نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 هیئت علمی دانشگاه پیام نور تهران شرق

2 دانشگاه پیام نور

3 دانشگاه شاهد

چکیده

جلبک های کلرلا به عنوان دارو ، غذای آبزیان و بیوفیلترمورد استفاده قرار می گیرند. ازاین دیدگاه، بالا بردن بیوماس و برخی متابولیت های آن حایز اهمیت اقتصادی است. هدف از انجام این پژوهش بررسی اثر تحریکی برخی هورمون های گیاهی بر بیوماس و محتوای متابولیت های مهم جلبک Chlorella sorokiniana بود. در این پژوهش جلبک در محیط کشت پایه Bold تغییر یافته کشت شد. به محیط‌کشت 5گرم درلیتر گلوکزمنو هیدرات و نسبت های مختلف هورمون‌های نفتالن استیک اسید (NAA)، بنزیل‌آمینو‌پورین (BAP)، ایندول استیک اسید (IAA) و ایندول بوتیریک اسید (IBA ) افزوده شد. وزن خشک ، محتوای رنگیزه ها و پروتئین کل در این تیمارها اندازه گیری شد. این صفات رشد، در75% محیط کشت های حاوی NAA+BAP افزایش یافت و این افزایش در تیمار با NAA (10میلی گرم در لیتر)BAP+ (1میلی گرم در لیتر) نسبت به شاهد معنی دار بود. در تیمار IAA (1میلی گرم در لیتر) +) BAP 2میلی گرم درلیتر) وزن خشک و مقدار کلروفیل a به طور معنی داری نسبت به شاهد افزایش یافت. وزن خشک و محتوای پروتئین و رنگیزه ها، در تیمار با غلظت های IBA + BAP یا اختلاف معنی داری را با شاهد نشان نمی داد یا کاهش می یافت. بیشترین وزن خشک، تعداد سلول، محتوای رنگیزه ها و پروتئین کل، نسبت به شاهد در تیمارهای NAA+ BAP مشاهده شد. نتایج این مطالعه نشان داد که هورمون های BAP ، NAAو IAA به ترتیب بیشترین اثر افزایشی را بر صفات رشد مورد بررسی داشتند و IBA اثر چندانی بر این صفات نداشت.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Study the effects of auxins and cytokinins on growth , pigments and protein contents of Chlorella sorokiniana

چکیده [English]

Chlorella are used as medicine, aquatic foods and biofilter. For this reason increases of its biomass and some of metabolites have economic value. The aim of this research was study of stimulating effect of some phytohormones on biomass and important metabolites contents of Chlorella sorokiniana. In this study C. sorokiniana was cultured at modified Bold Basal Medium. Glucose monohydrate (5gl-1) and different proportions of plant hormones naphthalene acetic acid (NAA), benzylaminopurin (BAP), indolebutyric acid (IBA) and indoleacetic acid (IAA) were added to medium. Dry weight, pigments and protein contents were measured. At 75% of NAA+BAP treatments, these growth parameters increased. At treatment with NAA (10mgl-1) +BAP (1mgl-1), these parameters significantly enhanced compared to control. At treatment with IAA (1mgl-1) +BAP (2mgL-1), dry weight and content of chlorophyll a, significantly increased compared to control. At treatment with IBA+BAP, dry weight and metabolites had not significant difference or reduced compared to control. The highest proportion of dry weight, cell numbers and pigments and proteins contents were observed at NAA+BAP treatment. Results showed BAP, NAA and IAA had the greatest additive effects on growth traits respectively, but IBA had little effect on these traits

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chlorella sorokiniana
  • Plant hormones
  • protein
  • photosynthetic pigments

بررسی اثر هورمونهای اکسین و سیتوکینین بر رشد و محتوای رنگیزه‌ها و پروتئین جلبک Chlorella sorokiniana 

آمنه جمشیدی1*، محمدعلی ابراهیمی2، طیبه رجبیان3، غلامرضابخشی خانیکی2 و شهلا مظفری4

1 تهران، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی

2 تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی

3 تهران، دانشگاه شاهد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

4 تهران، دانشگاه پیام نور، گروه شیمی

تاریخ دریافت: 4/11/94                تاریخ پذیرش: 16/3/96 

چکیده

جلبک‌های کلرلا به‌عنوان دارو، غذای آبزیان و بیوفیلتر مورد استفاده قرار می‌گیرند. از این دیدگاه، بالا بردن بیوماس و برخی متابولیت‌های آن حایز اهمیت اقتصادی است. هدف از انجام این پژوهش، بررسی اثر تحریکی برخی هورمونهای گیاهی بر بیوماس و محتوای متابولیت‌های مهم جلبک Chlorella sorokiniana بود. در این پژوهش جلبک در محیط کشت پایه Bold تغییر یافته کشت شد. به محیط­کشت 5 گرم در لیتر گلوکزمنو هیدرات و نسبت‌های مختلف هورمون­های نفتالن استیک اسید (NAA)، بنزیل­آمینو­پورین (BAP)، ایندول استیک اسید (IAA) و ایندول بوتیریک اسید (IBA ) افزوده شد. وزن خشک، محتوای رنگیزه­ها و پروتئین در این تیمارها اندازه‌گیری شد. این صفات رشد، در 75% محیط کشت‌های حاوی  NAA+BAP افزایش یافت و این افزایش در تیمار با NAA (10 میلی‌گرم در لیتر) BAP+ (1 میلی‌گرم در لیتر) نسبت به شاهد معنی دار بود. در تیمارIAA  (1 میلی‌گرم در لیتر) +) BAP 2 میلی‌گرم در لیتر) وزن خشک و مقدار کلروفیل a بطور معنی‌داری نسبت به شاهد افزایش یافت. وزن خشک و محتوای پروتئین و رنگیزه‌ها، در تیمار با غلظت‌های  BAP+IBA  یا اختلاف معنی‌داری را با شاهد نشان نمی‌داد یا کاهش می‌یافت. بیشترین وزن خشک، تعداد سلول، محتوای رنگیزه‌ها و پروتئین، نسبت به شاهد در تیمارهای NAA+ BAP مشاهده شد. نتایج این مطالعه نشان داد که هورمون­های BAP،  NAAو  IAAبه‌ترتیب بیشترین اثر افزایشی را بر صفات رشد مورد بررسی داشتند و  IBA اثر چندانی بر این صفات نداشت.

