دار پیدا نشان دادند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Proteomic profiling analysis of rapeseed under salinity stress

نویسنده [English]

  • sheida Alipour ghorbani

چکیده [English]

Rapeseed as one of the crops which is being cultivated in order to produce edible oil, have essential importance, however, it is severely influenced by salt stress. In the aim of studying effects of salinity on the growth characteristics and proteome profiling changes, Sarigol (salt-sensitive) was cultured under greenhouse conditions and salinity stress exerted at three levels, including 0, 175 and 350 mM NaCl. Seeds were sown in the current hydroponic system. To study the changes of proteome profile, 2-dimentional gel electrophoresis technique was used. The results indicated that fresh weight, shoot dry weight, shoot height, grain yield, and 100-grain weight significantly decreased with increasing intensity of salinity stress and proline concentration increased in leaves as well. Comparing the proteome profile of seed demonstrated that 29 spots with differentially expression changes occurred under 350 mM NaCl. Differentially expression spots were identified and grouped in six functional categorize, including carbon metabolism, defense/detoxification, storage proteins, photosynthetic, nitrogen metabolism, and synthesis/degradation. The majority of identified proteins involved in carbon metabolism and defense/detoxification. Salt stress decreased significantly the growth characters of Sarigol and altered proteome profile and protein expression of seeds. More than 60% of spots indicated significant down-regulation.

کلیدواژه‌ها [English]

  • salinity stress
  • proteomic
  • Sarigol
  • seed

تجزیه پروتئوم بذر کلزا تحت تنش شوری

علی بنده­حق*، شیدا علیپور قربانی،محمود تورچیو رضا شکری قره­لو

تبریز، دانشگاه تبریز، دانشگاه تبریز، گروه به‌نژادی و بیوتکنولوژی گیاهی

تاریخ دریافت: 30/11/94              تاریخ پذیرش: 1/3/96

چکیده

کلزا به‌عنوان یکی از محصولات تولید کننده دانه­های روغنی از اهمیت ویژه­ای برای تولید روغن خوراکی گیاهی برخوردار است ولی تحت تنش شوری به میزان قابل ملاحظه­ای تحت تأثیر اثرات منفی تنش قرار می­گیرد. به‌منظور مطالعه اثرات تنش شوری روی برخی صفات رشدی و تغییرات الگوی پروتئوم بذر تحت تنش شوری شدید، رقم حساس ساری گل در شرایط گلخانه­ای کشت و تحت تنش شوری در سه سطح 0، 175 و 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم قرار گرفت. کشت بذرها در سیسنم هیدروپونیک از نوع بستر جاری انجام شد. برای مطالعه تغییرات الگوی پروتئوم بذرها، از تکنیک الکتروفورز ژل دوبعدی استفاده شد. نتایج حاصل نشان داد که با افزایش سطح تنش وزن تر، وزن خشک بخش هوایی، ارتفاع بوته، عملکرد دانه و وزن صد دانه به‌طوری معنی‌داری کاهش پیدا کرد و میزان پرولین در برگ نیز افزایش پیدا نمود. مقایسه الگوی پروتئوم بذرها نشان داد که تحت تنش شدید شوری (350 میلی مولار) 29 لکه پروتئینی دچار تغییرات بیان می­شوند. شناسایی این لکه­ها مشخص کرد که این پروتئین­ها در شش گروه عملکردی شامل متابولیسم کربن، دفاع-سم­زدایی، پروتئین ذخیره­ای، فتوسنتز، متابولیسم نیتروژن و سنتز-تجزیه درگیر هستند. بیشتر لکه­های دارای تغییرات بیان مربوط به گروه متابولیسم کربن و دفاع-سم زدایی بودند. تنش شوری بطور معنی­داری باعث کاهش خصوصیات رشدی ساری گل و تغییر الگوی پروتئومی و سطح بیان بذرها گردید. بیش از 65 درصد لکه­های پروتئینی در بذر ساری گل کاهش بیان معنی­دار پیدا نشان دادند.

واژه‌های کلیدی: بذر، تنش شوری، پروتئومیکس، ساری گل

* نویسنده مسئول، تلفن: 04133392031 ، پست الکترونیکی: bandehhagh@yahoo.com

مقدمه

 

شوری از عوامل مهم کاهش رشد و عملکرد بسیاری از محصولات زراعی در مناطق خشک و نیمه خشک دنیا به شمار می­رود و اثرات زیانباری روی عملکرد گیاهان دارد. کره زمین یک سیاره شور است و اکثریت آب آن محتوی حدود 30 گرم بر لیتر کلرید سدیم می­باشد. این آب­های شور زمین­هایی که محصولات کشاورزی در آن کشت می­شوند را تحت تأثیر قرار می­دهند و خطری جدی برای توسعه کشت محصولات کشاورزی هستند (31).

مکانیسم­های مولکولی دخیل در مقاومت گیاهان به شوری بسیار پیچیده است و ژن­های زیادی در آن دخیل می­باشند. برای مطالعه مکانیسم­های تحمل به تنش شوری، شناسایی عوامل، مسیرهای بیولوژیکی، پروتئین های دخیل و آگاهی به عملکرد مولکولی آنها در سلول، لازم است که مطالعات مولکولی در دو جهت ژنومیک ساختاری و عملکردی در گیاه کلزا تحت شرایط مختلف تنش شوری انجام شود (35). اطلاعات حاصل از مطالعات ژنومیکس ساختاری اگرچه برای شناسایی ژن راهکار مناسبی است ولی برای پیش بینی و تعیین ساختار و عمل پروتئین­ها کافی نمی‍باشد، زیرا تغییرات پس از ترجمه لازمه فعال شدن بسیاری از پروتئین­هاست (21). بیشتر این تغییرات را نمی‍توان از روی توالی DNA و یا mRNA پیش ‌بینی کرد. رهیافت پروتئومیک امکان مطالعه بیان ژن‌های پاسخ ‌دهنده به تنش شوری و شناسایی مسیرهای مولکولی یا انتقال پیام‌ را فراهم می‌کند (35). در سال­های اخیر، مطالعات زیادی در راستای مطالعه پروتئوم بافت­های مختلف کلزا با هدف شناسایی پروتئین­های پاسخ دهنده به تنش انجام شده است. بنده حق و همکاران (2011) در مطالعه­ای که روی ارقام حساس و متحمل کلزا تحت تنش شوری انجام داده­اند، گزارش کرده­اند که پروتئین­های درگیر در تنش اکسیداتیو، انتقال الکترون، ترجمه و فتوسنتز به طور معنی داری تغییر بیان پیدا می­کنند.  

