نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

تربیت مدرس

چکیده

یونجه با نام علمیMedicago sativa L. ازخانواده باقلائیان، گیاهی است پایا و علوفه‌ای است این گونه دارای ترکیبات متعددد فلاونوئیدی است یکی از مهم‌ترین این ترکیبات در گیاه یونجه، ایزوفلاونوئید مدیکارپین است که این ایزوفلاونوئید باعث فعال شدن ژنهای ریزوبیومی دخیل در فرآیند تشکیل گرهگ می‌شود. در این پژوهش میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) در مراحل مختلف تکوین گیاه در سه تکرار شامل مراحل جوانه‌زنی، رویشی و زایشی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر و غلظت مدیکارپین توسط کرومانوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) اندازه‌گیری شد. هم چنین ساختار تشریحی – تکوین اندام‌های رویشی یونجه در مراحل مختلف نمو توسط میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم PAL در طی رشد رویشی و زایشی متغییر بوده و هم‌چنین میزان غلظت مدیکارپین نیز در مراحل مختلف تکوین تفاوت داشت. نتایج این مطالعه به خوبی نشان داد که فعالیت آنزیم PAL با میزان غلظت مدیکارپین رابطه مستقیم دارد. به طوری که بیشترین میزان غلظت مدیکارپین و فعالیت آنزیم PALدر مرحله رویشی در ریشه مشاهده شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Anatomical structure of Medicago sativa L. and assessment of medicarpin in different stages of development

چکیده [English]

Medicago sativa L is from Fabaceae family that has several flavonoid compound in roots and shoots. Medicarpin is a dominant isoflvonoid that induces in nodul of root in different stage of developmentl. In this study, PAL (phenyl alanine amonialyase) activity was assayed using spectrophotometer. In this rse arc the concentration of medicarpin evaluete by HPLC (high performance liquid chromatography) were studied in different stages of development. The anatomical structure of leaves, stem, root and nodules were studied in transversal section by optical microscope. Different tissue such as epiderme, pharanshime, vascular systeme includes xylem and pheloem, were studied, measured and which are shown in different tabels.The results indicated that activity of PAL enzyme are altered during the plant development stage and changes of medicarpin content were correlated to the activity of PAL enzyme.The highest level of production of medicapin and activity of PAL enzyme have been observed during of growth in root.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Medicago sativa L
  • anatomy
  • Medicarpin
  • PAL enzyme
  • development

بررسی ساختار گیاه یونجه و سنجش مدیکارپین در مراحل مختلف تکوین 

فاطمه زرین کمر* و نسترن اسدی

تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی 

تاریخ دریافت: 9/10/93                تاریخ پذیرش: 27/12/95 

چکیده

یونجه با نام علمی Medicago sativa L. از خانواده باقلائیان، گیاهی است پایا و علوفه­ای، این گونه دارای ترکیبات متعدد فلاونوئیدی است. یکی از مهمترین این ترکیبات در گیاه یونجه، ایزوفلاونوئید مدیکارپین است که این ایزوفلاونوئید باعث فعال شدن ژنهای ریزوبیومی دخیل در فرایند تشکیل گرهگ می­شود. در این پژوهش میزان فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز (PAL) در مراحل مختلف تکوین گیاه در سه تکرار شامل مراحل جوانه­زنی، رویشی و زایشی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر و غلظت مدیکارپین توسط کرومانوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) اندازه­گیری شد. همچنین ساختار تشریحی – تکوین اندام‌های رویشی یونجه در مراحل مختلف نمو توسط میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان فعالیت آنزیم PAL در طی رشد رویشی و زایشی متغیر بوده، همچنین میزان غلظت مدیکارپین نیز در مراحل مختلف تکوین تفاوت داشت. نتایج این مطالعه به خوبی نشان داد که فعالیت آنزیم PAL با میزان غلظت مدیکارپین رابطه مستقیم دارد. به‌طوری‌که بیشترین میزان غلظت مدیکارپین و فعالیت آنزیم  PALدر مرحله رویشی در ریشه مشاهده شد.