واژه‌های کلیدی: Chlorella sorokiniana، هورمون­های گیاهی، پروتئین، رنگیزه­های فتوسنتزی

* نویسنده مسئول، تلفن: 02188843035،  پست الکترونیکی:  ameneh.jamshidi@gmail.com

مقدمه  

 

جلبک های کلرلا، جلبک های مفیدی هستند که درصنایع غذایی، به عنوان غذای آبزیان و غذای دام و طیور و در صنایع دارویی و همچنین به عنوان بیوفیلتر موارد استفاده متعددی دارند (38). به دلیل کاربرد متعدد این جلبک ها کشت و افزایش بیوماس آنها ارزشمند است. یکی از راه های افزایش رشد، کاربرد هورمونهاست. تغییرغلظت هورمونهای موجود در جلبک ها می تواند سبب تغییر رشد آنها گردد (7،33). برخی فرایندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی در سلول های جلبکی مثل افزایش ابعاد و تعداد سلول، تغییر محتوای قندها، پروتئین، آنزیم ها ورنگیزه ها تحت کنترل چنین هورمون هایی هستند (38). البته مسیر عملکرد فیتوهورمون ها در جلبک ها هنوز ناشناخته است (37). محققان غلظت جیبرلین و براسینواستروئیدها را در تعدادی از جلبک­های خانواده کلروفیسه (Chlorophyceae) تعیین کردند (33) و محققانی نیز اثر نور و تاریکی را بر رشد و مقدار هورمون های جلبک Chlorella minutissima مورد بررسی قرار دادند. بیشترین مقدار هورمون های ایندولی در تاریکی در محیط کشت حاوی گلوکز گزارش شده بود. درحالی که کشت های جلبکی قرار گرفته درمحیط فاقد گلوکز، با فتوپریود،  16ساعت نور و 8 ساعت تاریکی حاوی مقادیر بیشتری سیتوکینین بودند (34). در تحقیقی، اثر اکسین های طبیعی IAA وIBA و اکسین های سنتزی NAA و فنیل استیک اسید PAA)) بر روی متابولیت ها، رشد و پاسخ آنتی اکسیدانی Chlorella vulgaris مورد بررسی قرار گرفت. IAA   و IBA در غلظتهای کمتری از  NAA و  PAA سبب حداکثر افزایش تعداد سلول ها در این جلبک شدند. در این غلظت ها، محتوای رنگیزه های فتوسنتزی وپروتئین های محلول نیز افزایش یافت (26). در برخی مطالعات از دو و یا چند هورمون برای افزایش رشد استفاده شده است. برای مثال در تحقیقی اثرات سازگار اکسین ها و براسینواستروئیدها برروی جلبک C. vulgaris بررسی شد. در این بررسی اکسین هایIBA  و IAA به تنهایی و یا همراه با براسینواستروئیدها مورد استفاده قرار گرفت. ترکیب اکسین و براسینواستروئید تکثیرسلول ها و انباشت متابولیت ها (کلروفیل کل، پروتئین کل و مونوساکاریدها) را تقریبا 3 تا 4 برابر بیشتر از استفاده از یک هورمون تنها، افزایش می داد (7). درتحقیقی  دیگر، اثر برهم­کنش براسینواستروئیدها وسیتوکینین­ها (ترانس زآتین، دی فنیل­ اوره وکینتین) بر روی رشد جلبک C. vulgaris مورد بررسی قرار گرفت. نتایج تحقیق نشان داد که سلول های جلبکی نسبت به سیتوکینین­ها با افزایش تعدادسلول­ها حساسیت نشان می دهند و سیتوکینین­ها با براسینواستروئیدها بطور سازگار عمل می­کنند و بیشترین اثر (تقسیم سلول­ها، انباشت پروتئین، کلروفیل و مونوساکاریدها) در ترکیب براسینولید با ترانس زآتین به دست آمد وکمترین اثر در ترکیب 28 همو کاستاسترول با 1،3 دی فنیل اوره بدست آمد. در اثر عملکرد سازگار دو نوع هورمون، تعداد سلول­ها و محتوای متابولیت­ها تقریبا به 5/2 تا 3 برابر زمانی رسید که یک هورمون به تنهایی مورد استفاده قرار گرفته بود (4). درپژوهشی دیگر اثر دو هورمون 4،2 دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D) و کینتین در غلظت­های مختلف بر جلبک Haematococcus pluvialis بررسی شد. نتایج نشان داد این جلبک در غلظت 1میلی گرم در لیتر 2,4-D و1میلی گرم در لیتر کینتین 297% نسبت به شاهد افزایش رشد (تعداد سلول) نشان داد (16). در پژوهش دیگری اثر تحریک کننده­های بیوشیمیایی بر بیوماس و محتوای متابولیت­ها در C. sorokiniana آزمایش شد. در این مطالعه از NAA همراه با هورمون­های دیگر استفاده شد. ترکیب هورمونیNAA همراه با اکسین های دیگر هیچ اثر سازگاری و یا ناسازگاری بر صفات مورد مطالعه نداشت، اما ترکیب آن با زآتین یا ژیبرلین سبب افزایش رشد گردید (14). استفاده از گلوکز در محیط کشت نیزسبب افزایش بیوماس C. vulgaris در کشت میکسوتروف (mixotroph) شد (20). با توجه به اهمیت­های متعدد کاربردی  C. sorokinianaدر این تحقیق اثرغلظت­های برخی هورمون­های اکسین (طبیعی و مصنوعی) و سیتوکینین بطور ترکیبی برروی رشد،محتوای رنگیزه­ها و پروتئین این جلبک در کشت میکسوتروف مورد بررسی قرار خواهد گرفت، تا بهترین ترکیب های هورمونی با بیشترین اثر تحریکی بر افزایش صفات مورد مطالعه برای اهداف کاربردی معرفی شوند.