دانه کلزا دارای 40 درصد روغن و 17 تا 26 درصد پروتئین می­باشد که بخش اعظم پروتئین­های آن را ناپین (Napin)، کروسیفرین (Cruciferin) و الئوسین (Oleosin) تشکیل می­دهد. به همین دلیل دانه­های کلزا برای استفاده در صنایع غدایی دارای پتانسیل خوبی است (25). از این رو توسعه کشت کلزا برای تولید دانه­های روغنی مرغوب برای مصارف خوراکی به دلیل صفات مطلوب آن مورد توجه قرار گرفته است. در ایران کشت کلزا  عمدتا به مناطق نیمه ‌خشک اختصاص یافته است که عمدتا دارای خاک­های سدیمی و شور هستند. این موضوع پتانسیل تولید گیاه را با محدودیت رو به رو می­کند (1). پروتئوم بذر به طور مستقیم متأثر از تنش‌ شوری نیست ولی بازتابی از پاسخ سایر اندام‌ها همانند برگ و ریشه در فرایند تنش و تحمل آن است که در نهایت بر ترکیب پروتئینی بذر اثر می­گذارد. با وجود اینکه پروتئین­های شناسایی شده از مطالعه پروتئوم بذرها، کاندیداهایی برای افزایش تحمل گیاهان به تنش شوری نیستند اما منعکس کننده تأثیرات تنش شوری روی فرایندهای بیولوژیکی بذر هستند (44). در گزارش عیوضلو و همکاران (1392) که در رابطه با تجزیه پروتئوم بذر کلزای رقم  Hyola308(مقاوم به شوری) تحت تنش شوری انجام شده است، 28 لکه پروتئینی دارای تغییرات بیان ملاحظه شده است که در این بین سهم عمده پروتئین‌های شناسایی شده متعلق به گروه پروتئین‌های درگیر در دفاع، سم زدایی و پروتئین‌های ذخیره ای بوده است.

برای آگاهی از مکانیسم­های ملکولی واکنش به تنش شوری، شناسایی پروتئین­های دخیل در فریندهای مولکولی یکی راهکارهای موجود و مؤثر است. در راستای این هدف، این مطالعه به منظور بررسی تأثیر تنش شوری روی خصوصیات مورفولوژیکی و شناسایی لکه­های پروتئینی با تغییرات بیان معنی­دار در بذرهای کلزا اجر گردید.

مواد و روشها

مواد گیاهی و مشخصات سیستم کشت: این آزمایش به منظور بررسی اثر تنش شوری روی صفات مورفولوژیک و الگوی بیان پروتئین­های بذر رقم حساس کلزا (ساری گل) تحت سطوح 175 و 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با سه تکرار اجرا گردید. بذرهای رقم حساس ساری گل بعد از استریل شدن با استفاده از هیپوکلرید سدیم در پلت های اتوکلاو شده برای جوانه زنی قرار گرفتند. سپس گیاهچه­های حاصل در سیستم هیدروپونیک نشاکاری شدند. بعد از یک هفته تنش شوری در سه سطح صفر، 175 و 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم پس از استقرار کامل گیاهچه­ها اعمال و تا زمان برداشت گیاهان ادامه یافت. سیستم هیدروپونیک از نوع بستر جاری و کشت درون ماسه بود. از محلول غذایی هوگلند تغییر یافته (6) برای تغذیه گیاهان استفاده گردید. pH محلول غذایی در محدوده 6.0±5.5 تنظیم شد.

اندازه‌گیری صفات مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی: صفات رشدی شامل وزن تر و خشک بوته­ها، ارتفاع بوته­ها، عملکرد و وزن صد دانه و میزان پرولین آزاد گیاهان در زمانی که 90 درصد نیام­ها زرد شده بودند، اندازه­گیری گردید. برای محاسبه عملکرد دانه تعداد خورجین و تعداد دانه در هربوته شمارش شدند و بعد وزن صد دانه اندازه گیری شد. برای شمارش بذرها از دستگاه بذر شمار Contador – Pfeuffer Germany استفاده شد. برای اندازه گیری غلظت پرولین در نمونه­های (تر) برگ از روش بیتس و همکاران (1973) استفاده شد. مقدار 1/0 گرم از نمونه تر برگ را با 10 میلی لیتر اسید سولفوریک 3% در لوله آزمایش­های مخصوص هر تیمار مخلوط کرده و درب لوله آزمایش­ها را با فویل بسته و به مدت یک ساعت در تاریکی و در دمای محیط قرار داده شدند. سپس 2 میلی لیتر از عصاره به دست آمده را همراه با 4 میلی لیتر معرف نین هیدرین و دو میلی لیتر اسید استیک گلاسیال در لوله آزمایش ریخته و به مدت یک ساعت در حمام آب گرم با درجه حرارت 100 درجه سانتی گراد قرار گرفت. پس از خارج کردن از حمام و سرد شدن لوله­ها، 4 میلی لیتر تولوئن به آن اضافه کرده و 20 ثانیه خوب تکان داده تا کاملاً مخلوط شود. در لوله آزمایش دو فاز تشکیل می­شود، فاز آلی صورتی رنگ در بالا و فاز آبی بی­رنگ و شفاف که در قسمت پایین قرار دارد. فاز آلی برای رنگ سنجی در دستگاه اسپکتروفتومتر و طول موج 520 نانومتر استفاده شد. برای رسم منحنی استاندارد از پرولین خالص با غلظت های 0، 50، 100، 200، 250 میکرومولار استفاده و تمام مراحل کار روی آن انجام گردید. در پایان بر اساس منحنی استاندارد رسم شده مقدار پرولین محاسبه گردید.