واژه‌های کلیدی: مدیکارپین، تکوین، یونجه، آنزیم PAL

* نویسنده مسئول، تلفن: 02182884440  ،  پست الکترونیکی: zarinkamar@modares.ac.ir

مقدمه

 

گیاهان خانواده باقلائیان، منبع غنی از فلاونوئیدها هستند، اغلب فلاونوئیدهای خانواده باقلائیان ، ترکیبات فیتوآلکسینی هستند که دارای ساختمان ایزوفلاونوئید می­باشند (14). فنیل آلانین آمونیالیاز PAL)) اولین آنزیم کلیدی، مهم و تعیین‌کننده در ابتدای مسیر تولید فنیل پروپانوئید می­باشد. سوبسترای این آنزیم L- فنیل آلانین می باشد (15). عمل اصلی این آنزیم، آمین‌زدایی غیر اکسیداتیو از آمینو اسید L- فنیل آلانین و تبدیل آنها به یون آمونیوم و ترانس سینامیک اسید می­باشد (5). این ترکیب به‌عنوان اولین و مهمترین آنزیم در مسیر تولید ایزوفلاونوئید مدیکارپین شناخته شده است (14). یونجه از خانواده باقلائیان دارای ترکیبات متعدد فلاونوئیدی در ریشه و برگهای خود می­باشد. این ترکیبات معمولاً به فرمهای گلیکوزیده و مالونیل گلیکوزیده، ابتدا در ریشه‌های گیاه و بعد در اندام هوایی تجمع می‌یابد (15). یکی از مهمترین این ترکیبات در گیاه یونجه ایزوفلاونوئید مدیکارپین است که به فرم گلیکوزیله در واکوئل مرکزی سلول انباشته می­شود که اغلب به‌عنوان یک فیتوآلکسین شناخته می‌شود ( 7, 6). این ایزوفلاونوئید باعث فعال شدن ژنهای ریزوبیومی دخیل در فرایند تشکیل گرهگ می­شود (15). امروزه توجه زیادی به این فیتوآلکسین در سلامتی انسان می‌باشد. همچنین رژیم غذایی غنی از این ترکیبات با کاهش ابتلا به سرطان، پوکی استخوان، بیماریهای قلبی عروقی و بیماریهای مغزی همراه می­باشد (6). یونجه گیاهی است پایا و علوفه­ای که ارتفاع بوته در این گونه از 60 تا 100 سانتیمتر متغیر و نسبت به گرما و سرما مقاومت خوبی دارد. برگهای اصلی این گیاه به صورت سه برگچه­ای می­باشد. برگچه­ها بیضوی با حاشیه مضرس و کرک­دار بوده است. این گیاه دارای 2 نوع ریشه می­باشد: ریشه­های راست که در شرایط بافت مناسب خاک تا عمق  7 متر می­تواند در خاک نفوذ کند و ریشه­های جانبی که وظیفه استحکام گیاه در خاک و جذب آب و املاح را بر عهده دارند و گرهگهای تثبیت کننده ازت بر روی این ریشه­ها تشکیل می­شوند (10). گلهای آن به رنگ ارغوانی و بنفش تیره می­باشد و آرایش گل به صورت خوشه مرکب با دم­گلهای بسیار طویل که در آن 5 تا 50 گل ممکن است وجود داشته باشد. بیش از 90 درصد یونجه زراعی در ایران مربوط به این گونه می­باشد (4 و2).  این گونه، از گیاهان دارویی قدیم و مهم بوده و به‌دلیل خاصیت ضد التهاب، ضد میکروبی، ضد اسپاسم، تقویت کننده معده و بدن، کاهش قند خون و کلسترول و ضد تب مورد توجه می­باشد (5). هدف از این پژوهش بررسی فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز و سنجش غلظت مدیکارپین در ریشه، اندام هوایی و گل در مراحل مختلف رشد می­باشد. از بین مراحل نمو، سه مرحله جوانه­زنی، ساقه­دهی و گلدهی مورد توجه قرار گرفت. با توجه به بررسی‌های انجام شده اطلاعات کافی و دقیقی در مورد ساختار تشریحی – تکوینی گیاه  یونجه در دسترس نمی‌باشد. لذا بررسی ساختار تشریحی – تکوین اندامهای رویشی این گیاه با روشهای سلول – بافت شناسی از اهداف این پژوهش هستند.