مواد و روشها

مواد اولیه و شرایط رشد: جلبک C. sorokiniana (IBRC-M 5008) از مرکز ذخایر ژنتیکی و بیولوژیکی ایران خریداری شد. مواد مورد نیاز از شرکت مرک خریداری شد. جلبک ها در محیط کشت پایه
Bold (Bold Basal Medium:BBM) اصلاح شده (2) با کمی تغییر (با استفاده 075/0 گرم درلیتر KH2PO4) کشت شد. به منظور دسترسی به منبع کربن، به محیط های کشت 5گرم در لیتر گلوکزمنوهیدرات افزوده شد (19). هورمون­هایNAA ، BAP ،  IAA و IBA  پس از تهیه در غلظت­های مورد نظر به محیط­های کشت اضافه شد (26،16،9،7). pH  محیط کشت با سود 1نرمال به 8/6 رسانده شد. محیط کشت ها به فلاسک های 250میلی لیتری حاوی 100میلی لیتر محیط کشت منتقل شد و به مدت20دقیقه در دمای121 درجه سانتیگراد و فشار1 اتمسفر در دستگاه اتوکلاو سترون شد. برای کشت نمونه­های جلبکی، یک میلی لیتر سلول جلبکی در فاز لگاریتمی  به 100 میلی لیتر محیط کشت تلقیح شد. فلاسک­ها دراتاق کشت بر روی شیکر انکوباتور (GFL,3031,  Germany) با 125 دور در دقیقه در دمای 1±25 درجه سانتیگراد و شرایط نور (لامپ­های فلوئورسنت، 50 مول بر متر مربع بر ثانیه) و فتوپریود 12 ساعت نور 12 ساعت تاریکی قرارگرفت. فلاسک­ها به مدت 72 ساعت در این شرایط نگهداری شد  و بعد وزن خشک و تعداد سلول­ها و محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی وپروتئین جلبک پس از 72 ساعت کشت اندازه گیری شد. آزمایش‌ها با روش کاملا تصادفی انجام شد. تیمارها 4 بارتکرار شد. ترکیبات هورمونی و گلوکز طبق جدول 1 به محیط های کشت افزوده شد.

 

 

جدول1- محیط کشت ها  وغلظت ترکیبات هورمونی وگلوکز استفاده شده در یک لیترBBM

هورمون

محیط

NAA

(میلی گرم در لیتر)

IBA

(میلی گرم در لیتر)

IAA

(میلی گرم در لیتر)

BAP

(میلی گرم در لیتر)

گلوکزمنوهیدرات

(گرم در لیتر)

A

5

0

0

1

5

B

5

0

0

2

5

C

10

0

0

1

5

D

10

0

0

2

5

E

0

5

0

1

5

F

0

5

0

2

5

G

0

10

0

1

5

H

0

10

0

2

5

I

0

0

1

1

5

J

0

0

1

2

5

K

0

0

9

1

5

L

0

0

9

2

5

M (شاهد)

0

0

0

0

5

 


اندازه‌گیری صفات رشدی

1- تخمین وزن خشک: 40 میلی لیتر محیط کشت حاوی سلول جلبکی، 10 دقیقه در g ×4000 سانتریفیوژ
(Sigma, 2-16pk, Germany ) و روشناور دور ریخته شد و رسوب جلبکی با آب مقطر شستشو شد و بلافاصله در
g ×4000 سانتریفیوژ گردید. قرص جلبکی حاصل، 72 ساعت در دمای 40 درجه سانتیگراد قرار داده شد و بعد توزین گردید (3).

2- شمارش تعداد سلول: شمارش سلول های جلبک توسط لام نئوبار انجام گردید (7). هر شمارش 4 بار تکرار شد. 1 میلی لیتر از سوسپانسیون جلبک برداشت و رقیق شد، پس از هم زدن، 20 میکرولیتر از آن روی لام نئوبار قرارگرفت. تعداد سلول جلبک در میلی لیتر طبق معادله زیر تعیین شد (1).

میانگین عدد شمارش شده در مربع بزرگ (1/0 میلی‌متر مکعب) ×ضریب رقت×104= تعداد سلول  جلبک در میلی لیتر

اندازه‌گیری محتوای پروتئین: برای سنجش محتوای پروتئین جلبک خشک شده (30( با هاون پودر شد. به 5 میلی گرم از ماده خرد شده 1میلی لیتر سود (5/0 مولار) افزوده و به هم زده تا یکنواخت شد. نمونه 10 دقیقه در دمای 80 درجه سانتیگراد نگهداری و گاه‌گاهی به هم زده شد، سپس در دمای آزمایشگاه سرد شد. نمونه در  g× 2000 سانتریفیوژ شد و روشناور به لوله دیگری انتقال یافت و برای تعیین پروتئین مورد آزمایش قرار گرفت (19). بدین منظور، 1/ 0 میلی لیتراز محلول حاوی پروتئین به 5 میلی لیتر معرف برادفورد افزوده شد وپس از تکان دادن در 2دقیقه جذب در595 نانومتر با اسپکتروفتومتر (Shimadzu, UV mini 1240, Japan)  خوانده شد. منحنی استاندارد، با سرم آلبومین گاوی ترسیم شد (18). غلظت سرم آلبومین طبق معادله  x0096/0  = y محاسبه گردید (x= غلظت سرم آلبومین وy= میزان جذب ). سپس درصد پروتئین  بر حسب میلی گرم در 100میلی گرم وزن خشک محاسبه شد (14،19).

اندازه‌گیری محتوای رنگیزه‌های فتوسنتزی: یک میلی لیتر از سوسپانسیون جلبکی در g ×4000سانتریفیوژ شد. محلول رویی دور ریخته شد. به رسوب جلبکی متانول9/99% ( (v/vافزوده شد و در تاریکی نگهداری تا کاملا سفید شد (14)، سپس درg ×2000سانتریفیوژ شد وجذب محلول متانولی  با اسپکتروفتومتردر طول موج های2/665 ، 4/652 و470 نانومتر اندازه گیری شد. محتوای کلروفیل a،b  و کاروتنویید بر حسب میکرو گرم در میلی لیتر طبق فرمول های زیر  محاسبه گردید(40) و محتوای رنگیزه های فتوسنتزی براساس میکروگرم در یک میلی لیتر سوسپانسیون جلبک بیان شد(14).