الکتروفورز ژل دو بعدی:  بذر گیاهان شاهد و گیاهان تحت تنش شدید شوری (350 میلی مولار نمک کلرید سدیم) برای مطالعه تغییرات الگوی پروتئوم به فریزر oc80- منتقل شدند. از روش پیشنهادی فینی (2002) برای استخراج پروتئین­ها استفاده شد. تعیین غلظت پروتئین­های استخراج شده برای بار گذاری مقدار صحیحی از محلول پروتئینی در بعد اول به روش برادفورد (1976) انجام شد. الکتروفورز بعد اول با دستگاه (Bio Rad) Protein IEF focusing Cell اجرا گردید. در این بعد پروتئین­ها بر اساس نقطه ایزوالکتریک در شیب pH 3 تا 10تفکیک گردیدند. سپس بعد دوم برای جداسازی پروتئینی­ها براساس وزن مولکولی با استفاده از ژل پلی آریلامید واسرشته انجام شد و از مارکرهای پروتئینی برای تعیین وزن مولکولی لکه­ها استفاده شد. ظاهر­سازی لکه­های پروتئینی با نیترات نقره بر اساس روش بلوم 1987 با اندکی تغییرات انجام شد. اسکن ژل‌ها با دنسیومتر 800)-(Bio Rad, GS با وضوح بالا ( 6000 dpi) و شناسایی لکه­های پروتئینی و کمی کردن آنها با استفاده از نرم‌افزار Melanie 4.0 انجام گردید. تجزیه داده‌های کمی (درصد حجمی لکه­های پروتئینی) حاصل از نقاط تکرار پذیر با استفاده از آزمون t در نرم‌افزار MSTATC انجام شد. فاکتور القا بیش از 2 و کمتر از 0.5 به ترتیب برای تعیین افزایش یا کاهش بیان لکه­ها پروتئینی در نظر گرفته شد. برای بدست آوردن فاکتور القا لکه­های پروتئینی، حجم هر لکه در ژل حاصل از گیاهان تحت تنش شوری، تقسیم بر حجم لکه مربوطه در ژل بدست آمده از گیاهان شاهد (بدون تنش شوری) شد. عدد حاصل برای تعیین معنی­دار بودن و یا نبودن و نیز تعیین افزایش یا کاهش بیان یافتن هر لکه مورد استفاده قرار گرفت. با استفاده از نقطه ایزوالکتریک  و وزن مولکولی، لکه­های دارای تغییرات بیان مورد شناسایی قرار گرفتند. نرم افزار آنلاین (http://web.expasy.org/tagident/) Expasy-TagIden برای جستجوی داده پایگاه­های پروتئینی به کار برده شد. این نرم افزار با استفاده از وزن مولکولی و نقطه ایزوالکتریک به صورت احتمالی پروتئین­ها را شناسایی می­کند.

نتایج

آنالیز داده­های حاصل از اندازه گیری­های مورفولوژیکی نشان داد که اثر تنش شوری روی صفات مورد مطالعه به جز وزن خشک ریشه معنی دار است. عملکرد دانه و وزن صد دانه در سطح 5 درصد و بقیه صفات در سطح 1 درصد معنی دار شدند (جدول 1). مقایسه میانگین داده­ها نشان داد که با افزایش شدت تنش شوری کاهش در صفات بیشتر اتفاق می­افتد. وزن خشک بخش هوایی در مقایسه با شاهد در بین صفات مورد مطالعه بیشتر کاهش پیدا کرد. همچنین میانگین وزن صد دانه تحت تنش 175 میلی مولار کاهش معنی داری نداشت ولی تحت تنش 350 میلی مولار به طور معنی داری کاهش پیدا کرد.

 

 

جدول 1 تجزیه واریانس تاثیر تنش شوری روی صفات رشدی رقم حساس ساری گل

منابع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

 

 

وزن تر بوته

 وزن خشک بخش هوایی

وزن خشک  ریشه

ارتفاع بوته

عملکرد دانه

وزن صد دانه

پرولین

تنش

2

162091/55**">

1641/814**">

226/0

16731/207**">

1678/276*">

160/014*">

161212/845**">

خطا

4

280/41

710/0

106/0

355/14

981/8

001/0

821/60

CV (%)

 

56/15

67/11

42/39

34

75/46

15/11

91/40

*و ** به ترتیب معنی داری در سطح 1 و 5 درصد. CV نشانگر ضریب تغییرات.

 

 

در بین صفات مورد مطالعه میانگین وزن صد دانه کمتر تحت تأثیر اثرات منفی تنش شوری قرار گرفت. میزان پرولین آزاد نیز با افزایش سطح تنش شوری  کاهش معنی داری پیدا کرد (شکل 1).  

تجزیه پروتئوم بذر تحت تنش شدید شوری: برای بررسی تغییرات بیان لکه­های پروتئینی از نرم افزار Melanie 4.0 استفاده شد و فاکتور القای بیش از 2 برای تعیین افزایش بیان و کمتر از 0.5 برای مشخص کردن لکه­های دارای کاهش بیان در نظر گرفته شد. از بین 513 لکه پروتئینی شناسایی شده توسط نرم افزار، 29 لکه پروتئینی دارای تغییرات بیان معنی دار تحت تنش شدید شوری بودند (شکل 2). با استفاده از نقطه ایزوالکتریک و وزن مولکولی لکه­ها، شناسایی احتمالی لکه­ها انجام گردید و طبقه بندی لکه­ها در گروه­های عملکردی بر اساس واکنشی که در آن شرکت می­کنند انجام شد (15). بر این اساس لکه­­ها در شش گروه عملکردی شامل متابولیسم کربن، دفاع-سم­زدایی، پروتئین ذخیره­ای، فتوسنتزی، متابولیسم نیتروژن و سه لکه به سنتز-تجزیه مربوط بود و یک لکه ناشناخته ماند (جدول2 و شکل 3).