مواد و روشها

بذر یونجه از مؤسسه بذر و نهال کرج تهیه شد، نوع رقم یونجه همدانی در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفت.  

برداشت نمونه‌های گیاهی: نمونه­های گیاهی در 3 مرحله تکوینی برداشت شدند. اولین برداشت در مرحله جوانه زنی (3 روز) و برداشت دوم در مرحله رویشی (20 روز ) و برداشت سوم در مرحله گلدهی (5 ماه بعد از کاشت بذرها) انجام شد. بعد از خارج کردن نمونه‌ها از خاک  اندام  هوایی از محل یقه از ریشه‌ها جدا شد. تعدادی از نمونه ها برای آنالیز آناتومی در فیکساتور مناسب ( الکل 30 درصد) قرار گرفتند. تعدادی دیگر از نمونه­ها برای انجام مطالعات بیوشیمیایی در آون به مدت 48 ساعت خشک شدند.

مطالعات ساختار تشریحی یونجه:  نمونه‌های گیاهی مورد نظر از بخشهای رویشی شامل ریشه، ساقه و برگ از سه مرحله تکوین انتخاب شدند. برای بررسی بخشهای رویشی نمونه‌ها در فیکساتور مناسب (مخلوط الکل- آب با نسبت 1 به 2) نگهداری شدند و پس از عبور برش‌ها از آب ژاول و استیک اسید و شستشو با آب مقطر، رنگ آمیزی مضاعف (سبز متیل- کارمن زاجی) انجام شد و برشها با میکروسکوپ نوری مدل  Olympusمدل H2Β  ساخت کشور ژاپن مورد بررسی و عکس‌برداری قرار گرفتند.

سنجش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز: سنجش فعالیت آنزیم فنیل آلانین آمونیالیاز با استفاده از سینامیک اسید تولید شده با روش  wangو همکاران در سال 2006 انجام شد. 1/0 گرم از بافت های خشک اندام هوایی، رویشی و گل به طور جداگانه در بافر پتاسیم فسفات 1/0 مولار با pH=8 روی یخ ساییده شده و بعد در g20000 به مدت 20 دقیقه در دمای 2-4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده گردید. به هر لوله آزمایش مقدار 200 میکرولیتر بافر پتاسیم فسفات ریخته و بعد 650 میکرولیتر فنیل آلانین 4 میلی مولار به آن اضافه گردید. نمونه­ها به مدت 1 ساعت در حمام آب گرم با دمای 37 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. پس از خارج نمودن نمونه­ها از حمام آب گرم به هر نمونه 50 میکرولیتر کلریدریک اسید 5 میلی مولار افزوده و تکان داده شد. سپس با 5 میلی‌لیتر اتیل استات، سه بار نمونه­ها شستشو داده شدند. سپس نمونه­ها در معرض هوا قرار داده شدند. به نمونه‌های خشک شده، NaOH یک مولار اضافه کرده و بعد جذب در طول موج 290 نانومتر اندازه­گیری شد (12،13). 

سنجش پروتئین:  به 100 میلی­لیتر از عصاره سانتریفیوژ شده یک میلی لیتر معرف برادفورد اضافه و بعد جذب آن در طول موج 595 نانومتر اندازه‌گیری شد. سنجش پروتئین با روش برادفورد و همکاران در سال 1976 انجام شد (9).

سنجش مدیکارپین در عصاره­های گیاهی: به‌منظور عصاره­گیری این ترکیبات با کمی تغییر از روش Ksouri و همکاران (2007) استفاده شد و محتوای مدیکارپین عصاره­ها با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) تعیین شد.

تحلیل HPLC : از دستگاه  HPLCمدل  knauer و ستون 81C فاز معکوس Lichrosorb به ابعاد (mm 250 ×4. 6) برای سنجش مدیکارپین استفاده شد. فاز متحرک شامل استونیتریل و اسید فسفریک و سرعت جریان 1 میلی­لیتر در دقیقه و مدت کروماتوگرافی 60 دقیقه بود. طیف‌ها در طول موج 283 نانومتر ثبت شدند و مساحت سطح هریک از پیکها محاسبه و منحنی استاندارد مدیکارپین رسم شد.