(4/652 A 16/9) - (2/665 A72/16)= کلروفیل a

(2/665 A28/15)- (4/652 A 09/34)  =کلروفیل b

 - (470A1000)] = کاروتنوییدها

221 ÷ [ (96/104× کلروفیل b)- (63/1× کلروفیل a)

محاسبات آماری: آنالیز آماری با استفاده  از نرم افزار  SPSS(version13) با تجزیه واریانس یک طرفه (ANOVA) انجام شد. مقایسه میانگین ها با استفاده از آزمون دانکن و معنی داری در سطح 05/0 P≤  تعیین شد. شکل ها با  نرم افزار Excel رسم شد.  

نتایج

بررسی اثر ترکیبی غلظت‌های مختلف NAA+ BAP : وزن خشک، تعداد سلول، مقدار رنگیزه ها و پروتئین در 75% از محیط های حاوی  NAA+BAPنسبت به شاهد افزایش یافت. اما فقط در تیمار باNAA  (10میلی گرم در لیتر) BAP+(1میلی گرم در لیتر) این افزایش معنی دار بود، که مقادیر آن در تیمار وشاهد به‌ترتیب وزن خشک، 5/77 و95/64 میلی گرم، محتوای کلروفیلa ، 76/6و6/4 میکرو گرم در میلی لیتر ، کلروفیلb، 8/3و47/2 میکرو گرم در میلی لیتر و پروتئین، 27/15و68/12میلی گرم درصد میلی گرم وزن خشک می باشد (شکل1: A,C,D). البته تعدادسلول در تیمار وشاهد به‌ترتیب 107× 38/16 و 107× 98/ 10 در میلی لیتر می باشد اما افزایش تعداد سلول، در سطح 05/0 P≤  معنی دار نبود (شکل1: B). ولی در سطح  بالاتر، 15/0 P≤  اختلاف معنی داری مشاهده می شد.

بررسی اثر ترکیبی غلظت‌های مختلف IBA+ BAP : در تیمار  با  IBA(5 میلی گرم در لیتر)) BAP +1میلی گرم درلیتر) وزن خشک و محتوای متابولیت­ها مشابه شاهد بود، ولی در سایر تیمارهای IBA+ BAP وزن خشک، تعداد سلولها ومحتوای متابولیت­ها نسبت به شاهدکاهش یافت. محتوای کلروفیل b، در تیمار با IBA (5 میلی گرم در لیتر)) BAP +2میلی گرم درلیتر) ،7/1 میلی گرم درلیتر نسبت به شاهد47/2 میلی گرم در لیتر کاهش معنی داری نشان می داد. در تیمار با IBA (10میلی گرم در لیتر) + BAP (1-2میلی گرم درلیتر) بیشتر صفات رشد بطور معنی داری نسبت به شاهد کاهش یافت، در این تیمارها وشاهد به‌ترتیب وزن خشک، 9/55، 6/54 و 95/64 میلی گرم، محتوای کلروفیلa، 86/3، 95/3 و62/4 میکروگرم در میلی لیتر، کلروفیلb، 6/1، 2و 47/2 میکروگرم در میلی لیتر و درصد پروتئین 1/11 ،9/10و68/12 میلی گرم در 100 میلی گرم وزن خشک بود که در این تیمارها، مقادیر این صفات کاهش معنی داری را نسبت به شاهد نشان می داد (شکل2: A,C,D).

 

 

 

 

شکل 1- بررسی اثر غلظت های مختلف NAA + BAP بر برخی صفات رشدی در جلبک C. sorokiniana کشت شده درمحیط کشت
BBM. (A) وزن خشک،  (B)تعداد سلول × 107در یک میلی لیتر، (C) محتوای رنگیزه ها (کلروفیل a، کلروفیل  bو کاروتنوئید) میکروگرم در  یک میلی لیتر سوسپانسیون جلبک و(D)  درصد پروتئین(میلی گرم در 100میلی گرم وزن خشک). میانگین­هایی که برای هر صفت دارای حروف مشابه می­باشند براساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P≤  اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند.

 

 

از نظر تعداد سلول ها ووجود توده های سلولی نیز تیمار  با  IBA(5 میلی گرم در لیتر)+) BAP 1میلی گرم درلیتر)، 107×9/ 10در میلی لیتر مشابه شاهد (107×98/10 در میلی لیتر) بود(شکل2: A) ولی در بقیه تیمارهاکاهش غیر معنی داری را در سطح 05/0 P≤ نشان می داد.

بررسی اثر ترکیبی غلظت‌های مختلف IAA+ BAP : در 75% از تیمارهای  IAA+BAPوزن خشک، تعداد سلول و محتویات رنگیزه ها  نسبت به شاهد افزایش یافت. اما فقط در تیمار با IAA (1میلی گرم در لیتر) + BAP (1 میلی گرم در لیتر) وزن خشک( 58/69 میلی گرم ) نسبت به شاهد (9/64 میلی گرم ) معنی دار است ودر تیمار با IAA   (1میلی گرم در لیتر) + BAP (2 میلی گرم درلیتر) وزن خشک(74/68 میلی گرم ) نسبت به شاهد (9/64 میلی گرم) و محتوای کلروفیل a (2/5 میکروگرم در میلی لیتر) نسبت به شاهد (62/4 میکروگرم در میلی لیتر)  بطور معنی داری  افزایش یافت (شکل3: A,C). ازنظردرصدپروتئین، اختلاف معنی داری بین تیمارها وشاهد مشاهده نمی شد (شکل3: D). 

 

 

 

 

شکل 2-  بررسی اثر   غلظت های  مختلف IBA + BAP  بر برخی  صفات رشدی  در جلبک  C. sorokiniana  کشت شده درمحیط کشت  BBM. (A) وزن خشک،  (B)تعداد سلول × 107در یک میلی لیتر، (C)محتوای رنگیزه ها (کلروفیل a، کلروفیل  bو کاروتنوئید) میکروگرم در  یک میلی لیتر سوسپانسیون جلبک و(D)  درصد پروتئین (میلی گرم در 100میلی گرم وزن خشک).  میانگین­هایی که  برای  هر صفت  دارای حروف مشابه می­باشند براساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P≤  اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند.