 پروتئین‌های درگیر در متابولیسم کربن: بررسی نتایج حاصل نشان داد که بیشتر پروتئین­های دارای تغییرات بیان در پروتئوم بذر کلزا در متابولیسم کربن دخیل هستند. برخی از این لکه­ها افزایش و برخی کاهش بیان داشتند. لکه‌های پروتئینی 2، 5، 6 و 9 افزایش بیان، در حالیکه لکه‌های پروتئینی 11، 12، 18، 21،23، 26، 28 و 29 کاهش بیان نشان دادند (شکل3 و جدول2).

  پروتئین‌های درگیر در دفاع و سم‌زدایی: پروتئین­های درگیر در دفاع و سم زدایی همانند پروتئین­های دخیل در متابولسیم کربن برخی افزایش و برخی کاهش بیان پیدا کرده بودند. پروتئین­های که کاهش بیان داشتند بیشتر از پروتئین­های دارای افزایش بیان بودند. دو پروتئین 7 و 8 افزایش بیان داشتند، در حالیکه پروتئین‌های 13، 14، 17، 19، 24 و 25 کاهش بیان را نشان دادند (شکل2 و جدول2).

پروتئین‌های ذخیره‌ای: دو لکه پروتئینی مربوط به گروه پروتئین­های ذخیره­ای (لکه 3 و 4) تحت تنش شدید افزایش بیان نشان دادند (شکل2 و جدول2).

پروتئین‌های دخیل در فتوسنتز:دو پروتئین درگیر در فتوسنتز (لکه 10 و 15) شامل لکه شماره­ 10 و شماره 15 به‌ترتیب افزایش و کاهش بیان داشتند (جدول2 و شکل3).

پروتئین‌های دخیل در متابولیسم نیتروژن: لکه پروتئینی شماره 27 در این گروه قرار دارد و تحت تنش شوری کاهش بیان نشان داد (شکل2 و جدول2).


 

 

 

 

 

 

 

 

 


شکل 1 - مقایسه میانگین صفات مورد مطالعه. حروف مشابه عدم معنی داری و حروف غیر مشابه معنی داری را نشان می­دهند

 

شکل 2 - لکه­های دارای تغییرات بیان معنی دار بر اساس فاکتور القاء، لکه­های با فاکتور القا بیش از 2 و کمتر از 0.5 به ترتیب به عنوان افزایش و کاهش بیان در نظر گرفته شدند.

 

شکل 3 - گروه بندی پروتئین­های با تغییرات بیان معنی دار تحت تنش شوری شدید (350 میلی مولار نمک کلرید سدیم)

 

شکل 4- الگوی پروتئوم بذر گیاه شاهد (سمت راست) و تنش شوری با 350 میلی مولار نمک کلرید سدیم (سمت چپ). فلش­ها لکه­های دارای تغییرات بیان را روی ژل گیاه تحت تنش شوری نشان می­دهند.

 

 

 

جدول2- مشخصات پروتئین­های دارای  تغییرات بیان در بذر تحت تنش شوری شدید

 

 

 

عملکرد

فاکتور القا

تئوریMW(kDa)/pI

مشاهده شده MW(kDa) /pI

NCBIدر شماره دسترسی

   پروتئین همولوگ 

شماره لکه

 

سنتز/ تجزیه

32/7

52/5-18

1/6-5/19

24954801

Type I small heat shock  

1

 

متابولیسم کربن

98/5

67/6-0/36

92/6-8/34

120680

Glyceraldehyde 3-phosphate

 dehydrogenase

 

2

 

پروتئین ذخیره­ای

54/6

36/7-1/57

21/7-9/56

215398472

Globulin 3 B

3

 

پروتئین ذخیره­ای

98/3

78/7-7/66

1/8-1/67

215398470

globulin 3

4

 

متابولیسم کربن

54/6

96/5-8/47

6/5-3/43

9408184

16F0F1">  ATPase alpha subunit

5

 

متابولیسم کربن

10/8

83/7-4/25

51/7-2/24

7579064

Cytosolic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

6

 

 

دفاع/ سم­زدایی

87/6

98/4-7/59

2/5-1/59

9858781

BAC19.13

7

 

دفاع/ سم­زدایی

32/7

62/5-9/18

3/5-5/17

123957

Alpha-amylase/ trypsin inhibitor 16CM3">

8

 

متابولیسم کربن

49/6

15/8-7/44

9/7-1/43

319739540

aestivum stearoyl- ACP desaturase

9

 

فتوسنتز

12/8

06/9-2/27

92/8-1/28

2570499

23 kDa polypeptide of photosystem II

10

 

متابولیسم کربن

28/0

2/5-8/51

9/4-3/41

6136111

UDP- glucose pyrophosphorylase

11

 

متابولیسم کربن

27/0

53/5-3/52

1/6-9/49

340287

small subunit ADP glucose pyrophosphorylase

12

 

دفاع/ سم­زدایی

26/0

62/5-43

9/4-3/41

75313848

Serpin- 16Z1"> C

13

 

دفاع/ سم­زدایی

09/0

44/5-3/43

5/6-9/42

224589266

Serpin 1

14

 

فتوسنتز

37/0  

22/6-4/53

5/6-1/55

14017580

Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase large subunit

15

 

ناشناخته

35/0

81/5-1/86

2/6-1/88

326510251

Predicted protein

16

 

عملکرد

فاکتور القا

تئوری MW(kDa) /pI

مشاهده شده MW(kDa) /pI

NCBIدر شماره دسترسی

   پروتئین همولوگ 

شماره لکه

 

 

 

 

 