مطالعات آماری: آنالیز داده‌ها با استفاده از نرم افزار MSTATC و مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد انجام شد.

نتایج

مطالعه ساختار تشریحی یونجه:

ریشه: در ساختار نخستین ریشه در خارجی ترین لایه پوست اپیدرم دیده می­شود که محل تشکیل تارهای کشنده در ریشه است. درونی ترین لایه پوست آندودرم است و به‌خوبی مرز بین پوست و استوانه آوندی را مشخص می­کند. در استوانه آوندی خارجی­ترین لایه دایره محیطیه است که از یک لایه سلول پارانشیمی تشکیل شده است. دسته های چوب- آبکش به صورت متناوب قرار گرفته­اند. در این منطقه، قطب مولد چوب خارجی است، بنابراین تشکیل چوب برون زا است. تمایز آبکش رو به مرکز است و پروتوفلوئم (آبکش زودرس) به دایره محیطیه و متافلوئم (آبکش دیررس) به محور ریشه نزدیکتر است. با رفتن ریشه به ساختار پسین لایه کامبیوم که در حد فاصل آوند چوب و آبکش قرار دارد به سمت خارج آبکش پسین و به‌سمت داخل چوب پسین را می­سازد (11، 3) (شکل 1).

 

 

 


ساقه: در برش عرضی ساقه در ساختار پسین در خارجی ترین لایه سلول های اپیدرم حالت مکعبی دارند که مشابه بسیاری از دولپه­هاست. در زیر اپیدرم دولایه سلول پارانشیمی و پس از آن سلول های بافت کلانشیم که سلول­هایی با دیواره­های ضخیم هستند و بافت مقاوم را تشکیل می­دهند دیده می­شود. بافت کلانشیم در این گیاه از نوع کلانشیم گوشه­دار است. لایه بعدی سلول های پارانشیم پوست، در چند ردیف با دیواره نازک و قطر کم و بیش یکسان و چند وجهی هستند. در زیر پارانشیم لایه فیبر اسکرانشیم در داخلی ترین لایه پوست و حاشیه استوانه مرکزی، با سلول های دارای دیواره ضخیم چوبی وجود دارد که عمل اصلی آن استحکام بخشیدن و محافظت از گیاه است. در استوانه مرکزی دسته­های آوندی و مغز دیده می­شود. کامبیوم معمولا دو نوع سلول دارد: سلول بنیادی دوکی‌شکل که عناصر چوب و آبکش از آن به وجود می­آیند و سلول بنیادی اشعه که اشعه آوندی را می­سازد. استوانه کامبیومی بین چوب و آبکش اولیه نمو می­یابد و چوب ثانویه را به صورت رو به مرکز و آبکش ثانویه را به صورت گریز از مرکز می­سازد. متاگزیلم با اندازه بزرگتر و در سمت آوند آبکش و پروتوگزیلم با اندازه کوچکتر در سمت مغز دیده می­شوند. اشعه آوندی نسبتأ ضخیم است و سبب قطع شدن حلقه‌های چوب و آبکش می‌شود. در قسمت مرکزی هم سلول‌های پارانشیمی مغز دیده می­شود (1،2).  

برگ: سلول‌های اپیدرمی دارای دیواره ضخیم و چهار وجهی هستند. سلول‌های ایپدرم تحتانی نامنظم‌تر از اپیدرم فوقانی دیده می­شوند. کوتیکول سطح فوقانی ضخیم‌تر از سطح تحتانی می‌باشد. روزنه در هر دو سطح تحتانی و فوقانی همسطح سلول اپیدرم می­باشد. بافت پارانشیم مزوفیل شامل دو ردیف پارانشیم نردبانی و یک ردیف پارانشیم اسفنجی است ((dorsiventral. آوند مرکزی یک طرفه (collateral) است که آوند چوب بالا و آبکش پائین قراردارد (شکل 3). 