 

شکل 3 - بررسی اثر   غلظت های مختلف IAA + BAP  بر برخی  صفات رشدی  در جلبک  C. sorokiniana  کشت شده درمحیط کشت
BBM. (A) وزن خشک،  (B)تعداد سلول × 107در یک میلی لیتر، (C) محتوای رنگیزه ها (کلروفیل a، کلروفیل  bو کاروتنوئید) میکروگرم در  یک میلی لیتر سوسپانسیون جلبک و(D)  درصد پروتئین (میلی گرم در 100میلی گرم وزن خشک). میانگین­هایی  که برای  هر صفت  دارای حروف مشابه می­باشند براساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P≤  اختلاف معنی­داری با یکدیگر ندارند. 

 


بحث

غلظت های متفاوتی برای غلظت بهینه فیتوهورمون ها برای رشد (تعداد سلول) جلبک  کلرلا گزارش شده است. غلظت ppm 50 (285 میکرومولIAA ، 246 میکرومول  IBA) (9)،  50 میکرومول (7) و 1/0 میکرومول IAA و IBA (26) و غلظت 100،10 ، 1و01/0 میکرومول BAP (38)  و غلظت ppm 50 (5/268میکرومول) (9) و 1 میکرومول NAA (26)  که نشان می دهد شرایط متفاوت آزمایشگاه ها از نظر نوع محیط کشت و مواد ضمیمه به آن، هوادهی، منبع کربن(20)،  میزان نور(34)، مدت زمان کشت(14)، فتوپریود(34)، میزان رادیکال آزاد اکسیژن در سلول(26)، نوع جلبک، تفاوت محتوای پروتئین های گیرنده اکسین در سلول ها وگونه های مختلف جلبک (14) و بیشتر از همه میزان هورمون های درونی جلبک،  باعث تغییر در نتایج تأثیر هورمون ها شده است. در مواردی، اکسین ها با اثر بر دیواره سلولی، فعال سازی پمپATPase  و طویل شدن سلول بر جلبک ها تأثیر می‍گذارند (34). شواهد بسیاری هم نشان می دهندکه اکسین های طبیعی ومصنوعی تقسیم سلولی را در گیاهان عالی وجلبک ها تحریک می کنند (4، 32). استفاده ازIAA  سبب تقسیم سلولی وتشکیل کلنی های چهار سلولی به جای سه سلولی در Scenedesmus obliquus  و
 Scenedesmus armatus شد (24).  Kawano (2003) پیشنهاد کرد که اکسین ممکن است رشد سلول را از طریق مهار رادیکال آزاد اکسیژن انجام دهد. در طی سست شدن دیواره سلولی توسط اکسین، ممکن است رادیکال آزاد اکسیژن ماده اصلی مکانیزم بیوشیمیایی باشد (17). گزارش‌ها نشان داده که پاسخ سلول های جلبک به اکسین های خارجی توسط تغییرات سطح اکسیداتیو دنبال می شود.  اکسین خارجی سبب افزایش سطح فعالیت آنزیم های مهار کننده رادیکال آزاد اکسیژن می شود و اثر اکسین توسط این آنزیم ها میانجی‌گری می شود (26). اکسین های طبیعی(IAA) ومصنوعی(2,4,D) می توانند فعالیت آنزیم هایی مثل کاتالاز وپراکسیداز راتحریک کنند که منجر به نوپدیدی جوانه در کشت بافت گندم می شود(36). برای رسیدن به حد بهینه تقسیم سلولی وتولید متابولیت در جلبک، کنترل دقیق مقادیرH2O2 ضروریست. مکانیزم اثر اکسین در سلول های جلبک به استرس اکسیداتیو وابسته است که استرس اکسیداتیو نیز تحت کنترل ماشین آنتی اکسیدانی سلولی است.  اکسین های طبیعی ومصنوعی تجمع  رادیکال آزاد اکسیژن را ظرف48 ساعت کاهش می دهند. کاهش رادیکال آزاد اکسیژن  سبب پیشرفت چرخه سلولی وتمایز دیواره ثانویه سلول می شود. به این شکل اکسین اکسیداسیون واحیا سلولی را تنظیم  می کند  (26) و ازتجزیه اکسیداتیو رنگیزه های فتوسنتزی وپروتئین ها جلوگیری می کند(26،9). اکسین ها اثرات تحریک کننده روی اتصال  CO2 با ریبولوزبیس فسفات و فسفریلاسیون فتوسنتزی دارند (27)، بنابراین، با افزایش فتوسنتز سبب افزایش رشد می شوند. اثر سیتوکینین تحریک تقسیم سلول، موجب فعال سازی رشد و تولید پروتئین و تشدید برخی فرایندهای فتوسنتزی جلبک می‌شود (18،4). در این پژوهش نیز در مواردی که در اثرکاربرد غلظت های ترکیبی مناسب اکسین وسیتوکینین، رشد افزایش یافته، علت افزایش رشد، افزایش تقسیم سلولی وافزایش تعداد سلول ها و تشکیل بیشتر توده های سلولی بود، افزایش معنی دار محتوای رنگیزه ها وپروتئین نیز در این تیمارها هم به دلیل افزایش تعداد سلول و هم جلوگیری از تخریب کلروفیل و پروتئین، در اثر مسیرهای عملکرد این هورمون ها بود (26،9). این افزایش، در ترکیب NAAو IAA با BAP مشاهده گردید. در تیماربا NAA  (10میلی گرم در لیتر) BAP+ (1میلی گرم در لیتر) بیوماس وسایرصفات رشد، به شکل معنی داری نسبت به شاهد افزایش یافت، که این نتیجه مطابق گزارش  محققان (9) است که حداکثر رشد (وزن خشک) جلبک Chlorella pyrenoidosa را در غلظت50 میکرومول (3/9 میلی گرم در لیتر) به دست آوردند و مشابه گزارش هایی (14،15) در مورد جلبک
 C. sorokiniana می باشد که از ترکیب NAA  (5 میلی گرم در لیتر)+ زاتین (1میلی گرم در لیتر) وNAA  (5 میلی گرم در لیتر)+ اتانول (5/0میلی لیتر در لیتر) استفاده گردید، که این تیمارها، به ‌ترتیب سبب 136% و 120% افزایش رشد (بیوماس) جلبک شد. در تیمار های IAA (1میلی گرم در لیتر معادل 7/5 میکرومول) + BAP  (1میلی گرم در لیتر معادل 4/4 میکرومول) وزن خشک و در تیمار با IAA (1میلی گرم در لیتر) + BAP  (2میلی گرم درلیتر) وزن خشک و محتوای کلروفیل a نیز بطور معنی داری  نسبت به شاهد افزایش یافت که نتیجه کنونی، نزدیک به گزارش محققان است که حداکثر رشد (تعداد سلول) جلبک