 

 

 

 

دفاع/ سم­زدایی

41/0

17/6-77

3/6-6/75

48093951

late embryogenesis abundant protein

17

 

متابولیسم کربن

31/0

02/6-48

6/6-3/47

92875135

isocitrate dehydrogenase  

18

 

دفاع/ سم­زدایی

17/0

01/5-33

6/5-6/33

170692

Group 3 late embryogenesis abundant protein

19

 

سنتز/ تجزیه

14/0

10-5/80

              9/4-6/78

32765549

Cytosolic heat shock protein 90

20

 

متابولیسم کربن

18/0

56/6-2/39

9/5-6/37

218157

cytoplasmic aldolase  

21

 

سنتز/ تجزیه

14/0

4/9-1/26

1/9-2/27

37788308

Cyclophilin-like protein

22

 

متابولیسم کربن

30/0

             6/8-1/31

9/8-3/32

32400764

beta amylase

23

 

دفاع/ سم­زدایی

18/0

1/5-28

8/6-5/26

15808779

Ascorbate peroxidase

24

 

دفاع/ سم­زدایی

24/0

84/5-30

2/6-1/31

3688398

Ascorbate peroxidase

25

 

متابولیسم کربن

12/0

4/6-2/22

9/5-3/20

2204226

alpha-galacrosidase 

26

 

متابولیسم نیتروژن

15/0

93/5-4/53

3/6-6/54

1703227

Alanine aminotransferase 2

27

 

متابولیسم کربن

21/0

19/6-57

1/7-1/56

995746

ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit

28

 

متابولیسم کربن

22/0

89/5-4/58

2/6-1/57

32812836

ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit

29

 
                                         

 


پروتئین‌های درگیر در سنتز و تجزیه:لکه­های شماره 1، 20 و 22 جزء پروتئین­های درگیر در سنتز و تجزیه قرار گرفتند. از بین آنها پروتئین شماره 1 افزایش بیان و پروتئین­های شماره 20 و 22 کاهش بیان نشان دادند (شکل 2).

بحث

تنش شوری به طور قابل ملاحظه‌ای وزن‌ تر و خشک برگ، وزن هزار دانه و عملکرد دانه را کاهش می‌دهد (32). شوری تأثیرات منفی روی صفات مورفولوژیکی گیاهان دارد و  موجب کاهش معنی‌دار در صفات رشدی مانند سطح برگ، وزن‌ تر و خشک  ساقه و کاهش ارتفاع بوته می‌شود. تجمع یون­های سمی و عدم توانایی گیاه در جذب کافی آب تحت تنش شوری می­تواند از دلایل مهم کاهش صفات رشدی گیاهان زراعی تحت تنش شوری باشد (30). پرولین یکی از وسیع‌ترین و گسترده‌ترین اسمولیت‌ها است که تجمع آن در شرایط تنش با عمل تنظیم اسمزی همبستگی زیادی دارد. در گیاهان پرولین از مسیر اسید گلوتامیک یا اورنتین ساخته می‌شود (45). افزایش تجمع پرولین در گیاه می­تواند به تعدیل پتانسیل اسمزی سلول و جذب آب راحت تر از سلول­های مجاور کمک کند. ارقام مقاوم به تنش اسمزی نسبت به ارقام حساس پرولین بیشتری را در برگ­ها تولید می­کنند (36). 

لکه شماره 2 یکی از آنزیم‌های مهم در چرخه کالوین و فتوسنتز گیاه می‌باشد. توانایی تولید بیشتر این آنزیم توسط گیاه می‌تواند در حفظ و پایداری چرخه کالوین مؤثر واقع شود. گزارش‌های مختلفی در رابطه با نقش بازدارندگی 16 H2O2 "> و برخی از اکسیدان‌های دیگر روی فعالیت کاتالازی این آنزیم وجود دارد (46). پروتئین Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) یا لکه شماره 2 نقش مهمی تحت تنش اکسیداتیو ایفا می­کند.  تحت تنش اکسیداتیو، سلول به مقدار زیادی کوفاکتور NADPH نیاز پیدا می­کند. در این زمان پروتئین GAPDH با غیر فعال شدن باعث فعال شدن مسیر پنتوز فسفات می­گردد. مسیر پنتوز فسفات با تولید NADPH کوفاکتور لازم را برای سیستم­های آنتی اکسیدانی از‌جمله چرخه گلوتاتیون فراهم می­کند که نقش مهمی در مقابله با گونه­های فعال اکسیژن ایفا می­کند (4و34). لکه شماره 5 یکی از زیر واحدهای پایه در کمپلکس 16F0-F1">  میتوکندریایی می‌باشد. این کمپلکس سنتز/هیدرولیز ATP را انجام می­دهد (17و33). افزایش بیان این آنزیم را در واریته­های گندم نان آلوده به آلومینیوم گزارش دادند. لکه شماره 6 در گیاهان عالی به صورت سه ایزوفرم مجزا دیده می­شود. بررسی این آنزیم بیشتر در اندام­های فتوسنتز کننده و کمتر در بافت­های هتروتروفیک گیاهان انجام شده است (13). آنزیم GAPDH سیتوزولی (لکه شماره 6) به خوبی می­تواند یک تنظیم کننده کلیدی در گلیکولیز باشد (9و26). لکه شماره 11 یک پروتئین هترامر (Heterotetrameric) متشکل از دو زیر واحد بزرگ و دو زیر واحد کوچک در گیاهان عالی است و نقش مهمی در تنظیم سنتز نشاسته دارد (19).