گرهگ: براساس نتایج حاصل از اندازه­گیری‌های سلولی قسمت­های مختلف گرهگ در دو مرحله ساقه دهی و گلدهی مشخص شد (شکل 4). با افزایش رشد گیاه، قطر گرهک و بافت باکتروئید افزایش می‌یابد. اما در مرحله گلدهی کاهش معنی­داری در قطر گرهگ و بافت باکتروئید مشاهده شد. همچنین مشخص شد که با افزایش غلظت مدیکارپین، قطر گرهگ و تعداد گرهگ‌ها در ریشه نیز افزایش یافته بود. به‌طوری‌که بیشترین غلظت مدیکارپین و قطر گرهگ در مرحله رویشی مشاهده شد (جدول 1، شکل 2). 


  

 

 

 

A                                                         B

شکل 4- برش عرضی از گرهک: (A) بافت باکتروئید;  B، سیمای عمومی 


سنجش مدیکارپین و اندازه‌گیری میزان فعالیت PAL در مراحل مختلف تکوین: بررسی میزان فعالیت آنزیم  PAL با استفاده از دستگاه HPLC در مراحل مختلف تکوین نشان داد از مرحله جوانه­زنی تا مرحله گلدهی میزان فعالیت آنزیم PAL در ریشه و اندام هوایی  به ترتیب  ( pr -1  mol CA mg -1µ31/0)  (pr -1  mol CA mg -1µ22/0) افزایش می­یابد. به طوری که بیشترین میزان فعالیت آنزیم PAL  زمانی در گیاه مشاهده می­شود که گیاه در مرحله رویشی قرار دارد. بنابراین می توان گفت سن گیاه بر میزان فعالیت آنزیم تأثیر گذاشته است (جدول 2).

جدول 1-  مقایسه میانگین صفات آناتومیکی حاصل از برش عرضی  گرهگ در ریشه  در سه مرحله تکوین

 

    بافت

مراحل تکوین

بافت باکتروئید (mµ)

قطرگرهگ

(µm)

تعدادگرهگ

 

جوانه رنی

-

-

-

 

ساقه‌دهی

27/130c

22/196a

120

 

گلدهی

64/112d

92/176b

105

بحث

آنالیز مدیکارپین نشان داد که نوع بافت و مرحله نمو گیاه نیز می­تواند تولید مدیکارپین را تحت تأثیر قرار دهد. به‌طوری‌که از مرحله جوانه­زنی تا مرحله رویشی میزان مدیکارپین در گیاه رو به افزایش بوده، این افزایش از نظر آماری معنی دار بود (جدول 2). اما در مرحله زایشی  غلظت مدیکارپین در گیاه کاهش یافته است. مکانیسم احتمالی افزایش غلظت مدیکارپین در ریشه می­تواند به دلیل افزایش فعالیت آنزیم   PALدر ریشه باشد. به‌طوری‌که بیشترین غلظت مدیکارپین در  ریشه در مرحله ساقه‌دهی وجود دارد  (nmol g -1 FW 1/7).

 

جدول 2- سنجش مدیکارپین و اندازه‌‌‌ گیری فعالیت آنزیم PAL در سه مرحله نمو

       
 

فعالیت آنزیم PAL

 

غلظت مدیکارپین

 

µmol CA mg -1pr-1

 

nmol gr-1 FW

       

 

 

 

 

ریشه

     

مرحله جوانه زنی

0+90/0d

 

c3/0+1/2

مرحله ساقه دهی

04/0+31/0a

 

0/4+1/7a

مرحله گلدهی

01/0+18/0 c

 

0/2+2/3 b

       

اندام هوایی

     

مرحله جوانه نی

09/0+40/0d

 

0+1/0e

مرحله ساقه دهی

01/0+22/0 b

 

3/0+0/1d

مرحله گلدهی

01/0+22/0c

 

0+8/0e

       

گل

03/0+660/0d

 

0+0e

       

حروف متفاوت در هر ستون نشان دهنده اختلاف معنی‌دار می باشد(P<0.01).

 

Dakora و همکاران در سال 1993 اظهار داشتند که مدیکارپین در فعال شدن ژنهای ریزوبیومی دخیل در تشکیل گرهگ نقش دارد. به‌طوری‌که افزایش این فیتوآلکسین در افزایش نفوذ باکتری به گرهگ، قطر گرهگ و عملکرد گیاه تأثیر بسزایی دارد (10).  