C. vulgaris را در غلظت 1/0 میکرو مول IAA به ‌دست آوردند (26). در تیمار با IAA (9میلی گرم در لیتر معادل 3/51 میکرومول) +  BAP (1میلی گرم در لیتر) نیز افزایش وزن خشک و محتوای رنگیزه ها و پروتئین مشاهده شد ولی افزایش معنی دار نبود که با گزارش محققان  (7) که حداکثر رشد (تعدادسلول) C. vulgaris  را در 50 میکرومول IAA به تنهایی وهمراه با براسینواستروئید به دست آورده بودند نزدیک است، ولی مطابقت ندارد. علت این اختلاف احتمالا بدین سبب است که در پژوهش کنونی وجود گلوکز درمحیط کشت سبب افزایش درون زای اکسین شده(34)،  درنتیجه حداکثر رشد، با افزودن اکسین کمتر (7/5 میکرومول) نسبت به گزارش محققان (50 میکرومول) به دست آمد. در این پژوهش، علی رغم افزایش معنی دار وزن خشک در سطح 05/0 P≤ ، افزایش تعداد سلول اختلاف معنی داری را نشان نمی داد [شکل های 1و3 ( A و B)]. این نتایج مشابه گزارشی است که تیمار جلبک C.sorokiniana با هورمون ها انجام داد و در تیمار با کینتین، علی رغم معنی داربودن افزایش بیوماس، تعداد سلول ها اختلاف معنی داری را با شاهد نشان نداد (24). در مواردی با کاربرد اکسین وسیتوکینین تغییر معنی داری در رشد مشاهده نمی شود که احتمالا به این علت است که اکسین برای حفظ ثبات غلظت اکسین درونی تخریب یا غیرفعال (اتصال اکسین)شده (5،10)، یا از جلبک به خارج دفع شده است. ژنهای مسئول بیوسنتز ومتابولیسم اکسین در گروهی ازگونه های کلروفیسه شناسایی شده اند(10). طبق گزارش هایی سلول های
C. pyrenoidosa ، IAA را ازمحیط جذب می کنند وبه شکل غیر فعال در می آورند(11). C. pyrenoidosa  اکسین را سنتز می کند وبه محیط کشت رها می سازد (24) وC.vulgaris  احتمالاسطوح اکسین آزاد خودرا ازطریق بیوسنتز مولکول های جدیداکسین و تجزیه موادی مانند IAA PAA, IBA و NAA موجود متعادل  نگه می دارد(26). این عدم تغییر معنی دار در ترکیب IBAبا BAP مشاهده گردید. دراین پژوهش تیمار IBA  (5 میلی گرم در لیتر معادل 63/24 میکرومول) + BAP (1میلی گرم درلیتر) افزایش غیر معنی داری با شاهد نشان می داد، که مشابه گزارش محققان است که تیمار IBA  (10میلی گرم در لیتر) در طی 5 روز سبب اندکی افزایش رشد (بیوماس) شد (14). در این پژوهش، در مواردی که رشد جلبک کاهش یافته، به علت کاربرد غلظت مفرط دو هورمون اکسین وسیتوکینین بوده است.  هورمون اکسین محرک تقسیم و رشد سلولی است ولی در غلظت های بالاتر اثر بازدارنده بر رشد دارد (31). IAA درغلظت های بالا بطور معنی داری تقسیم سلولی در C.vulgaris  را کاهش می دهد (39). آزمایشهای با  Chlorella fusca نشان داد که رشد جلبک در غلظت های بالاتراز 60 میکرومول  IAAممانعت می شود (23).   IBAدر غلظت بالا مانع از رشد می شود (8). در تیمار با IBA (100میکرومول) رشد (تعدادسلول) جلبک  C.vulgarisکاهش می یابد (26) . محققان گزارش کردند که اکسین های طبیعی و مصنوعی ایجاد فیتوهورمون اتیلن را القا می کنند که آن نیز سبب تولید اسید آبسیزیک می شود(12). اکسین ها در غلظت های بالا فعالیت 1-امینوسیکلوپروپان1-کربوکسیلیک اسیدسینتاز را افزایش می دهندکه آنزیم کلیدی بیوسنتز اتیلن است. تولید مقادیر قابل توجه اتیلن ممکن است سبب تخریب رنگیزه های فتوسنتزی شود(35). از طرفی محیط کنونی حاوی سیتوکینین است. سیتوکینین ها در غلظت های 01/0 تا 50 میکرومول  بطور فزاینده ای بیوسنتز اتیلن راپیش می برند(13) در این پژوهش، کاهش معنی دار رشد(وزن خشک)، محتوای کلروفیل هایa ، b و پروتئین در تیمارهای IBA  (10میلی گرم در لیتر معادل 26/49 میکرومول) + BAP (1-2میلی گرم در لیتر معادل 4/4-8/8 میکرومول) مشاهده شد. محققان نیز گزارش کردند که  IBA(15میلی گرم در لیتر) سبب کاهش غیر معنی دار کلروفیل در جلبک  C.sorokiniana گردید(25). محققان دیگری حداکثر رشد جلبک  C.vulgarisرا در غلظت 1/0میکرومول IBA به دست آوردند (26). علت دیگر کاهش رشد، احتمالا به این دلیل است که درpH اسیدی IBA به شکل غیر یونیزه در می آید ومی تواند به سلول وارد شود و سلول سعی می کند pH داخلی خود را با خنثی سازی یا خروج پروتون حفظ کند، چون انرژی به جای رشد، صرف این کار می شود و رشد کاهش می یابد (28). به علاوه اثر IBA از دو هورمون IAA وNAA کمتر بود. احتمالا علت این است که فعالیت اکسین ها توسط موقعیت گروه کربوکسیل و زنجیره آلیفاتیک تحت تأثیر قرار می گیرد. این زنجیره بار منفی قوی ومرکز حلقه آروماتیک بار مثبت قوی دارد (21). بلند بودن زنجیره آلیفاتیک متصل به حلقه ایندولی سبب کاهش فعالیت متابولیسمی می شود. بنابراین IAA از IBA فعالتر است. چونIBA  در زنجیره آلیفاتیک متصل به حلقه ایندول دوکربن بیشتر دارد (7). به همین دلیل، NAA هم از IBA قوی تر است. به علاوهIBA  وزن مولکولی (24/203 گرم) بیشتری از IAA (18/175گرم) وNAA (21/186 گرم) دارد، که سبب می شود که دیرتر از عرض غشا عبور کند و وارد سلول شود (28)، در نتیجه اثر کمتری داشته باشد. در این پژوهش در تمام تیمارهایی که رشد جلبک سریعتر شده بود پروتئین هم افزایش یافته بود که مشابه گزارش های محققان است (30،29). فقط در مواردی که پروتئین به خارج دفع شده بود (تیمارهایIAA   +  BAP) برخلاف افزایش معنی دار رشد، پروتئین افزایش معنی داری  نسبت به شاهد نشان نمی داد. این امر احتمالا،  به علت سست شدن دیواره توسط اکسین است، که باعث نشت پروتئین به محیط کشت شده است. محققان نیز گزارش کرده اند، IAA سبب افزایش معنی دار کلروفیل  و رشد جلبک Chlorella sp. شد، اما مانع از تجمع پروتئین های محلول درسلول های جلبک گردید (22) و بر خلاف افزایش وزن خشک جلبک  C.sorokiniana تیمار شده با IAA (10-15 میلی گرم در لیتر) محتوای پروتئین اختلاف معنی داری با شاهد نداشت (25) که مشابه نتایج پژوهش کنونی است. 