در گیاه گوجه فرنگی پروتئین  UDP- glucose pyrophosphorylase دخیل در متابولسیم ساکارز و پلی ساکاریدها است که در شرایط تنش شوری در رقم مقاوم بیان کمتری داشته است اما در رقم حساس تحت تنش کلرید سدیم در ریشه افزایش بیان نشان داده است (28). تجزیه و تحلیل پروتئوم ریشه سویا تحت تنش خشکی نشان داده است که دو آنزیم کلیدی دخیل در متابولیسم کربوهیدرات، UDP- glucose pyrophosphorylase و2,3- bisphosphoglycerate  تحت تنش خشکی کاهش بیان داشتند (5). پروتئین Beta amylase (لکه شماره 23) قبل از جوانه زنی بذر بصورت غیر فعال قرار دارد. بعد از شروع مرحله جوانه زنی این آنزیم فعال شده و باعث هیدرولیز پیوند (1->4)-alpha-D-glucosidic  موجود در نشاسته شده و تولید بتا-مالتوز می­کند (22).

بازدارنده‌های پروتئازی (Protease inhibitors)(لکه­ شماره 7 و8) گروهی از پروتئین‌ها هستند که نه تنها در بیشتر فعالیت‌های بیوشیمیایی سلول شرکت می‌کنند بلکه در فرایند‌های دفاعی گیاه در برابر تنش‌های محیطی، به‌ویژه پاتوژن‌ها نیز نقش مهمی دارند. ازجمله مهمترین این بازدارنده‌ها می‌توان به بازدارنده‌های Serine protease inhibitor ، Alpha amylase trypsin inhibitor اشاره کرد (12). افزایش بیان بازدارنده تریپسین (Tripsin inhibitor) در برنج تحت تنش شوری (23) و در جو تحت تنش خشکی (41) گزارش شده است. پروتئین‌های LEA که در این آزمایش (لکه­ شماره­ 17 و 19) کاهش بیان داشتند، در دانه‌های در حال بلوغ، سنتز و ذخیره‌ می‌شوند. پروتئین‌های LEA تحت شرایط تنش در حفاظت از ساختار سلولی، محافظت از غشاها و پروتئین‌ها و بازگرداندن پروتئین‌های دناتوره شده به فرم طبیعی نقش دارند (11). آسکوربات پراکسیدازها (APX) جزء مهمترین و مؤثرترین آنزیم‌های درگیر در فرایند حذف پراکسید هیدروژن در کلروپلاست و سیتوسول سلول‌های گیاهی می‌باشد و به صورت ایزوآنزیم‌های مختلف یافت می‌شود. این ایزوآنزیم‌ها باعث می‌شوند آسکوربات به عنوان دهنده الکترون عمل کرده و با احیای 16H2O2"> ، دو مولکول آب به همراه مونو دهیدروآسکوربات (Monodehydroascorbate) تولید شود و بدین ترتیب 16H2O2">  از محیط حذف و اثر سمی آن خنثی شود (38). در این تحقیق هر دو ایزوفرم  APX (لکه شماره 24 و 25) کاهش بیان نشان دادند.

آلبومین‌ها و گلوبولین‌ها مهمترین پروتئین­های ذخیره­ای در بذر هستند و نقش عملکردی نیز در دانه دارند (37). بررسی‌های انجام شده در مورد گلوبولین‌های رویان نشان داده است که Triticin و پروتئین‌های شبیه به Avenin در زمان نمو دانه در آندوسپرم گندم تحت تنش شوری و خشکی  به عنوان پروتئین‌های ذخیره‌ای عمل می­کنند که می­توانند در افزایش کیفیت بذر مهم باشند (10). افزایش بیان پروتئین­های ذخیره­ای تحت تنش شوری می­تواند باعث افزایش ارزش غذایی دانه شود.

لکه شماره 10 جزئی از کمپلکس فتوسیستم II است و برای فعالیت کامل فتوسیستم II ضروری بوده و آن را تنظیم می‌کند (18). روبیسکو آنزیم کلیدی واکنش‌های تثبیت کربن در استرومای کلروپلاست است. آنزیم روبیسکو دارای دو عملکرد است و در دو مسیر متابولیکی متضاد یعنی تثبیت کربن (در چرخه کالوین) و در فرایند تنفس نوری شرکت می‌کند (43). روبیسکو به‌عنوان فراوان‌ترین پروتئین بر روی زمین شناخته شده است. این آنزیم که در کلروپلاست قرار دارد حداقل 15 درصد تا 50 درصد پروتئین کلروپلاست را تشکیل می­دهد. روبیسکو نقش مهمی را در سوخت و ساز گیاهان بر عهده دارد (2). حاج حیدری و همکاران (2005) در مطالعه پروتئوم برگ‌های چغندر در شرایط تنش خشکی به افزایش بیان این آنزیم و همبستگی آن با مکانیسمی که قدرت فتوسنتزی گیاه را افزایش می‌دهد، اشاره کرده‌اند.

آلانین آمینوترانسفراز یک آنزیم وابسته بهPyridoxal phosphate  است و در تمام قسمت­های گیاه یافت می­شود. این آنزیم نه تنها در برگ و ریشه بلکه در بافت­های دیگری مانند آندوسپرم (24) و گل (20) یافت می­شود. افزایش بیان این آنزیم در برخی از گونه­های گیاهی در شرایط تنش شوری و فلزات سنگین مشاهده شده است (40). سطوح بالای فعالیت این آنزیم تبدیل سریع آلانین انباشته شده به پیروات را در طول بازیابی رشد گیاه قادر می­سازد (29). آمینوترانسفرازها نقش­های مهم و متفاوتی در گیاهان دارند، ازجمله در سنتز و کاتابولیسم اسیدهای آمینه ، بیوسنتز ویتامین­ها، مسیرهای کربن و نیتروژن و پاسخ به تنش­های گیاهی دخالت دارند (27).