آنزیم PAL اولین آنزیم در مسیر متابولیسمی مدیکارپین می­باشد، به‌طوری‌که افزایش فعالیت مذکور ممکن است منجر به افزایش بیوسنتز ایزوفلاونوئید مدیکارپین شده باشد. نتایج حاصل از سنجش مدیکارپین با نتایج Tsiri و همکاران در سال 2009 مطابقت دارد (16 و 17).

 نتایج این مطالعه به خوبی نشان داد که میزان فعالیت آنزیم PAL، با تجمع مدیکارپین و سن گیاه رابطه مستقیم دارد. بنابراین به احتمالی می توان گفت که آنزیم PAL در تنظیم مقدار مدیکارپین نقش داشته است.

1- رضائی، عبدالمجید.1372، به نژادی یونجه. انتشارات مرکز نشردانشگاهی تهران. چاپ اول. 233ص.

2- فان. آ. ترجمه آذرنوش جعفری. 1387، آناتومی گیاهی، انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد.

3- کریمی، هادی. 1369،  یونجه. مرکز نشر دانشگاهی تهران. 371ص.

4- صالحی سورمقی، محمد حسین. 1390، گیاهان داروئی وگیاه درمانی. انتشارات دانشگاه تهران.

5- قلیچ سیما ، زرین کمر فاطمه ، نیکنام وحید. 1394، بررسی میزان انباشتگی سرب و تأثیر آن بر فعالیت آنزیم پراکسیداز، محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در مرحله جوانه زنی در گیاه یونجه، مجله پژوهشهای گیاهی(مجله زیست شناسی ایران) (1)28:174 -164.

6- آلبوغبیش نسا، زرین کمر فاطمه. 1393، بررسی تغییرات ساختاری در اندامهای زایشی بابونه آلمانی ناشی از تنش سرب . مجله پژوهشهای گیاهی (مجله زیست شناسی ایران )(3)27: 345-336.

 

7- Akoi, T., Akashi, T., Ayabe, Sh; 2000. Flavonoid of Leguminous Plant: Structure, biological activity and biosynthesis. Journal of Plant Research. 113:475-488.

8- Boonyuen, C., Wangkarn, S., Suntornwat, O., Chaisuksant, R; 2009. Capacity and phenolic content of mimusops elengi fruit extract. Kasetsart Journal of Natural Sciences. 43:21-27.

9-Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein dye binding. Analytical Biochemistry.72: 248-254.

10-Dakora, F.D., Joseph, C.M., Phillips, D.A; 1993. Alfalfa (Medicago sativa L.) root exudates contain isoflvonoid in the presence of Rhizobium Melilotus. Plant Physiology. 101:819-824.

11-Hakl, J., Fuksa, P., Maskova, k; Basu P.S; 2011. The development of lucern root morphology traits under high initial stand density within a seven year period. Plant Soil Environ. 57: 81-87.

12-Ksouri, R; Mediche, W;   Dabez, A; Falleh, M; Grignon and Abdelly, C; 2007. Salinity effect on polyphenol content and antioxidant activities in leaves of the halophyte cakile maritime. Plant Physiology and Biochemistry. 45:244-248.

13- Markovic, J., Radovic, J., Lugic, Z., Sokolovic D; 2007. The effect of development stage on chemical composition of alfalfa leaf and steam.  Biotechnology in Animal Husbandry. 23: 383-388.

14- Marinova, D., Ribarava, F., Atanassava, M; 2005. Total phenolic and total flavonoid in ulgarion fruits and vegetables. J. Univ. chemistry Technology Metal. 40:225-260.

15- Matsouka, I., Beri, D., Chinou, I., Haralampidis, K., Spyropoulos, C; 2011. Metals and selenium induce medicarpin accumulation and execration from the roots of fenugreek seedling: a potential detoxification mechanism. Plant soil, Published online.

16-Tsiri, D., Chinou I., Haralampidis, K., Spyropoulos, C; 2009. The origin of copper induced medicarpin accumulation and it secretion from roots of young fenugreek seedling are regulated copper concentration. Plant Science, 176: 376-374.

17- Wang; 2006.PALgene expression and activity. Advanced studies in Biology, 5:.9, 403-412.