نتیجه‌گیری کلی

در این پژوهش، وزن خشک ، تعداد سلول، محتوای کلروفیلa ،کلروفیل b، کاروتنوئید و پروتئین جلبک در غلظت بهینه NAA+ BAP ، NAA (10میلی گرم در لیتر) BAP+(1میلی گرم در  لیتر) به ‌ترتیب 19/1، 5/1، 47/1،1/1،1/1و2/1 برابر شاهد بود و در غلظت بهینه IAA+BAP ، IAA (1میلی گرم در لیتر) + BAP (2 میلی گرم درلیتر) به‌ترتیب07/1،34/1، 13/1، 15/1، 08/1 و1/1 برابر شاهد بود، که نشان دهنده اثر افزایشی مثبت این ترکیبات هورمونی بر روی جلبک Chlorella sorokiniana است و نشان می دهد که در غلظت های مورد آزمایش، ترکیبات NAA+ BAP  سبب افزایش رشد بیشتری از ترکیبات IAA+BAP می شوند وترکیبات IBA+ BAP نیز در این غلظت ها اثر مثبت معنی داری بر رشد ندارد وبرای استفاده ازاین ترکیبات نیز باید غلظت های دیگری مورد آزمایش قرار گیرد.

1-رنجبر اقدم م.،حجازی م.، آیین فر س.،حسین زاده ن.، بررسی تاثیر چهار آنتی بیوتیک در رشد وکارایی آن ها در عاری سازی آلودگی محیط کشت جلبک تک سلولی Dunaliella sp.  اولین کنفرانس ملی جلبک شناسی ایران، سال نهم ، بهار 91 

 

2-Andersen, R. A. (2005) Algal Culturing Techniques, Elsevier Inc,pp.589.

3-Agrawal S.S. and Paridhavi M. (2007) Herbal DrugTechnology.Hydrabad,Universiti    es Press.

4- Bajguz, A.( 2000) Effect of Brassinosteroids on Nucleic Acids and Protein Content in Cultured of Chlorella vulgaris, Plant Physiology and Biochemistry, 38: 209–215.

5-Bajguz A, Piotrowska A. (2009) Conjugates of auxin and cytokinin. Phytochemistry, 70:957-969.

6-Bajguz A.( 2014) Interactive effect of brassinosteroids and cytokinins on growth, chlorophyll, mono- saccharide, and protein content in the green alga Chlorella vulgaris (Trebouxiophyceae). Plant Physiology and  Biochemistry, 80:176-83.

7-Bajguz A. and Piotrowska-Niczyporuk A.(2013)  Synergistic effect of auxins and brassinosteroi ds on the growth and regulation  of  metabolite  content in  the green  alga  Chlorella  vulgaris (Trebouxiophyceae). Plant Physiology and Biochemistry, 71:290-297.

8-Bertoni  G. (2011) Indolebutyric acid–derived auxin and plant development. The Plant Cell, 23: 845.

9-Czerpak, R.,  Bajguz, A., Białecka, Ba., Wierzchołowska, L. E.,  Wolańska , M. M. (1994) Effect of auxin precursors and chemical analogues on the growth and chemical composition in , Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 63(3-4):279-286.

10-De Smet I., VoB U., Lau S., Wilson M., Shao N., Timme R.E., Swarup R., Kerr I., Hodgman C., Bock R., Bennett M., Ju ¨rgens G., Tom Beeckman T. (2011) Unraveling the evolution of auxin signaling. Plant Physiology, 155:209.

11-Dibb-Fuller J.E., Morris D.A. (1992) Studies on the evolution of auxin carriers and phytotro- pin receptors: transmembrane auxin transport in unicellular and multicellularChlorophyta. Pl- anta, 186:219–226.

12-Grossmann K. (2000) Mode of action of auxin  herbicides: a new ending to a  long, drawn out story. Trends in Plant Science, 5:506–508.

13-Hansen M., Chae H. S.  and Kieber J. J. (2009)  Regulation of ACS protein stability by cytokinin and brassinosteroid. The Plant Journal, 57, 606–614.

14-Hunt R. W. , Chinnasamy S. , Bhatnagar A. and  Das K. C.  (2010)  Effect of biochemical stimulants on biomass productivity and metabolite content of the microalga, Chlorella sorokiniana . Applied Biochemistry and Biotechnology. 162(8): 2400-2414.