تنش شوری به طور غیرمستقیم باعث القاء تنش گرمایی می‌شود. به طوری که 16H2O2"> درون سلول، به عنوان مولکول پیام رسان برای بسته شدن روزنه‌ها عمل می­کند و منجر به کاهش تبخیر و تعرق گیاه می‌شود. این امر موجب افزایش دمای گیاه شده و گیاه را با تنش گرمایی مواجه می‌کند. به دنبال تنش گرمایی اعمال شده به گیاه، پروتئین‌های شوک حرارتی (HSP‌) در گیاه تجمع بیشتری پیدا می‌کنند. این پروتئین‌ها در سازگاری گیاهان به تنش گرمایی و تحمل آن نقش مهمی دارند و در تمامی اندام‌های گیاهان و جانوران، تحت شرایط گرما، سرما و خشکی تولید می‌شوند. پروتئین‌های شوک حرارتی (لکه شماره 1)، علاوه بر اینکه در زمان مواجه گیاه با تنش دمایی بالا بیان می­شوند، همچنین در پاسخ به دامنه وسیعی از تنش‌ها مانند تنش‌های آبی، شوری، اسمزی، سرما و اکسیداتیو نیز بیان می‌شوند. در هویج، تحت تنش سرما افزایش بیان HSPهای کوچک به افزایش تحمل گیاه ربط داده شده است (39). پروتئین Cyclophilin-like protein زیر مجموعه‌ای از پروتئین Hsp 90  می‌باشد. سوبسترای شناخته شده Hsp 90، شامل پروتئین‌های مسیر پیام رسانی مانند کینازها می‌باشد که نشان دهنده نقش این مولکول در پیام رسانی است. بیان Hsp 90 در آرابیدوپسیس در پاسخ به گرما، سرما، تنش شوری، فلزات سنگین و فیتوهورمون‌ها مشاهده شده است (42). لکه­های شماره 20 و 22 از این دسته بودند.

نتیجه ­گیری

تنش شوری در هر دو سطح اثر معنی داری روی صفات مورد مطالعه به‌جز وزن خشک ریشه گذاشت. در بین صفات مورد مطالعه وزن خشک بخش هوایی بیشتر از سایر صفات کاهش پیدا کرد. همچنین میزان تجمع پرولین برگ تحت هر دو سطح تنش شوری افزایش معنی داری داشت. مطالعه تغییرات الگوی پروتئوم بذر مشخص کرد که از بین 532 لکه تکرارپذیر، 29 لکه دارای تغییر بیان معنی دار بودند. از این تعداد 19 لکه کاهش بیان و بقیه افزایش بیان پیدا کردند. لکه­های دخیل در متابولیسم کربن و دفاع-سم زدایی بیشترین سهم را در بین لکه­های تغییر بیان یافته داشتند. همچنین ملاحظه شد که پروتئین­های ذخیره ای تحت تنش افزایش بیان پیدا می­کنند. این اثر تنش شوری می­تواند در افزایش کیفیت بذر تأثیر داشته باشد.  

1.آلیاری، ه.، شکاری، ف. و شکاری، ف. 1379. دانه‌های روغنی، زراعت و فیزیولوژی. انتشارات عمیدی. 182 صفحه
2.دادرس، ن.، بشارتی، ح. و کتابچی، س. 1391. اثرات تنش شوری ناشی از کلرید سدیم بر رشد و تثبیت بیولوژیک نیتروژن در سه رقم سویا. مجله پژوهش­های خاک (علوم خاک و آب)، جلد 26، شماره 2، صفحه 174-165.
3.عیوضلو، سمانه. 1392. تجزیه پروتئوم بذر کلزای رقم Hyola 308 تحت تنش شوری. پایان­نامه کارشناسی ارشد، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تبریز.
 