15-Hunt R.W. , Chinnasamy S. and  Das K. C.(2011)The Effect of Naphthalene-Acetic Acid on biomass productivity and chlorophyll content of green algae, Coccolithophore, Diatom, and Cyanobacterium cultures, Applied Biochemistry and  Biotechnology , 164:1350–1365.

16-Jesus Ropososo M.,F.,Morais R.M.S.C.(2013) Influence of the growth regulators Kinetine and 2,4,D on the growth of two chlorophyte, microalgae, Haematococcus pluviallis and Dunaliella salina, Journal of Basic&Applied Scinces,9: 302-308.

17-Kawano T. (2003) Roles of reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction. Plant Cell Reports, 9:829–837.

18-Kiseleva A.A., Tarachovskaya E.R., and Shishova M.F. (2012) Biosynthesis of Phytohormones in algae, Russian Journal of Plant Physiology, 59(5): 595-610.

19-Kobayashi  N., Noel  E., Barnes  A., Watson A., Rosenberg  J., Erickson G.  and Oyler G.(2013) Characterization on three Chlorella sorokiniana strains in anaerobic  digested  effluent from cattle manure. Bioresource Technology, 150: 377–386.

20-Kong W.B., Yang H., Cao Y.T., Song H., Hua S.F. and  Xia C.G.(2013) Effect of Glycerol  and   Glucose on the Enhancement of biomass, lipid and soluble carbohydrate production by Chlorella vulgaris in mixotrophic culture. Food Technology and  Biotechnology, 51 (1): 62-69.

21-Lau S., Shao N., Bock R., Ju ¨rgens G., De Smet I. (2009) Auxin signaling in algal lineages: fact or myth?. Trends Plant Science, 14:182–188.

22-Li, T., Wang, C., & Miao, J. (2007) Identification and quantification of indole-3-acetic acid in the kelp Laminaria japonica Areschoug and its effect on growth of marine microalgae. Journal of Applied Phycology, 1, 479–484.

 23-Lien T., Pettersen R., Knutsen G. (1971) Effects of indole-3-acetic acid and gibberelin on synchronous cultures of Chlorella fusca. Physiologia Plantarum, 24:185–190.

24-Mazur H., Knop A., Synak R. (2001) Indole-3-acetic amid in the culture medium of two axenic green microalgae. Journal of Applied Phycology, 13:35–42.

25-Ozioko,F.U.,Chiejina,N.V., Ogbonna,J.C.(2015) Effect of some phytohormones on growth characteristics of Chlorella sorokiniana IAM-C212 under photoautotrophic conditions, African Journal of Biotechnology,  14(30): 2367-237.

26- Piotrowska-Niczyporuk A., Bajguz A.(2014) The effect of natural and synthetic  auxins  on the  growth, metabolite content and antioxidant response of  green alga  Chlorella vulgaris (Trebouxiophycea), Plant Growth Regulation , 73:57–66.

 27-Piotrowska, A., Czerpak, R., Pietryczuk, A., Olesiewicz, A., & Wedolowska, M. (2008) The effect of indomethacin on the growth and metabolism of green alga Chlorella vulgaris Beijerinck. Plant Growth Regulation, 55, 125–136.

28-Rayle D.L., Cleland R.E. (1992) The acid growth theory of auxin-induced cell elongation is alive and well. Plant Physiology, 17: 439-58.

29-Sayegh F.A.Q., Montagenes D.J.S.( 2011) Temperature shifts in use intraspecific  variation in microalgae production and biochemical composition. Bioresource Technology, 102:3007-3013.

30-Sharma R., Singh G.P., Sharma V.K. ( 2012) Effects of culture conditions on growth and biochemical profile of Chlorella vulgaris.  Journal of Plant Pathology and Microbiology, 3 (5) 1000131.

31-Srivasatava, L. M.( 2002) Plant Growth and Development: hormones and environment. San Diego (CA), USA, Academic Press, pp.772.

32- Stirk W.A., Van Staden J. (1997) Comparison of cytokinin- and auxinlike activity in some commercially used seaweed extracts. Journal of Applied  Phycology, 8:503–508.

33-Stirk W.A., Bálint P., Tarkowská D., Novák O., Strnad M., Ördög V., van Staden J.(2013) Hormone profiles in microalgae: gibberellins and brasinosteroids. Plant Physiology  and Biochemistry, 70:348-53.

34-Stirk W. A., Bálint P.,Tarkowská D., Novák O., Maróti G., Ljung K., Turečková V.,StrandM.,Ordög V. and  Staden J. ( 2014) Effect of light on growth and endogenous hormones in Chlorella minutissima (Trebouxiophyceae).Plant Physiology and Biochemistry;79: 66-76.

 35-Sunohara Y., Matsumoto H. (1997) Comparative physiological effects of quinclorac and auxins, and light involvement in quinclorac-induced chlorosis in corn leaves. Pesticide Biochemistry and Physiology, 58, 125–132.

36-Szechyn ´ska-Hebda M., Skrzypek E., Da˛browska G., Biesaga-Kos ´cielniak J., Filek M., Wedzony M. (2007) The role of oxidative stress induced by growth regulators in the regeneration process of wheat. Acta Physiologia Plantarum, 29:327–337.

37- Tarakhovskaya E.R.,. Maslov Y.I, and  Shishova M.( 2007) Phytohormones in algae,  Russian Journal of Plant Physiology, 54(2):163-170·

38-Tate  J.J, Gutierrez-Wing M. T., Rusch K. A., Ben M. G. (2013)   The Effects of Plant Growth Substances and Mixed Cultures on Growth and Metabolite Production of Green Algae Chlorella sp .:  A Review, Journal of Plant Growth Regulation,  32:417–428.

 39-Vance B.D. (1987) Phytohormone effects on cell division in Chlorella pyrenoidosa Chick (TX-7-11-05) (Chlorellaceae). Journal of Plant Growth Regulation, 5:169–173.

40-Wellburn A.R. (1994) The spectral determination chlorophylls a and b, as well as total carotenoids, using various solvents with spectrophotometers of different resolution. Journal of Plant Physiology, 144: 307-313.