4- Agarwal AR., Zhao L., Sancheti H, et al. 2012. Short-term cigarette smoke exposure induces reversible changes in energy metabolism and cellular redox status independent of inflammatory responses in mouse lungs. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 303 (10):L889-L898.
5- Alam I., Sharmin SA., Kim K-H, et al. 2010. Proteome analysis of soybean roots subjected to short-term drought stress. Plant and soil. 333 (1-2):491-505.
6- Bandehagh A., Salekdeh GH., Toorchi M, et al. 2011. Comparative proteomic analysis of canola leaves under salinity stress. Proteomics. 11 (10):1965-1975.
7- Blum H., Beier H, Gross HJ. 1987. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. electrophoresis. 8 (2):93-99.
8- Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72 (1):248-254.
9- Chang WW., Huang L., Shen M, et al. 2000. Patterns of protein synthesis and tolerance of anoxia in root tips of maize seedlings acclimated to a low-oxygen environment, and identification of proteins by mass spectrometry. Plant Physiology. 122 (2):295-318.
10- Chen P., Wang C., Li K, et al. 2008. Cloning, expression and characterization of novel avenin-like genes in wheat and related species. Journal of cereal science. 48 (3):734-740.
11- Chinnusamy V., Zhu J, Zhu J-K, 2006. Salt stress signaling and mechanisms of plant salt tolerance, In:   Genetic engineering. Springer, pp. 141-177.
12- Christeller JT. 2005. Evolutionary mechanisms acting on proteinase inhibitor variability. FEBS Journal. 272 (22):5710-5722.
13- Fernie AR., Carrari F, Sweetlove LJ. 2004. Respiratory metabolism: glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport. Current opinion in plant biology. 7 (3):254-261.
14- Finnie C., Melchior S., Roepstorff P, Svensson B. 2002. Proteome analysis of grain filling and seed maturation in barley. Plant Physiology. 129 (3):1308-1319.
15- Gharelo Shokri R., Farajzadeh D., Bandehagh A, Tourchi M. 2016. Canola 2-dimensional proteom profile under osmotic stress and inoculation with Pseudomonas fluorescens FY32. Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology  17 (5&6):257-266.
16- Hajheidari M., Abdollahian‐Noghabi M., Askari H, et al. 2005. Proteome analysis of sugar beet leaves under drought stress. Proteomics. 5 (4):950-960.
17- Hamilton CA., Good AG, Taylor GJ. 2001. Induction of vacuolar ATPase and mitochondrial ATP synthase by aluminum in an aluminum-resistant cultivar of wheat. Plant Physiology. 125 (4):2068-2077.
18- Heckathorn SA., Downs CA., Sharkey TD, Coleman JS. 1998. The small, methionine-rich chloroplast heat-shock protein protects photosystem II electron transport during heat stress. Plant Physiology. 116 (1):439-444.
19- Hwang S-K., Salamone PR, Okita TW. 2005. Allosteric regulation of the higher plant ADP-glucose pyrophosphorylase is a product of synergy between the two subunits. FEBS letters. 579 (5):983-990.
20- Igarashi D., Miwa T., Seki M, et al. 2003. Identification of photorespiratory glutamate: glyoxylate aminotransferase (GGAT) gene in Arabidopsis. The Plant Journal. 33 (6):975-987.
21- Jensen ON. 2004. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Current opinion in chemical biology. 8 (1):33-41.
22- Jiang S-S., Liang X-N., Li X, et al. 2012. Wheat drought-responsive grain proteome analysis by linear and nonlinear 2-DE and MALDI-TOF mass spectrometry. International journal of molecular sciences. 13 (12):16065-16083.
23- Kawasaki S., Borchert C., Deyholos M, et al. 2001. Gene expression profiles during the initial phase of salt stress in rice. The Plant Cell. 13 (4):889-905.
24- Kikuchi H., Hirose S., Toki S, et al. 1999. Molecular characterization of a gene for alanine aminotransferase from rice (Oryza sativa). Plant molecular biology. 39 (1):149-159.
25- Kimber DS, McGregor D, 1995. Brassica oilseeds: production and utilization. CAB INTERNATIONAL.
26- Laukens K., Roef L., Witters E, et al. 2001. Cyclic AMP affinity purification and ESI–QTOF MS–MS identification of cytosolic glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and two nucleoside diphosphate kinase isoforms from tobacco BY-2 cells. FEBS letters. 508 (1):75-79.
27- Liepman AH, Olsen LJ. 2004. Genomic analysis of aminotransferases in Arabidopsis thaliana. Critical Reviews in Plant Sciences. 23 (1):73-89.
28- Manaa A., Ahmed HB., Valot B, et al. 2011. Salt and genotype impact on plant physiology and root proteome variations in tomato. Journal of experimental botany. erq460.
29- Miyashita Y., Dolferus R., Ismond KP, Good AG. 2007. Alanine aminotransferase catalyses the breakdown of alanine after hypoxia in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 49 (6):1108-1121.
30- Moussa H, Khodary S. 2003. Effect of salicylic acid on the growth, photosynthesis and carbohydrate metabolism in salt stressed maize plants. Isotope Radiat. Res. 35 179-187.
31- Munns R. 2002. Comparative physiology of salt and water stress. Plant, cell & environment. 25 (2):239-250.
32- Parida AK, Das AB. 2005. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review. Ecotoxicology and environmental safety. 60 (3):324-349.
33- Pedersen PL., Ko YH, Hong S. 2000. ATP synthases in the year 2000: evolving views about the structures of these remarkable enzyme complexes. Journal of bioenergetics and biomembranes. 32 (4):325-332.
34- Ralser M., Wamelink MM., Kowald A, et al. 2007. Dynamic rerouting of the carbohydrate flux is key to counteracting oxidative stress. Journal of biology. 6 (4):1.
35- Salekdeh GH, Komatsu S. 2007. Crop proteomics: aim at sustainable agriculture of tomorrow. Proteomics. 7 (16):2976-2996.
36- Saradhi PP. 1991. Proline accumulation under heavy metal stress. Journal of Plant Physiology. 138 (5):554-558.
37- Shewry PR, Halford NG. 2002. Cereal seed storage proteins: structures, properties and role in grain utilization. Journal of experimental botany. 53 (370):947-958.
38- Shigeoka S., Ishikawa T., Tamoi M, et al. 2002. Regulation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes. Journal of Experimental Botany. 53 (372):1305-1319.
39- Song N-H, Ahn Y-J. 2011. DcHsp17. 7, a small heat shock protein in carrot, is tissue-specifically expressed under salt stress and confers tolerance to salinity. New biotechnology. 28 (6):698-704.
40- Surabhi G-K., Reddy AM., Kumari GJ, Sudhakar C. 2008. Modulations in key enzymes of nitrogen metabolism in two high yielding genotypes of mulberry (Morus alba L.) with differential sensitivity to salt stress. Environmental and Experimental Botany. 64 (2):171-179.
41- Talamè V., Ozturk NZ., Bohnert HJ, Tuberosa R. 2007. Barley transcript profiles under dehydration shock and drought stress treatments: a comparative analysis. Journal of Experimental Botany. 58 (2):229-240.
42- Tang W., Kim T-W., Oses-Prieto JA, et al. 2008. BSKs mediate signal transduction from the receptor kinase BRI1 in Arabidopsis. Science. 321 (5888):557-560.
43- Vaidyanathan H., Sivakumar P., Chakrabarty R, Thomas G. 2003. Scavenging of reactive oxygen species in NaCl-stressed rice (Oryza sativa L.)—differential response in salt-tolerant and sensitive varieties. Plant Science. 165 (6):1411-1418.
44- Wang L., Ma H., Song L, et al. 2012. Comparative proteomics analysis reveals the mechanism of pre-harvest seed deterioration of soybean under high temperature and humidity stress. Journal of proteomics. 75 (7):2109-2127.
45- Yoshiba Y., Kiyosue T., Nakashima K, et al. 1997. Regulation of levels of proline as an osmolyte in plants under water stress. Plant and Cell Physiology. 38 (10):1095-1102.
46- Zaffagnini M., Michelet L., Marchand C, et al. 2007. The thioredoxin‐independent isoform of chloroplastic glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase is selectively regulated by glutathionylation. Febs Journal. 274 (1):212-226.
مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 31، شماره 2
شهریور 1397
صفحه 291-302
  • تاریخ دریافت: 30 بهمن 1394
  • تاریخ بازنگری: 22 دی 1395
  • تاریخ پذیرش: 01 خرداد 1396